Beskriver vi hvordan mikro- og photomanipulation teknikker som FRAP og photoactivation aktiverer fastsettelse av motilitet parametere og spatiotemporal dynamikken i proteiner i migrere celler. Eksperimentell readouts inkluderer subcellular dynamikk og omsetning av motilitet regulatorer eller underliggende begrepsordbok cytoskeleton.
Undersøke spatiotemporal dynamikken i proteiner kan avsløre funksjonell betydning i ulike sammenhenger. I denne artikkelen er det diskutert hvordan fluorescerende utvinning etter photobleaching (FRAP) og photoactivation teknikker kan brukes til å studere spatiotemporal dynamikken i proteiner subcellular steder. Vi viser også hvordan disse teknikkene aktiverer enkelt bestemmelse av ulike parametere knyttet til utgangen cellen cytoskjelett regulering og celle motilitet. Videre beskrives microinjection celler i tillegg som et alternativ behandling (potensielt foregående eller utfyller de nevnte photomanipulation teknikkene) utløse umiddelbar effektene av translocated proteiner på cellen morfologi og funksjon. Micromanipulation som protein injeksjon eller lokal påføring av plasma membran-permeable narkotika eller cellen cytoskjelett hemmere kan tjene som kraftig verktøy registrere umiddelbare konsekvenser for en gitt behandling på cellen oppførsel på enkelt celle og subcellular nivå. Dette er eksemplifisert her ved umiddelbar induksjon av lamellipodial celle kanten protrusion av injeksjon av rekombinant Rac1 protein, som etablerte et kvart århundre siden. I tillegg gir vi en protokoll for å bestemme omsetningen av forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP)-VASP, en utgangen filament polymerase fremtredende samler på lamellipodial tips av B16-F1 celler, sysselsetter FRAP og inkludert knyttet data analyse og montering kurve. Vi presenterer også retningslinjer for å estimere antallet lamellipodial utgangen nettverk polymerisasjon, som eksemplifisert ved celler som uttrykker EGFP-merket β-utgangen. Til slutt, instruksjoner er gitt å undersøke utbredelsen av utgangen monomer mobilitet i cellen cytoplasma, etterfulgt av utgangen innlemmelse i områder av rask filament montering, som tips av utstikkende lamellipodia, med photoactivation tilnærminger. Ingen av disse protokollene er begrenset til komponenter eller regulatorer av utgangen cytoskjelett, men kan enkelt utvides for å utforske i analoge mote spatiotemporal dynamikken og funksjon av proteiner i ulike ulike subcellular strukturer eller funksjonelle sammenhenger.
Overvåking spatiotemporal dynamikken i proteiner og andre molekyler i levende celler har blitt et uunnværlig verktøy på mange felt i cellen og molekylærbiologi. Avanserte fluorescens mikroskopi teknikker inkludert fluorescens resonans energioverføring (bånd) og bånd-fluorescens levetid imaging (bånd-FLIM) eller FRAP fluorescens tap i photobleaching (vende) og photoactivation samt mange andre tillate for timelige og romlig sporing av protein-protein interaksjoner, conformational endringer, samt bestemme the kinetics av diffusjon og lokalisering av ulike proteiner i cellen1,2. FRAP og photoactivation teknikker, spesielt gjelder mye for å undersøke regulatorer av utgangen cytoskjelett og celle migrasjon. Disse teknikkene kan brukes alene eller i kombinasjon med ekstra micromanipulation teknikker som microinjection3, og involverer uttrykk for fluorescently-merket proteiner. De tillater estimering av the kinetics av protein tilknytning til utgangen-rike strukturer involvert i celle migrasjon, for eksempel filopodia eller lamellipodia, omsetningen av proteiner i fokal adhesjon4, eller forgrenet begrepsordbok nettverk5. De kan også bestemme lamellipodial utgangen polymerisasjon priser, vurdering av spredningen av monomerisk utgangen innen stoffer frekvensen av subcellular utgangen monomer translokasjon til polymerizing utgangen filamenter i stikker lamellipodia6, og andre parametere.
FRAP er en metode for å visualisere og kvantifisere mobilitet av proteiner i en levende celle, opprinnelig utviklet i 1970 av Axelrod7. Et område av interesse (ROI) i en celle, med fluorescently-merket proteiner, er transiently utsatt for en laser av høy intensitet, tilstrekkelig til å forårsake bleking av fluorophore molekyler stede i denne regionen under en gitt kort tidsperiode. Den ubleket, fluorescently merket proteiner ligger utenfor Avkastningen under bleking, diffus og infiltrere bleket regionen avhengig av deres spatiotemporal dynamikk, forårsaker forskyvning av photobleached molekyler over tid. Fluorescens utvinning i bleket regioner er avhengig av forskjellige faktorer, blant annet størrelsen og hastigheten av spredningen av et bestemt molekyl, og selvfølgelig sin omløpshastighet innenfor den antatte tilknyttede bleket struktur. Dermed løselig proteiner vil megle utvinning av fluorescens innen bleket Avkastningen raskt gjennom diffusjon, mens proteiner tett knyttet strukturer, for eksempel fokal adhesjon, vil ha lengre omsetning tid, som deres fluorescens utvinning vil avhenge både på spredningen av løselige brøkdel av protein og dissosiasjon-samarbeid kinetics i struktur-assosiert brøken. Fluorescens utvinning er vanligvis ervervet og kvantifisert til første nivå av pre blekemiddel intensiteten av fluorescens er nådd. Men oppstår dette ikke hvis en del av den første fluorescens tilhører den såkalte immobile brøken, som ikke kan fornyes ved diffusjon eller er fylle til meget langsom priser i forhold til fleste av molekylene bestående av mobile brøk. For å bestemme frekvensen av protein omsetning, genereres FRAP kurver som representerer omfanget av fluorescens utvinning over tid. Fra disse utvinning kurver, kan gjennomsnittlig halv-ganger av protein utvinning beregnes. Oppretter kurve passer gjennomsnittlig FRAP dataene, og dermed matematiske analyser, er det også mulig å avgjøre om den gjennomsnittlige omløpshastighet av mobile brøkdel er sammensatt av en homogen befolkningen av molekyler, eller om det er sammensatt av to eller flere subpopulasjoner av molekyler snu på hvordan. I tillegg til å estimere protein omsetning PR av kvantitative metoder, kan sporing utvinning av photobleached områder i lamellipodia også tillate for nøyaktig kvantifisering av lamellipodial motilitet parametre som retrograd flyt, protrusion, og utgangen polymerisasjon priser. Dermed utgjør FRAP et allsidig verktøy som skal brukes for å vurdere ulike parametere i strukturer av levende celler.
Photoactivation er en metode som brukes til å spore spredningen og mobilitet av proteiner eller molekyler som stammer fra et angitt mobilnettet sted. Teknikken bruker, for eksempel en variant av vill-type grønne fluorescerende protein (GFP), opprinnelig utviklet av Patterson og Lippincott-Schwartz8, som er mutert i en måte som tillater sine fluorescens økes svært ved eksponering til ultrafiolett (UV) lys (rundt 400 nm; her, 405 nm). Som beskrevet av Patterson et al., vill-type GFP chromophores eksisterer som en blandet befolkning på nøytral fenoler og anionic phenolates, som produserer en stor absorbansen peak på ca 397 nm og en mindre på 475 nm, henholdsvis. Ved bestråling av protein med UV lys gjennomgår befolkningen photoconversion, skiftende mot skjemaet anionic. Når opphisset av 488 nm, photoconverted/photoactivated protein utstillinger en 3-fold økning i fluorescens, utilstrekkelig i praksis for skille mellom aktivert og ingen-aktivert GFP på grunn av den høye indre bakgrunn fluorescensen. Imidlertid er en nedgang i bakgrunnen intensitet oppnådd ved å innføre en enkelt aminosyre mutasjon i GFP sekvensen (histidin substitusjon på posisjon 203). Den resulterende T203H mutant, også kjent som photoactivatable-GFP (PA-GFP) er preget av en betydelig reduksjon i absorbansen i mindre toppen, som ved bestråling med UV-lys er økt nesten 100-fold når senere opphisset av 488 nm lys. Derfor er overuttrykte PA-GFP-merket proteiner en utbredt tilnærming, som tillater fastsetting av diffusjon og motilitet av molekyler i celler. Vi har tidligere brukt PA-GFP-merket utgangen for å bestemme frekvensen av spredning av utgangen monomerer fra cytosolic områder, slik at ikke bare utforskning av mobilitet i stoffer, men også timepris innlemmelse i den utstikkende lamellipodial utgangen nettverk6. Mer nylig litteratur beskriver også roman, foto-cabriolet proteiner som kan i prinsippet brukes på en tilsvarende måte, men skjuler den potensielle fordelen skal være synlige før Foto-konvertering. Eksempler for denne gruppen av fluorescerende proteiner er Dendra2 og mEos29,10,11,12.
I denne artikkelen forklarer vi metodikk microinjecting celler med proteiner. Videre forklarer vi hvordan denne teknikken kan kombineres med FRAP, ved photobleaching proteiner involvert i utgangen cytoskjelett regulering og motilitet, og hvordan FRAP kurver og pause for gjenoppretting av mobile fraksjoner kan utledes. I tillegg gir vi et eksempel på hvordan FRAP teknikken kan brukes til å bestemme begrepsordbok polymerisasjon priser lamellipodial nettverk. Vi tilbyr også instruksjoner og tips om hvordan du utfører photoactivation eksperimenter, som kan brukes til å bestemme cytosolic mobilitet av monomerisk utgangen og priser til utgangen innlemmelse i lamellipodia. Disse teknikkene, selvfølgelig, er ikke bare begrenset til utgangen cytoskjelett komponenter, men potensielt nødvendig moderat tilpasning eller optimalisering, kan bli mye brukt til andre celletyper, eller for å undersøke ulike proteiner, strukturer, og parametere.
Her diskuterer vi avgjørende skritt i teknikkene som beskrives i denne artikkelen, og hvordan de kan optimaliseres for programmet i ulike eksperimentelle forhold.
Microinjection er en metode som kan brukes for å overvåke i cellene den øyeblikkelige effektene fra introdusere eksogene proteiner, hemmere eller narkotika. Det kan være spesielt fordelaktig for å bestemme funksjoner proteinene i vanskelig å transfect celletyper eller i situasjoner når langsiktige uttrykk ikke er ønsket. Det må bemerkes at overlevelse av visse celletyper varierer avhengig av den ekstracellulære matrisen de er seeded på. Mest endothelial, epithelial eller fibroblast-lignende celletyper, selv små liker fisk keratocytes (se Dang et al. 21 og Anderson og tvers22) kan med hell injiseres. Det finnes imidlertid unntak, for eksempel B16-F1 celler seeded på laminin, som utgjør en utmerket modellsystem av celle migrasjon, men er ikke kompatible med injeksjon på denne typen undergrunnen av ukjent grunn. For NIH3T3 fibroblast celler utfører vi rutinemessig injeksjoner på fibronectin undergrunnen og ekstra photomanipulation teknikker som FRAP (selv med photoactivation, vises B16-F1 celler her) like godt kan utføres i disse fibroblaster (se f.eks Köstler et al. 3). det må også betraktes som ulike proteiner, deres funksjonelle egenskaper og eksperimentet mål, kan ta forskjellige mengder tid å forårsake endringer, varierende fra sekunder til timer. En fordel med teknikken er at dosen/konsentrasjonen av eksogene agent kan kontrolleres mer nøyaktig på enkeltcelle nivå enn f.eksved plasmider transfection. I tillegg er fluorescerende merking av et protein ikke en nødvendighet for å garantere sin tilstedeværelse i cellen, som kan øke fleksibiliteten hvis samtidige flerkanals visualisering av andre fluorescently-merket proteiner. Microinjection kan være spesielt nyttig for å analysere øyeblikkelige effektene av spesifikke proteiner eller protein blandinger på dynamiske endringer på celle morfologi eller cytoskeleton (f.eks Dang et al. 21 for et eksempel på øyeblikkelige effekter på overføring av den Arp2/3 komplekse inhibitor Arpin). En ulempe ved teknikken er dens invasiveness, som kan forårsake celle skade eller påvirke celle morfologi. Derfor overvåker en viktig faktor når du utfører microinjections celle levedyktighet. Metoden innført her er avhengig av manuell manipulasjon. Betingelser testet med vellykket injeksjoner, som fibroblaster vokser på fibronectin undergrunnen, kan manuell injeksjon protokollen beskrevet her en nær 100% suksessrate; Dette er viktig når kombinere dette med sofistikert og tidkrevende oppfølgingseksperimenter inkludert video mikroskopi eller FRAP, som publisert tidligere3. Dette utelukker ikke at noen ganger, enkeltceller kan lide av en microinjection hendelse, som trygt kan gjenkjennes av plutselige forandringer av kontrast til både kjernen og cytoplasma, etterfulgt av cellen kanten retraksjon. Slike sjeldne eksperimentelle tilfeller er ekskludert og derfor ikke ansett for videre analyser.
Men en halv-automatiske tilnærming er også vanlig, for eksempel ansette rask (< 300 ms) maskin-kontrollerte nål redusere sammenfallende med injeksjon press økningen, slik at nålen har bare skal plasseres over hver celle før respektive injeksjon. Suksessrate på halv-automatiske injeksjoner er per definisjon lavere enn den manuelle fremgangsmåten beskrevet ovenfor, bare fordi den er optimalisert for hastighet, etterfulgt av analyse av flere celler som har overlevd denne behandlingen; dermed stole den ikke på vellykket injeksjon av en enkeltcelle. Derfor, i motsetning til én celle analyse, halv-automatiske injeksjoner er bedre egnet for å analysere injeksjon effekter av flere hundre celler, f.eks av video mikroskopi ved lav forstørrelse eller cellen fiksering og flekker. Uansett detaljert tilnærming ansatt, microinjection utgjør ikke en end-point analyse, men kan kombineres med en rekke teknikker, inkludert FRAP eller photoactivation3.
Når protein omløpshastighet av FRAP, intensiteten av laseren må være optimalisert, avhengig av mikroskopet oppsett og bildebehandling forholdene (forstørrelse, mål, etc., og celle type, strukturen og fluorescerende protein for photobleaching). Merk at på optimal laser makt, effektiv bleking er kombinert med minst mulig photodamage, for å unngå krymping eller fullføre tilbakekalling av strukturen under analyse (f.eks lamellipodia eller filopodia) eller med skade på cellenivå. Ideelt sett skal minst 70 – 80% av bleking effektivitet oppnås, men fullstendig bleking kan bli hindret av ekstremt rask omsetning av protein, som tilfellet noe over 50% kan også være akseptabelt. Optimal bleking effekt for en gitt struktur og fluorescerende fargestoff bør testes eksperimentelt, starter fra en lav laser makt etterfulgt av sin gradvis økning. Selvfølgelig noen fluorescerende farge kan per definisjon være bleket med laserlys nær sin topp på eksitasjon (488 nm for brukte grønne fargestoffer som FITC eller EGFP). Men lasere med kortere bølgelengde, som nær-UV lasere, leverer høyere makter og kan dermed også brukes for effektiv bleking av brukte fargestoffer. Vi rutinemessig bruker en 405 nm diode laser (120 mW) for bleking av både EGFP og røde fluorescerende fargestoffer (for eksempel mCherry), men med litt lavere effektivitet ved den sistnevnte (data ikke vist). Som 405 nm-dioden kan også brukes til photoactivation av PA-GFP (se nedenfor), endows dette systemet med maksimal fleksibilitet.
For B16-F1 celle strukturer og fluorescerende proteiner photobleached her, ble 405 nm-laser makt mellom 65-100 mW brukt. Når analysere et photobleached område, er det viktig å vurdere om gitt strukturen er bevart i sin opprinnelige form over analysen tidsperiode. For eksempel når analysere omsetning av proteiner på lamellipodia tips, utvises om Bøyningen på lamellipodia er betydelig endret over tid, som endringer i krumning kan føre til unøyaktige resultater hvis regionen/konturen analysert ikke fullt omfatte hele strukturen i hver målte ramme. I tillegg bør det bemerkes at pakker som er innebygd i lamellipodia, som microspikes, kan forårsake avvik i fluorescens intensitet. Som illustrert i figur 2b (hvit pil i 9 s tidsramme), en microspike-lignende struktur ligger ved målt photobleached regionen, men forblir utenfor gjennom hele mål, og dermed forårsaker ikke noen unøyaktighet. Analyse av protein omsetning er viktige betraktninger ved å velge plassering og størrelse på analysert regioner at deres fluorescens over tid ikke bør bli betydelig påvirket av endringer i celle morfologi eller faktorer enn hardt å unngå Kjøp photobleaching. For eksempel må strukturer gir betydelig kvantitative bidrag til analysert strukturen ikke flytte ut av regionen målt under analyse; i tillegg bør ubeslektet, fluorescerende enheter som vesicula strukturer som tiltrekker protein ikke angi feltet rundt under analyse. For å bestemme frekvensen av lamellipodial utgangen polymerisasjon, bør utvises at analyseres ikke trekke eller ruffling (dvs. oppover folding) lamellipodia, som dette vil sterkt påvirke nøyaktigheten av resultatet. I tillegg tilbakekalling av lamellipodial regioner kan vises som Hurtig bakover translokasjon, kan føre til overvurdering av andelen lamellipodial utgangen polymerisasjon. Tas er avstanden intracellulær normalisering regioner (tatt som referanse stillinger for korrigering av oppkjøpet photobleaching) fra den faktiske posisjonen til photobleaching, som bør være store nok til å unngå direkte innflytelse av photobleached området.
Når optimale forhold for photoactivation av PA-GFP-merket konstruerer, bør forsiktighet utvises for å unngå umiddelbar bleking under photoactivation. I vårt arbeid, de beste resultatene ble oppnådd med laser krefter 5 – 10 ganger lavere enn normalt ansatt for bleking av EGFP. For bildeopptak photoactivated molekyler, skal eksponeringstid og tidsintervallet mellom rammer være optimalisert med tanke på størrelsen på regioner og strukturer for å være photoactivated og analysert, og potensielle mobilitet av photoactivated proteiner til andre subcellular steder. Som for alle typer fluorescens bildebehandling er vedlikehold av cellen levedyktighet avgjørende for å få fysiologisk relevante resultater.
I prinsippet grønn til rød photoconversion fluorescerende proteiner som mEos eller Dronpa varianter12 utgjør en like kraftig metode for følgende dynamics og omsetning på subcellular strukturer som lamellipodium (se f.eks Burnette et al. 23). fordelen av sistnevnte metoden i motsetning til PA-GFP ville være muligheten til å følge protein dynamics før og etter konvertering med to forskjellige farger, uten behovet å co express en ekstra røde fluorescerende protein. Imidlertid våre foreløpige eksperimenter skyldtes omfanget av kontrast endring og intensitet av fluorescerende signal oppnådd ved photoactivation av PA-GFP større sammenlignet med photoconverted sonder, kanskje de overlegne spectral funksjonene av grønt mot rød fluorescerende sonder (data ikke vist). I alle fall publisert detaljerte studier begrepsordbok filament omsetning i celle-edge utstikkende deler som lamellipodia eller Vaccinia forårsaket av virus begrepsordbok haler så langt bare med PA-GFP derivater5,6,24.
Når du vurderer hvilket celle område å analysere følgende photoactivation, faktorer bør tas i betraktning, som drøftes med spesifikke eksempelet som vises her (innlemmelse av utgangen monomerer ytterst cellen ved aktivering i stoffer), men kan sikkert være extrapolated til ulike analoge vitenskapelige problemer. Først når måle frekvensen av lamellipodial innlemmelse av cytosolically photoactivated proteiner, for eksempel i forskjellige eksperimentelle forhold (som vist i Dimchev et al. 6), størrelser av cytosolic regioner og deres avstander lamellipodial kantene skal være sammenlignbare mellom eksperimentelle grupper. Det er også viktig å vurdere som photoactivating cytosolic regioner, celle tykkelsen er større i posisjoner nærmere til kjernen. Aktivere tykkere mobilnettet regioner kan resultere i høyere mengder aktivert proteiner, gitt at fordelingen av protein aktiveres er homogenously fordelt på stoffer. Endelig kan uttrykk nivåer av proteinet aktiveres sikkert være svært variabel i enkeltceller. Fordi alle disse hensynene på variasjon er det avgjørende å sammenligne innlemmelse nivåer av cytosolically aktivert proteiner andre steder i cellen i forhold til den totale fluorescensen oppnådd ved aktivering i bestemte regioner.
Vi har beskrevet hvordan microinjection kan brukes som et verktøy for å undersøke effekten av proteiner på celle morfologi og har eksemplifisert dette ved å demonstrere potente induksjon av lamellipodial strukturer i NIH3T3 fibroblast celler microinjected med den små GTPase Rac1. Vi har tidligere brukt denne teknikken for å forstyrre Arp2/3-funksjonen i celler microinjected med C-terminalen WCA domenet Scar/bølge3. Ulike parametere i microinjected celler kan analyseres av andre analyser, for eksempel FRAP eller photoactivation. Vi har beskrevet hvordan FRAP og photoactivation kan benyttes for å undersøke subcellular dynamikk og mobilitet av utgangen monomerer. FRAP har blitt brukt av vår gruppe tidligere5 å undersøke omsetningen av proteiner lokalisere til lamellipodia, som VASP, Abi, cortactin, cofilin, og capping protein eller Klargjørende omsetningen av komponenter i fokal adhesjon i nærvær og fravær av Rac signalering4. Videre måle begrepsordbok polymerisasjon priser kan oppnås ved photobleaching EGFP-merket β-utgangen5, men alternative metoder finnes. Sporing fluorescerende inhomogeneities sett av levende celle imaging-kompatible sonder merking mobilnettet begrepsordbok filamenter, som Lifeact25, kan også være ansatt6,26. Fordelen er at overuttrykte β-utgangen kan unngås, som kan øke celle kanten protrusion og migrasjon, og dermed potensielt forstyrrer den bestemte analysen eller eksperimentelle spørsmål (se f.eks webpakke et al. 26; Peckham et al. 27). men en distinkt ulempe av Lifeact sonden utgjør rapid/på kinetics av binding til utgangen filamenter, slik at bleking begrepsordbok filament strukturer merket av Lifeact i cellene gir informasjon på sonde omsetningen, men ikke omsetningen av utgangen filamenter, som binder det25. Sporing av fluorescens inhomogeneities ansatt tidligere6,26 gir en praktisk kompromiss, mye lik brukte sporing av fluorescens flekker innlemmet i trådformede cellen cytoskjelett strukturer (se f.eks laks og Waterman28), men kanskje ikke så rett frem til bruk og så presis som FRAP EGFP-merket F-utgangen strukturer. Photoactivation har blitt brukt av oss til å estimere antallet monomerisk utgangen inkorporering utstående lamellipodia, i tillegg til sin mobilitet gjennom stoffer i sammenheng med eksperimentelt innstilt cytosolic F-utgangen nivåene6. Teknikken er nyttig når undersøke mobilitet og distribusjon av proteiner avledet fra relativt store områder, for eksempel cytosolic regioner. Imidlertid avledet undersøke fordelingen av proteiner fra relativt liten photoactivated strukturer; f.eks veksten kjeglene kan være utfordrende på grunn av lavt antall fluorescerende molekyler aktivert, svake signaler, og dermed mangel på sensitivitet. Mulige alternativ teknikker for å photoactivation eller photoconversion av fluorescens (se ovenfor) kan inneholde inverse FRAP, som bygger på photobleaching hele cellen unntatt Avkastningen, etterfulgt av sporing mobilitet fluorescerende molekyler unna Denne regionen. Teknikken krever ikke overexpressing photoactivatable versjoner av proteiner, men alltid innebærer eksponering for en uvanlig høy dose av laser makt, potensielt forårsake uønskede bivirkninger som photodamage.
Tydelig, photoactivation og FRAP kan ikke skille om proteiner er bevegelige monomerer, dimers eller selv små oligomers, og om de flytter sammen med ekstra binding partnere. Informasjon av denne typen kan fås i stedet fra fluorescens korrelasjon spektroskopi teknikker29 eller alternativt FLIM-bånd30. Likevel utgjør FRAP og photoactivation enkle metoder for å vurdere direkte lokale og globale protein dynamikk i celler, uavhengig av protein av interesse, subcellular plassering eller celle type studerte.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til tysk Research Foundation (DFG) for økonomisk støtte (grant Nr. RO2414/5-1 til KR).
B16-F1 mouse skin melanoma cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-6323 | |
NIH-3T3 cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-1658 | |
DMEM 4.5g/L glucose | Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany | 41965-039 | |
Ham’s F-12 medium | Sigma-Aldrich | N8641 | |
Fetal calf serum (FCS) | PAA Laboratories, Linz, Austria | A15-102 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, Germany | F7524 | Lot054M3396 |
MEM Non essential amino acids | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11140035 | |
L-Glumatine 200mM (100x) | Life Technolgies | 25030-024 | |
Pen-Strep 5000 U/mL | Life technologies | 15070063 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11360-039 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | |
Laminin coating buffer | Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl | ||
Fibronectin from human plasma | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11 051 407 001 | |
Jetpei | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 101-10N | |
JetPei buffer | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 702-50 | 150mM NaCl |
PA-GFP-actin plasmid DNA | described in Koestler et al.2008 | ||
pEGFP-actin plasmid DNA | Clontech, Mountain View, CA, USA | ||
Rac1 protein for microinjection | Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection | ||
Microinjection buffer | Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT | ||
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable | Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany | D1864 | |
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1 | Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany | 1001/15 | |
Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242 956 003 | |
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 930000035 | |
Silicone Grease | ACC Silicones, Bridgewater, England | SGM494 | |
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner instruments | RC-26 | |
Automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-324B | |
Microscope: Axio Observer | Carl Zeiss, Jena, Germany | ||
CoolSnap-HQ2 camera | Photometrics, Tucson, AZ | ||
Lambda DG4 light source | Sutter Instrucment, Novato, CA | ||
Laser source | Visitron Systems | ||
Eppendorf FemtoJet microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | With built-in compressor for pressure supply | |
Nikon Narishige Micromanipulator system | Nikon Instruments, Japan | ||
Visiview software v2.1.4 | Visitron Systems, Puchheim, Germany | ||
Metamorph software v7.8.10 | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
Sigma Plot v.12 | Systat Software Inc. |