Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

माइलॉइड β का विज़ुअलाइज़ेशन मानव मस्तिष्क में मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्टशन के साथ जमा/आयनीकरण इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/57645
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 3, 4
1Department of Life and Medical Systems, Doshisha University, 2Bruker Daltonics K.K., 3The Brain Bank for Aging Research, Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology, 4Graduate School of Brain Science, Doshisha University
* These authors contributed equally

Summary

मैट्रिक्स के साथ आणविक इमेजिंग-असिस्टेड लेजर डिसॉलशन/आयनीकरण आधारित इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (माल्डी-आईएमएस) जैविक नमूनों में मल्टीपल एनालिटीज के एक साथ मानचित्रण की अनुमति देता है । यहां, हम पता लगाने और अल्जाइमर रोग और मस्तिष्क amyloid एंजियोपैथी के नमूने के ब्रेन ऊतकों पर amyloid β प्रोटीन के दृश्य के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद माल्डी-आईएमएस का उपयोग कर ।

Abstract

अल्जाइमर रोग के neuropathology (विज्ञापन) संचय और amyloid β (aβ) पेप्टाइड्स के एकत्रीकरण मस्तिष्क के extracellular पट्टिकायों में विशेषता है । अβ पेप्टाइड्स, ४० एमिनो एसिड से बना, amyloid अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) से β-और γ secretases से उत्पन्न कर रहे हैं । एβ न केवल सेरेब्रल पैरेन्काइमा में बल्कि लेप्टोमेनिंगयल और सेरेब्रल वाहिका दीवारों में भी जमा किया जाता है, जिसे सेरेब्रल एमीलॉयड एंजियोपैथी (CAA) के रूप में जाना जाता है । जबकि aβ पेप्टाइड्स की एक किस्म की पहचान की गई, विस्तृत उत्पादन और व्यक्तिगत aβ पेप्टाइड्स के रोग ऊतकों में विज्ञापन और CAA का वितरण पूरी तरह से संबोधित नहीं किया गया है. यहां, हम व्यापक प्रोटीन मानचित्रण प्राप्त करने के लिए मानव ऑटोप्सी मस्तिष्क के ऊतकों पर मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसॉलशन/आयनीकरण-आधारित इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (माल्डी-आईएमएस) का एक प्रोटोकॉल विकसित करते हैं । इस प्रयोजन के लिए, मानव cortical नमूनों मस्तिष्क बैंक से टोक्यो मेट्रोलॉजी के महानगरीय संस्थान में प्राप्त किया गया । जमे हुए cryosections कट और इंडियम-टिन-ऑक्साइड (आईटीओ) को हस्तांतरित कर रहे हैं-लेपित कांच स्लाइड । स्पेक्ट्रा 20 μm अप करने के लिए एक स्थानिक संकल्प के साथ माल्डी प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं । सिनापिनिक अम्ल (एसए) समान रूप से या तो एक स्वचालित या एक मैनुअल स्प्रेयर का उपयोग कर स्लाइड पर जमा किया जाता है । माल्डी-आईएमएस के वर्तमान तकनीकी लाभों के साथ, मानव autopsied दिमाग के एक ही वर्गों के भीतर विभिन्न aβ प्रजातियों में से एक ठेठ डेटा सेट विशिष्ट जांच के बिना प्राप्त किया जा सकता है । इसके अलावा, एक विज्ञापन मस्तिष्क और गंभीर CAA नमूना के उच्च संकल्प (20 μm) इमेजिंग स्पष्ट रूप से पता चलता है कि aβ 1-36 aβ 1-41 leptomeneal जहाजों में जमा किए गए थे, जबकि aβ 1-42 और aβ 1-43 सेरेन्काइमा सेनिले पट्टिका (SP) के रूप में जमा किए गए थे. यह वर्तमान रणनीति के आधार पर विज्ञापन, CAA, और अन्य स्नायविक रोगों की विकृति को समझने में नैदानिक, आनुवंशिक, और पैथोलॉजिकल टिप्पणियों के साथ संयोजन में एक मानक दृष्टिकोण के रूप में माल्डी-आईएमएस को अपनाना संभव है ।

Introduction

निदान करने के लिए और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के रोगजनन को समझने के लिए, पैथोलॉजिकल जमाव की सटीक आणविक पहचान आवश्यक है1। विज्ञापन के दौरान, एβ सेरेब्रल पैरेनकाइमा में एसपीएस बनाने के लिए उत्पादन किया जाता है और रोग शुरुआत2,3,4,5,6से पहले लंबे जहाजों में जमा होता है । जबकि aβ 1-42 विज्ञापन दिमाग के SP में प्रमुख पेप्टाइड है, अन्य aβ वेरिएंट, जैसे एन-टर्मिनल या सी-टर्मिनल छोटा या संशोधित aβs, भी प्रभावित विज्ञापन दिमाग में पहचान कर रहे हैं7,8,9, 10. मानव दिमाग में aβ प्रजातियों की व्यापक रेंज की एक पूरी तस्वीर, विशेष रूप से विज्ञापन और सेरेब्रल amyloid एंजियोपैथी के साथ (CAA)11, वैज्ञानिकों को aβ उत्पादन, चयापचय, और जमाव को समझने में मदद मिलेगी ।

neuropathology के शास्त्रीय दृष्टिकोण के रूप में, immunohistochemistry (ihc) मस्तिष्क के ऊतकों में aβs के स्थान का निर्धारण करने के लिए सबसे निर्णायक विधि किया गया है12,13,14,15. सामान्य तौर पर, ihc अणुओं भेद नहीं कर सकता जब कई epitopes एक साथ coexist. इसके विपरीत, एक उभरते मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित proteomic विश्लेषण विशेष रूप से मस्तिष्क के ऊतकों में aβ प्रजातियों की एक किस्म है, जो16,17एंटीबॉडी के साथ भेदभाव नहीं किया जा सकता का विश्लेषण करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है । मस्तिष्क lysates और immuno-उपजी नमूनों की पारंपरिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित विश्लेषण मामूली aβ पेप्टाइड का पता लगाने के लिए विफल रहता है और मस्तिष्क के ऊतकों में aβ के वितरण की जानकारी खो देता है.

पहले काम करता है, में visualizing aβ माउस दिमाग में जमा किया गया है सफल विज्ञापन के एक ट्रांसजेनिक पशु मॉडल का उपयोग कर, जैसे APP23 । हालांकि, इस प्रक्रिया को अभी भी संकल्प और संवेदनशीलता18,19,20के संबंध में आईएमएस और ihc की तुलना करने के लिए तकनीकी प्रगति की जरूरत है । विज्ञापन neuropathology मानव दिमाग पर अध्ययन किया जाना चाहिए, और हम व्यापक प्रोटीन मानचित्रण21प्राप्त करने के लिए मानव शव मस्तिष्क के ऊतकों पर माल्डी आईएमएस प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल किया । इस प्रयोजन के लिए, हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के एक उन्नत प्रकार है कि इसकी रैडिटी में लाभ है के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित, संवेदनशीलता, और पुनरुद्देश्यता.

Protocol

यहां, ऊतक के नमूने टोक्यो मेट्रोपोलिटन जेरीयेट्रिक अस्पताल में एकत्र किए गए, जो जापान में बुजुर्गों की आबादी के लिए समुदाय आधारित चिकित्सा सेवाएं प्रदान करता है । अध्ययन में प्रयुक्त ब्रेन ऑटोप्सी नमूनों को मृतक के रिश्तेदारों की सूचित सहमति से एजिंग रिसर्च (bbar) के लिए ब्रेन बैंक में पंजीकृत किया गया । bbar को टोक्यो मेट्रोपॉलिटन जेरियेट्रिक हॉस्पिटल और इंस्टिट्यूट ऑफ ग्रेंटोलॉजी की एथिक्स कमिटी ने मंजूरी दी है । मस्तिष्क बैंक में पंजीकृत सभी दिमाग के लिए, हम रोगियों या उनके परिवारों से चिकित्सा अनुसंधान के लिए उनके उपयोग के लिए लिखित सूचित सहमति प्राप्त की । मस्तिष्क में मरणोत्तर परिवर्तन को कम करने के लिए रोगियों को मृत्यु के बाद 2 ज के भीतर ठंडे (4 डिग्री सेल्सियस) कमरे में रखा गया था । सभी तरीकों यहां वर्णित doshisha विश्वविद्यालय और उंर बढ़ने अनुसंधान, टोक्यो महानगरीय बुढ़ापे अस्पताल और gerontology के संस्थान के लिए मस्तिष्क बैंक द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. आईएमएस के लिए ऊतक वर्गों की तैयारी

  1. एक मानव autopsied मस्तिष्क के प्रसंस्करण ऊतक नमूना
    नोट: सुनिश्चित करें कि आईएमएस के लिए नमूना तैयारी चरण ऊतक की मूल स्थिति को बरकरार रखता है । संक्रमण और पोस्टमार्टम से बचें । निंनलिखित कदम महत्वपूर्ण है ।
    1. दिमाग से आईएमएस के लिए मानव cortical नमूने प्राप्त है कि हटा दिया गया, संसाधित, और 8 एच के भीतर-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । विज्ञापन रोगियों और आयु मिलान नियंत्रण21के पश्चकपाल प्रांतस्था से मस्तिष्क नमूना ले लो ।
  2. जमे हुए ऊतक वर्गों की तैयारी
    1. एक cryostat पर ऊतक वर्गों में कटौती । जगह प्रवाहकीय आईटीओ-लेपित माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड cryostat21के अंदर ।
    2. क्रायोस्टेट के अंदर-८० डिग्री सेल्सियस से-22 डिग्री सेल्सियस से ऑटोप्सी मस्तिष्क नमूना गर्म ।
    3. हर प्रयोग के लिए cryostat के लिए एक नया डिस्पोजेबल ब्लेड देते हैं । हमेशा ब्लेड के एक साफ भाग का उपयोग करने की कोशिश करो ।
    4. अक्टूबर यौगिक की एक छोटी राशि के साथ मंच पर जमे हुए शव परीक्षा दिमाग रखो (मंच के केंद्रीय क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त है, सामग्री की तालिकादेखें) ।
    5. पतले सेक्शनिंग के लिए स्थितियां चुनें । आईएमएस के लिए, मानव मस्तिष्क वर्गों के लिए 10-12 μm की एक मोटाई का उपयोग करें । आईएमएस और ihc के लिए, प्रत्येक ऊतक नमूना से पांच से छह वर्गों में कटौती ।
    6. जब ब्लेड सिर्फ ऊतक में कटौती शुरू कर रहा है, पहिया और "चेहरा" ब्लॉक बारी जब तक ऊतक के सभी उजागर है । एक छोटी लकीर या अनुभाग भर में आंसू है, तो तापमान समायोजन स्वचालित रूप से इसे ठीक करता है जब तक cryostat में थोड़ा और अधिक प्रतीक्षा करें । नीचे एक ऊतक के साथ विरोधी रोल खोलने से पहले कुछ सेकंड की गणना ।
    7. तुरंत गिलास स्लाइड के इतो लेपित पक्ष पर ऊतक टुकड़ा जगह । ऊतक स्लाइस को गैर-इतो-लेपित पक्ष पर स्लाइड के नीचे एक उंगली रखकर । ऊतक स्लाइड से चिपके रहेंगे; सुनिश्चित करें कि ऊतक के रूप में कोई झुर्रियों के साथ संभव के रूप में फ्लैट है । कमरे के तापमान पर यह कदम प्रदर्शन ।
      नोट: दस्ताने, मास्क पहनते हैं, और एक प्रयोगशाला गाउन क्योंकि मानव नमूनों जैविक contaminants शामिल हो सकते हैं । जब सभी वर्गों दिन के लिए किया गया है, साफ cryostat, ब्रश, और प्रयोगशाला पोंछे और २०० मिलीलीटर १००% इथेनॉल के साथ chucks ।
  3. ऊतक वर्गों को धोने
    1. में नमूनों को विसर्जित 40 – 100 मिलीलीटर ७०% इथेनॉल के लिए 30 s अंतर्जात लिपिड और अकार्बनिक लवण को हटाने के लिए. एक गिलास धुंधला जार का प्रयोग करें ।
    2. 30 एस के लिए १००% इथेनॉल के 40-100 मिलीलीटर के साथ नमूने धोने, 40-100 मिलीलीटर के लिए carnoy समाधान के 3 मिनट, 40 – 100 मिलीलीटर के लिए १००% इथेनॉल 30 s, 40 – 100 मिलीलीटर के ०.१% trifluoroacetic एसिड (tfa) के लिए 1 मिनट, और 40 – 100 मिलीलीटर १००% इथेनॉल के लिए 30 s. एक गिलास का उपयोग करें दाग जार ।
      नोट: carnoy समाधान छह भागों इथेनॉल, तीन भागों एसिटिक एसिड, और एक भाग क्लोरोफॉर्म से बना एक फिक्टिव है ।
    3. 30 मिनट के लिए एक निर्वात में सूखी ।
  4. ऑटोप्सी मस्तिष्क के ऊतकों से aβ प्रोटीन के एक बेहतर आयनन के लिए एक चींटी एसिड वाष्प के साथ ऊतक वर्गों के उपचार
    1. ओवन और ऊष्मायन कांच स्लाइड तैयार १००% फॉर्मिक एसिड की 5 मिलीलीटर के साथ बाद में वाष्पन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए । एक संतोषजनक एसिड उपचार प्राप्त करने के लिए, इस कदम के दौरान संतृप्ति के स्तर पर ऊष्मायन कांच पकवान में हवा की नमी रखने के लिए और ६० डिग्री सेल्सियस पर तापमान रखने के लिए । ऊष्मायन कांच की डिश में ऊतक स्लाइड रखें, जबकि फॉर्मिक एसिड में पनडुब्बी से परहेज और 6 मिनट के लिए इलाज करें ।
    2. एक फिल्म स्कैनर, जेल स्कैनर, या एक डिजिटल माइक्रोस्कोप, आदि का उपयोग कर नमूनों की एक ऑप्टिकल छवि ले लो कमरे के तापमान पर इस कदम का प्रदर्शन । नमूने के ऑप्टिकल छवि के संरेखण आवश्यक है जब नमूना लक्ष्य साधन के अंदर रखा गया है । आमतौर पर, यह मैट्रिक्स परत के नीचे ऊतक अनुभाग पहचान करने के लिए संभव नहीं होगा.
      नोट: एक ऑप्टिकल छवि लेने के लिए सबसे सुविधाजनक तरीका है एक कार्यालय स्कैनर का उपयोग करने के लिए है । इमेजिंग डेटा संग्रहण फ़ोल्डर में छवि को सहेजना एक अच्छा विचार है ।
    3. नमूनों के साथ ऑप्टिकल छवियों को सहसंबंधित करने के लिए, दोनों ऑप्टिकल छवि में और कैमरा ऑप्टिक में मैट्रिक्स परत के नीचे दिखाई दे रहे हैं कि गाइड के निशान बनाने. सबसे आसान तरीका ऑप्टिकल छवि लेने से पहले नमूना के आसपास कम से तीन सुधार तरल पदार्थ के निशान हाजिर करने के लिए है ।
  5. मैट्रिक्स अनुप्रयोग
    1. मैट्रिक्स समाधान की तैयारी
      1. एक कार्बनिक विलायक-सहिष्णु microtube में, ५०% acetonitrile (acn) और ०.१% tfa में एक 10 मिलीग्राम/एमएल एसए समाधान तैयार करते हैं । अच्छी तरह से vortexing या 10 मिनट के लिए संक्षिप्त sonication द्वारा एसए यौगिक भंग । उपयोग तक कमरे के तापमान पर समाधान की दुकान ।
        नोट: एक airbrush, एक अल्ट्रासोनिक स्प्रेयर, या एक स्वचालित स्प्रेयर का उपयोग कर: मैट्रिक्स छिड़काव के लिए तीन विभिन्न विकल्प हैं ।
    2. एक एयरब्रश के साथ मैट्रिक्स छिड़काव
      1. एक स्थिर कमरे के तापमान (20-23 डिग्री सेल्सियस) और आर्द्रता (40% – 60%) पर आपरेशन प्रदर्शन । इष्टतम छिड़काव के लिए समायोजित करने के लिए मापदंडों छोटी बूंद के आकार, धुंध की मात्रा, कोण और स्प्रे नोक और ऊतक अनुभाग के बीच की दूरी, और प्रयोगशाला तापमान और आर्द्रता शामिल हैं । माइक्रोस्कोपी परिणामों की जाँच करके इन शर्तों को समायोजित करें ।
        नोट: के रूप में सीमित कारकों क्रिस्टल आकार और मैट्रिक्स कवरेज के एकरूपता शामिल है और अवांछनीय प्रवास/के प्रसार के लिए, छोटे ड्रॉप आकार के लिए बेहतर है । एकरूपता भी निरीक्षण की बात है ।
    3. एक अल्ट्रासोनिक स्प्रेयर के साथ मैट्रिक्स छिड़काव
      1. ऊतक को हटाने के लिए desiccator से छिड़काव किया और यह कक्ष में जगह है । सुनिश्चित करें कि ऊतक सेंसर विंडो को कवर नहीं है ।
      2. शुरू बटन धक्का द्वारा तैयारी शुरू; आमतौर पर, प्रस्तुत करने का समय लगभग ९० मिनट है । तैयारी मैट्रिक्स परत मोटाई और नमी की निगरानी के माध्यम से स्वचालित रूप से विनियमित किया जाएगा । तैयारी पूरी होने के बाद, स्लाइड निकालें और इसे मालदी इंस्ट्रूमेंट में पढ़ने से पहले 15 मिनट के लिए desiccator में स्टोर करें ।
      3. स्प्रे सिर साफ दिखाई देता है जब तक १००% meoh के 2-3 मिलीलीटर के साथ स्प्रेयर साफ ।
        नोट: मैट्रिक्स बूंदों के एक ठीक धुंध एक गुरुत्वाकर्षण पत्रक द्वारा ऊतक में डूबने की अनुमति दी है । 20 μm का एक औसत छोटी बूंद आकार उत्पन्न होता है; सभी छोटी बूंद व्यास ५० μm से कम कर रहे हैं ।
    4. एक स्वचालित स्प्रेयर के साथ मैट्रिक्स छिड़काव
      1. एक स्वचालित स्प्रेयर के साथ ऊतक की सतह पर मैट्रिक्स समाधान स्प्रे । गर्म म्यान गैस (N2, 10 साई और ७५ डिग्री सेल्सियस पर सेट) के एक निरंतर प्रवाह मैट्रिक्स समाधान स्प्रे के साथ conjointly दिया जाएगा । एक विलायक पंप प्रणाली का उपयोग करें (10 साई और ०.१५ मिलीलीटर में सेट/
        नोट: सबसे महत्वपूर्ण बात, एक सुरक्षा कैबिनेट के तहत काम मैट्रिक्स एयरोसोलों के किसी भी साँस लेने से बचने के लिए । नियंत्रण कमरे के तापमान और आर्द्रता समरूप मैट्रिक्स क्रिस्टलीकरण पुन: उत्पन्न करने के लिए.

2. माल्डी-आईएमएस

  1. अल्ट्रा उच्च गति मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रदर्शन.
    1. एक 10 kHz एनडी के साथ सुसज्जित माल्डी-आईएमएस के साथ उच्च throughput और उच्च स्थानिक संकल्प इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन: YAG (३५५ एनएम) लेजर ।
    2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री मापन के लिए, माल्डी नियंत्रण सॉफ्टवेयर और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग ऊतक क्षेत्रों को परिभाषित ।
    3. स्पेक्ट्रा को एम/जेड 2000 – 20000 की एक सामूहिक श्रेणी और 20 और १०० μm के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ एक सकारात्मक रेखीय मोड में प्राप्त करें ।
    4. अंशांकन मानक बनाने के लिए, पेप्टाइड अंशांकन मानक और प्रोटीन अंशांकन मानक के साथ 1:4 के अनुपात के साथ अल्फा-cyano-4-हाइड्रॉक्सिल-सिनेमिक एसिड (chca) में TA30 समाधान (acn: 0.1% tfa = 30:70) और फिर इसे पतला 10x. चार विभिन्न स्थानों पर स्लाइड पर अंशांकन मानक के 1 μl रखें ।
  2. आणविक हिस्टोलॉजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करना ( सामग्री की तालिकादेखें), विभिन्न संकेतों के स्थानिक सहसंबंध को खोजने के लिए कई एकल छवियों ओवरले, ऐसे विभिन्न aβ के रूप में एसपीएस और धमनी की दीवारों में colocalizing पेप्टाइड्स.

3. डाटा प्रोसेसिंग

  1. स्पेक्ट्रल संरेखण के लिए, एक पिछले प्रकाशन21से एक चयनित एम/जेड सूची में सभी स्पेक्ट्रा संरेखित करें ।
  2. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ( सामग्री तालिकादेखें) में आधारभूत घटाव के साथ माल्डी-आईएमएस डेटा का आयात करें ।
  3. हिस्टोलॉजिकल ज्ञान के आधार पर ब्याज क्षेत्र (rois) का पता लगाएं ।
    1. माध्य तीव्रता, मानक विचलन, भेदनशील m/z-मार्कर (roc विश्लेषण), परिकल्पना परीक्षण, और colocalized m/z मूल्यों की खोज के लिए एक यूनीवर्एट विश्लेषण करें ।
  4. एक फॉल्ट मानचित्र बनाएं ।
    1. बड़े डेटासेट के स्थानिक विभाजन और अंतर्निहित रुझानों की निकासी के लिए एक घटक विश्लेषण के लिए एक अपर्यवेक्षित बहुमान विश्लेषण करें ।
    2. हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं पर आधारित संरचनात्मक rois का चयन करें, जैसे पैरेंकाइमा और सुब्रचनोइड स्पेस ।
    3. व्यक्तिगत rois के रूप में संरचनाओं निरुपित और उन्हें संसाधित एमएस डेटा के साथ सहसंबंधित क्रम में संबंधित पेप्टाइड्स कि क्षेत्र की छवि विभाजन की अनुमति की पहचान करने के लिए.

Representative Results

के साथ छिटपुट विज्ञापन रोगियों CAA (n = 5; औसत आयु = ८३.२ y) और बूढ़ा विषयों के साथ बूढ़ा पट्टिका मुक्त (SP O) और CAA (n = 5; माध्य आयु = ७७.२ y) विश्लेषण किया गया (तालिका 1) । इस अध्ययन में रोगी #3 के CAA phenotypes सबसे प्रमुख थे । रोगी #3 से मस्तिष्क ऊतक में aβ 1-40 और aβ 1-42 जमा के वितरण माल्डी-आईएमएस (चित्रा 1) के साथ कल्पना कर रहे थे । वहाँ nonपैथोलॉजिकल नियंत्रण दिमाग में कोई महत्वपूर्ण संकेत थे (रोगियों #9 और #10), के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया. यहां, माल्डी-आईएमएस स्पष्ट रूप से कल्पना की है कि aβ 1-42 प्रमस्तिष्कीय पैरेंकाइमा में एसपीएस के रूप में तरजीही जमा किया गया था । इसके विपरीत, छोटे aβs, जैसे aβ 1-36 करने के लिए 1-41, अधिमान्य रूप से leptomeningeal संवहनी क्षेत्रों पर जमा किए गए थे (चित्रा 1).

aβ ४० और aβ ४२ के वितरण के ऊतकों के आसन्न जमे हुए वर्गों का उपयोग कर ihc के साथ आगे मान्य थे. विरोधी aβ ४० एंटीबॉडी ( चित्रा 2bमें तीर) CAA लेबल, जो एसपीएस के रूप में मस्तिष्क पैरेंकाइमा में aβ ४२ के वितरण के लिए स्पष्ट विपरीत में है । aβ 1-41 के लिए, हम मानव दिमाग में इस अंश का पता लगाने के लिए पहली बार कर रहे हैं, और हम विशिष्ट एंटीबॉडी है कि aβ से ४१ अंतर कर सकते हैं उत्पन्न किया है अβ ४० andaβ ४२21.

माल्डी-आईएमएस का स्थानिक संकल्प आम तौर पर सुधार करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक है । चित्रा 1 में और चित्रा 2 एक १०० μm पिच संकल्प के साथ माल्डी-आईएमएस दिखाने के लिए और एक अपेक्षाकृत व्यापक क्षेत्र21के लिए एक समग्र वितरण प्रोफ़ाइल प्राप्त करते हैं । संवहन संरचना सहित, सुब्रचनोइड स्थान पर बिल्कुल amyloid जमाव को परिभाषित करना कठिन है । सुब्राचनोइड वाहिकाओं के महीन ऊतक संरचनाओं और कॉर्टेक्स की सतह को चित्रित करने के लिए, उच्च-रिज़ॉल्यूशन मालदी इमेजिंग (४० μm: चित्रा 3; 20 μm: चित्रा 4 और चित्रा 5) का प्रदर्शन किया गया था । नतीजतन, मालदी-आईएमएस ने स्पष्ट रूप से दर्शाया है कि कम aβs, जैसे aβ 1-36 to 1-41, धमनियों की दीवारों में वितरित कर रहे हैं, जो ihc के साथ तुलनीय है.

माल्डी-आईएमएस दोनों aβx-४० और aβx-४२ (एक्स = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, और 11pe) के विस्तृत वितरण का प्रदर्शन विज्ञापन में उदारवादी CAA मस्तिष्क के साथ साथ । उदाहरण के लिए, जबकि aβx-४० प्रजातियों aβ 1-40 करने के लिए एक समान वितरण प्रोफ़ाइल दिखाया, aβx-४२ प्रजातियों aβ 1-4221के साथ एक अलग वितरण पैटर्न दिखाया. वर्तमान प्रोटोकाल के अनुसार, मालदी-आईएमएस के साथ वैयक्तिक अβ पेप्टाइड्स के एकल आयन बिंब को अβ प्रजातियों को सौंपा गया है । इसके विपरीत, अधिग्रहीत छवि डेटा unsupervised बहुमान आंकड़ों का उपयोग कर जांच की जा सकती है ताकि अपरिभाषित प्रोटीन के आगे के विश्लेषण के लिए ब्याज की संरचनात्मक क्षेत्रों की छवि विभाजन प्राप्त करने के लिए । चित्रा 5 एक बिच्छेद के साथ प्राप्त एक फॉल्ट मानचित्र से पता चलता है मतलब है कि मरीज #321से एक ही खंड के लिए लागू विश्लेषण । यह क्लस्टरिंग विधि सफलतापूर्वक पैरेनकाइमा ( चित्रा 5cमें नीला) में पट्टिका की तरह संरचनाओं की पहचान की और अवजालतनिका अंतरिक्ष में संवहनी संरचनाओं ( चित्रा 5cमें हरा) । यह पैरेंकाइमा में एक छोटे से परिपत्र क्षेत्र को खोजने के लिए दिलचस्प है, जो सिर्फ पैरेंकाइमा में एक छोटे से धमनी के आसपास का पता लगाया जाता है, साथ ही साथ सुब्रचनोइड स्पेस ( चित्रा 5cमें बैंगनी) में पाया जाता है । यह चित्र 5d-5fमें इन व्यक्तिगत aβ पेप्टाइड्स की एकल आयन छवियों द्वारा सत्यापित है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक जमे हुए विज्ञापन/CAA मस्तिष्क अनुभाग के माल्डी-आईएमएस । विभिन्न सी-टर्मिनल में कटा हुआ aβ पेप्टाइड्स विज्ञापन के साथ गंभीर CAA (रोगी #3) बाएँ पैनल में कल्पना हैं और सही पैनल में (सभी छवियों में बाईं ओर रोगी #10 पर सही और मरीज पर #9) नियंत्रण. aβ 1-36 to aβ 1-41 को leptomeneal रक्त वाहिकाओं में अधिमान्य रूप से जमा किया जाता है, जबकि एβ 1-42 और aβ 1-43 सेरेब्रल पैरेन्काइमा में #3 मामले में सेनाइल पट्टिकाएं के रूप में जमा किए जाते हैं, जबकि नियंत्रण रोगियों के दिमाग में कोई संकेत नहीं था (मामले #9 और #10). संकल्प = १०० μm । स्केल बार = 5 मिमी । यह आंकड़ा ककुडा एट अल.21से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: जमे हुए विज्ञापन/CAA मस्तिष्क वर्गों और विज्ञापन दिमाग से पश्चकपाल प्रांतस्था के आसन्न वर्गों के माल्डी-आईएमएस । (A - C) जमे हुए विज्ञापन/CAA मस्तिष्क वर्गों और (डी और ई) विज्ञापन दिमाग से पश्चकपाल प्रांतस्था के आसन्न वर्गों प्रतिरक्षा दाग थे और धमनी और सेरेब्रल पैरेन्काइमा पर ध्यान केंद्रित, aβ ४० के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग (d: BA27) या aβ ४२ (E: anti-aβ ४२ polyclonal). दोनों विश्लेषणों का प्रदर्शन है कि aβ ४० leptomeneal रक्त वाहिकाओं में अधिमान्य रूप से जमा किया गया है (पैनल डीमें तीर) और अवजालतनिका अंतरिक्ष में धमनियों और सेरेब्रल पैरेन्काइमा बनाने काए. इसके विपरीत, एβ ४२ मुख्य रूप से एसपीएस में जमा किया गया है । आईएमएस के लिए, संकल्प = १०० μm । स्केल बार = 5 मिमी (ए, बी, और सी) = 5 मिमी, ५०० (डी और ई) । यह आंकड़ा ककुडा एट अल.21से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: जमे हुए विज्ञापन के mald-आईएमएस/CAA मस्तिष्क वर्गों (रोगी #3) ४० μm के एक संकल्प पर । विभिन्न सी-टर्मिनल और एन-टर्मिनल कटा हुआ और संशोधित aβ पेप्टाइड्स विज्ञापन के साथ गंभीर CAA (रोगी #3). aβ 1-36 to aβ 1-41 को leptomeneal रक्त वाहिकाओं में अधिमान्य रूप से जमा किया जाता है, जबकि एβ 1-42 और aβ 1-43 सेरेन्काइमा के रूप में सेनिले पट्टिकाएं में जमा किए जाते हैं । स्केल पट्टियां = 1 मिमी (A-B), 2 मिमी (ऊपरी बाएं) । संकल्प = ४० μm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: जमे हुए विज्ञापन के माल्डी-आईएमएस/CAA मस्तिष्क वर्गों (रोगी #3) 20 μm के एक संकल्प पर । इस पैनल के विभिंन सी-टर्मिनल और N-टर्मिनल छोटा और संशोधित aβ पेप्टाइड्स विज्ञापन में गंभीर CAA (रोगी #3) के साथ दिखाता है । aβ 1-36 to aβ 1-41 को leptomeneal रक्त वाहिकाओं में अधिमान्य रूप से जमा किया जाता है, जबकि एβ 1-42 और aβ 1-43 सेरेन्काइमा के रूप में सेनिले पट्टिकाएं में जमा किए जाते हैं । स्केल पट्टियां = २०० μm (a, b, c), 1 mm (ऊपरी बाएं) । संकल्प = 20 μm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: विभाजन नक्शा, एक जमे हुए विज्ञापन मस्तिष्क अनुभाग के maldi-आईएमएस द्वारा प्राप्त, पुटीव बूढ़ा पट्टिका का पता चलता है, बड़े अवजालतनिका पोत संरचनाओं, और छोटे पैरेंकाइमल धमनी. (क) मलदी-आईएमएस डेटा के बहुमान प्रतिबिंब विश्लेषण से प्राप्त विभाजन मानचित्र । (ख) द्विच्छेद का अर्थ है-पश्चकपाल प्रांतस्था में पट्टिका की तरह और पोत की तरह संरचनाओं के आधार पर क्लस्टरिंग विश्लेषण की पहचान की । क्लस्टर्स और उपसंरचनाएं और उनके संबंध नोड्स (उदा., 1-0-0) के रूप में दिखाए जाते हैं । (ग) विशिष्ट अβ पेप्टाइड स्थानीयकरण पैटर्न जैसे पट्टिकाएं (नीला), सुब्रचनोइड वाहिकाओं (हरा), और धमनी (लाल) संरचनाएं । ध्यान दें कि सुब्रचनॉइड स्पेस में कुछ रेड क्लस्टर्स भी वितरित किए जाते हैं । यह एक 20 μm संकल्प पर इन व्यक्ति aβ पेप्टाइड्स की एकल आयन छवियों द्वारा सत्यापित है: (घ) aβ 1-40, (ई) aβ 1-41, और (एफ) aβ 1-42. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

मामला लिंग मृत्यु पर आयु बराक एसपी Caa
1 एम ८३ सी ०.५
2 एम ८८ सी 1
3 एम ८४ सी 2
4 एम ७८ सी 1
5 एम ८३ सी 1
6 एम ८४ ओ 0
7 एम ७८ ओ 0
8 एम ७० ओ 0
9 एम ७३ ओ 0
10 एम ८१ ओ 0

तालिका 1: CAA मामलों और आयु SP O विषयों के साथ विज्ञापन के नैदानिक और पैथोलॉजिकल डेटा. IMS और ihc के लिए ह्यूमन कॉर्टिकल नमूनों को टोक्यो मेट्रोपोलिटन इंस्टीट्यूट ऑफ ग्रेंटोलॉजी में ब्रेन बैंक से प्राप्त किया गया था । प्रत्येक मस्तिष्क नमूना पांच विज्ञापन रोगियों और पांच आयु मिलान नियंत्रण के पश्चकपाल प्रांतस्था से लिया गया था । एक अβ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा दर्शाए अनुसार एमीलॉयड जमाव की सीमा ब्रैक एसपी (एमीलॉयड) चरणों द्वारा परिभाषित की गई थी । स्टेज ओ में, isocortex भर में लगभग कोई बूढ़ा सजीले टुकड़े कर रहे हैं । स्टेज C पर, वस्तुतः सभी आइसोकोटिकल क्षेत्र प्रभावित होते हैं । विज्ञापन दिमाग स्टेज सी पर अपरिवर्तनीय हैं । इस तालिका को ककुडा एट अल.21से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है ।

Discussion

यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल और aβ के दृश्य के परिणाम और विज्ञापन और CAA के साथ कई autopsied दिमाग से अपने isoforms के परिणामों का प्रदर्शन माल्डी-आईएमएस के साथ । aβs की साठा प्रोफ़ाइल को अपने N-और C-टर्मिनल विविधताओं के लिए अβ 1-42 से काफी बदल दिया गया था । aβ 1-41 पहले की पहचान की और वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ मानव दिमाग में कल्पना था और आगे ihc21के साथ मान्य किया गया था. यह देखते हुए कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण (20 μm) के साथ आईएमएस द्वारा जमा किए गए अβ के आकारिकी को ihc, IMS और ihc के साथ अच्छे समझौते में होना चाहिए, समान रूप से उनके स्थान और प्रोटीन सामग्री, साथ ही साथ उनके आकारिकी द्वारा aβ जमा भेद करने में योगदान । के रूप में पूरे यहां वर्णित प्रयोग पश्चकपाल प्रांतस्था में आयोजित किया गया था, सभी मस्तिष्क क्षेत्रों में अलग बीटा amyloid प्रजातियों के स्थानीयकरण का अध्ययन वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर भविष्य के प्रयोगों के साथ सामांयीकृत किया जाएगा ।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम मानव मस्तिष्क के ऊतकों में एकत्रित प्रोटीन का एक प्रभावी आयनन प्राप्त करने के लिए ऊतक तैयारी कदम हैं । एक मैट्रिक्स परत के लिए लेजर ऊर्जा को अवशोषित और विशोषण और analytes के आयनन प्रेरित करने के लिए आवश्यक है । इस प्रक्रिया में, एक संपूर्ण ऊतक अनुभाग एक ही ढंग छोटे क्रिस्टल के साथ लेपित है । मैट्रिक्स के साथ analyte के समरूप coक्रिस्टलीकरण उच्च संवेदनशीलता और विरूपण साक्ष्य मुक्त इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है । तीन स्प्रे तरीकों में से प्रत्येक के अपने फायदे हैं । मैनुअल स्प्रे कोटिंग सबसे अक्सर इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है । एक एयरब्रश सुविधाजनक है; हालांकि, यह निपुण आपरेशन की आवश्यकता है । सटीक और पुनरुद्भूत प्रयोगात्मक तकनीक के रूप में आवश्यक है, एक अल्ट्रासोनिक स्प्रेयर और/या वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक स्वचालित स्प्रेयर का उपयोग करने की सिफारिश की है । एक अल्ट्रासोनिक स्प्रेयर के संबंध में, यह कमरे के नमी और तापमान से प्रभावित नहीं होगा क्योंकि यह एक चैंबर में छिड़काव किया जाता है । इस बीच, एक स्वत: स्प्रेयर के साथ, अपेक्षाकृत अच्छा reproducibility के साथ स्थानिक संकल्प संरक्षित प्राप्त है । आम तौर पर, स्थानिक संकल्प के साथ प्राप्त तीन तरीकों में वृद्धि के क्रम में 1) airbrush, 2) स्वचालित डिवाइस, और 3) अल्ट्रासोनिक स्प्रेयर.

सबसे महत्वपूर्ण बात यह प्रोटोकॉल मूल रूप से मानव autopsied मस्तिष्क के नमूनों में aβs का पता लगाने और कल्पना करने के लिए उत्पन्न किया गया था. APP23 चूहों के लिए माल्डी-आईएमएस के साथ aβs के दृश्य, जो मानव अनुप्रयोग के स्वीडिश प्रकार उत्परिवर्तन के आधार पर विज्ञापन के एक पशु मॉडल के रूप में उत्पन्न होता है, एक मौजूदा विधि18,19के साथ दूसरों के द्वारा पहले सूचित किया गया है. हालांकि, पूर्व APP23 करने के लिए लागू प्रोटोकॉल अपने पार्श्व संकल्प और संवेदनशीलता में aβ कल्पना करने के लिए पर्याप्त नहीं था । पहले काम करता है कि ऊतक सीमा के बाहर उच्च aβ सांद्रता स्पष्ट रूप से उनके प्रोटोकॉल18,19के साथ APP23 इमेजिंग में कलाकृतियों की चर्चा की । इसका मतलब है कि तथाकथित ' धुंधला ' असली एसपीएस और आईएमएस मैट्रिक्स निष्कर्षण कदम के कारण छवियों के बीच माल्डी प्रकार इमेजिंग के साथ अपरिहार्य था । हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल में, कलंक गायब हो गया और प्रत्येक स्पेक्ट्रम मस्तिष्क पैरेंकाइमा में हर एक सपा का प्रतिनिधित्व किया ।

जैसा कि यहाँ दिखाया गया है, हम पहली बार के लिए aβ 1-41 का पता लगा सकते हैं विज्ञापन और CAA दिमाग में माल्डी-आईएमएस, साथ ही साथ ihc के साथ, हमारी अपनी पीढ़ी के21द्वारा एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ. aβ प्रोसेसिंग मॉडल के अनुसार, aβ 1-38 aβ 1-45 के माध्यम से aβ 1-42 से व्युत्पन्न, जबकि aβ 1-41 से व्युत्पन्न aβ 1-45 द्वारा γ-secretase स्टेपवाइज क्लीवेज27,28,29,30,31 . इसका मतलब यह है कि वर्तमान प्रोटोकॉल इस मॉडल का समर्थन करता है । इस तकनीक की सीमाओं के लिए के रूप में, हम मानव शव मस्तिष्क से नमूनों की विविधता पर विचार करना चाहिए । सबसे महत्वपूर्ण कदम, एक अर्थ में, नैतिक सबूत के साथ योग्य शव मस्तिष्क ऊतक का आकलन करने के लिए है । उन योग्य शव मस्तिष्क के ऊतकों पर वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, माल्डी-आईएमएस व्यक्तिगत रूप से कई संशोधनों वाले जटिल अणुओं के पूरे वितरण को ट्रैक कर सकते हैं, साथ ही अज्ञात कारक (एस) विज्ञापन के रोगजनन को विनियमित करने के लिए, कि अभी तक कर रहे हैं परिभाषित. इसके अलावा, वृद्ध मानव दिमाग में विभिन्न न्यूरोपैथोलॉजी के समग्र रोगजनन को समझने में, एक मानक दृष्टिकोण के रूप में माल्डी-आईएमएस को अपनाने के लिए संभव होना चाहिए, नैदानिक, आनुवंशिक और मस्तिष्क संबंधी बीमारियों में पैथोलॉजिकल टिप्पणियों के साथ संयोजन में .

माल्डी-आईएमएस का एक और महत्वपूर्ण कदम डेटा माइनिंग प्रोसेस प्राप्त डेटा सेट से है, जो हमेशा समय लेने वाला होता है । प्रत्येक चोटी के वितरण के मैनुअल डेटा खनन हर छवि के माध्यम से क्लिक करने के लिए उपयोगकर्ताओं की आवश्यकता है और वितरण कि विश्लेषण नमूना के आकारिकी के लिए सहसंबंधित हो सकता है के लिए देखो. स्वचालित स्थानिक विभाजन डेटा खनन के पहले कदम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, डेटा सेट का एक सिंहावलोकन प्रदान करने और प्रमुख सुविधाओं का त्वरित पता लगाने की अनुमति. इस दृष्टिकोण में, किसी दिए गए क्षेत्र के स्पेक्ट्रा के बीच समानता सांख्यिकीय रूप से निर्धारित होती है, और इसी तरह स्पेक्ट्रा को एक क्लस्टर में समूहीकृत किया जाता है । सभी पिक्सल रंग अपने क्लस्टर असाइनमेंट (चित्रा 5) के अनुसार कोडित रहे हैं । वर्तमान विज्ञापन में/CAA अध्ययन, ब्याज क्षेत्र parenchymal पट्टिका और अवजालतनिका और parenchymal संवहनी संरचनाओं में aβ जमाव की जगह है । दो विशिष्ट चोटियों जो आगे आईएचसी के साथ मान्य थे, aβ 1-40 और aβ 1-4221से m/z मान थे । इस प्रकार, यह आसान है खोजने के लिए colocalized m/z के साथ aβ 1-40 और aβ 1-42 जो पहले से ही एनोटेटेड करने के लिए N-और C-टर्मिनल कटा हुआ aβ, साथ ही साथ अज्ञात पेप्टाइड्स, आगे के विश्लेषण के लिए.

weller और सहयोगियों ने बताया है कि aβ पोत दीवारों में जमा, नसों के आसपास की तुलना में अधिक धमनियों के आसपास21. इसके अलावा, यह प्रस्तावित किया गया है बीचवाला द्रव (isf) aβs मस्तिष्क पैरेंकाइमा से लिम्फ नोड के लिए उत्सर्जित एक परिसंवहनी जल निकासी मार्ग के माध्यम से शामिल22,23,24,25 ,26. वर्तमान प्रोटोकॉल एक विभाजन एक 20 μm संकल्प पर सेट एक माल्डी आईएमएस डेटा के आधार पर नक्शा उत्पंन करने के लिए मस्तिष्क के पेरिवास्कुलर जल निकासी रास्ते के संभावित अस्तित्व का समर्थन करता है (चित्रा 5), जो21 विज्ञापन में CAA करने के लिए महत्वपूर्ण योगदान , ३२. इसके अलावा, हम प्रत्येक एम/जेड मूल्यों के सहसंबंध की गणना करके प्लेक और सुब्राचनोइड वैक्लचर के साथ कोमार्ड मार्कर प्रोटीन की खोज कर सकते हैं । वृद्ध मानव दिमाग में विभिन्न न्यूरोपैथोलॉजी के समग्र रोगजनन को समझने में, यह नैदानिक, आनुवंशिक, और न्यूरोलॉजिकल टिप्पणियों के स्थापित ihc डेटा के साथ संयोजन में एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में माल्डी आईएमएस को अपनाने के लिए संभव होना चाहिए रोगों.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के भाग में अनुदान द्वारा समर्थित था अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता में (मस्तिष्क प्रोटीन उंर बढ़ने और पागलपन नियंत्रण २६११७००४; करने के लिए M.I. और t.m.) । यह शोध आंशिक रूप से चिकित्सा अनुसंधान और विकास (एमएड) के लिए जापान एजेंसी से मस्तिष्क विज्ञान के लिए रणनीतिक अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था । सभी प्रयोग आने वाले दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Leica Microsystems, Wetzlar, Germany CM1950
Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide Bruker Daltonics #237001
Blade (disposable) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany #117394
O.C.T. Compound Leica Microsystems, Wetzlar, Germany FSC 22 Blue
Scanner EPSON GT-980
Air-Brush GSI Creos PS274
Compressor MRHOBBY Mr.Linear compressor L5
Ultrasonic sprayer Bruker Daltonics ImagePrep
Automatic sprayer HTX Technologies TM Sprayer
Confocal-laser-scanning-microscope Carl Zeiss Inc. LSM 700
Ultra high speed MALDI instrument Bruker Daltonics rapifleX MALDI Tissuetyper
MALDI control software Bruker Daltonics FlexControl 3.8
Data analysis software Bruker Daltonics FlexImaging 5.0
Molecular histology software SCiLS, Bremen, Germany SciLS Lab 2016a
Statistical software SCiLS, Bremen, Germany SciLS Lab 2016a
Sinapinic acid (SA) Nacalai tesque 30494-91
Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) Wako 037-19261
Calibration standard Bruker Daltonics
Biotinylated anti-mouse IgG antibodies Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Avidin and biotinylated HRP complex. Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA Vectastain Elite ABC kit
3,3-diaminobenzidine (DAB) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA Vectastain Elite ABC kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kovacs, G. G. Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine. International Journal of Molecular Sciences. 17, E189 (2016).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).
  3. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  4. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82, 239-259 (1991).
  5. Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).
  6. Bateman, R. J., et al. Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).
  7. Iwatsubo, T., et al. Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron. 13, 45-53 (1994).
  8. Reinert, J., et al. Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer's disease and transgenic mouse models. Acta Neuropathologica Communications. 4, 24 (2016).
  9. Saido, T. C., et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron. 14, 457-466 (1995).
  10. Harigaya, Y., et al. Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer's disease brain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).
  11. Vinters, H. V. Cerebral amyloid angiopathy. A critical review. Stroke. 18, 311-324 (1987).
  12. Saito, T., et al. Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43. Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).
  13. Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).
  14. Suzuki, N., et al. High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy. The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).
  15. Miyasaka, T., et al. Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).
  16. Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).
  17. Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer's Brains. ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).
  18. Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry. Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).
  19. Stoeckli, M., et al. MALDI MS imaging of amyloid. Methods in Enzymology. 412, 94-106 (2006).
  20. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).
  21. Kakuda, N., et al. Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry. Acta Neuropathologica Communications. 5, 73 (2017).
  22. Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease. Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).
  23. Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease and their potential impact on therapy. Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).
  24. Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).
  25. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).
  26. Hawkes, C. A., et al. Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy. Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).
  27. Kakuda, N., et al. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).
  28. Matsumura, N., et al. γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment. Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).
  29. Morishima-Kawashima, M., et al. Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain. The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).
  30. Takami, M., et al. γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment. The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).
  31. Kakuda, N., et al. Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).
  32. Carlred, L., et al. Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry. Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक १४५ माल्डी-इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री मानव ऑटोप्सी मस्तिष्क amyloid β अल्जाइमर रोग बूढ़ा सजीले टुकड़े सेरेब्रल amyloid एंजियोपैथी
माइलॉइड β का विज़ुअलाइज़ेशन मानव मस्तिष्क में मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्टशन के साथ जमा/आयनीकरण इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ikegawa, M., Nirasawa, T., Kakuda,… More

Ikegawa, M., Nirasawa, T., Kakuda, N., Miyasaka, T., Kuzuhara, Y., Murayama, S., Ihara, Y. Visualization of Amyloid β Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (145), e57645, doi:10.3791/57645 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter