Summary
Molekularer Bildgebung mit der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-basierte bildgebende Massenspektrometrie (MALDI-IMS) erlaubt die gleichzeitige Zuordnung von mehreren Analyten in biologischen Proben. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erfassung und Visualisierung von Amyloid β Protein Hirngewebe von Alzheimer-Krankheit und zerebralen Amyloid-Angiopathie Proben mit MALDI-IMS.
Abstract
Die Neuropathologie der Alzheimer-Krankheit (AD) zeichnet sich durch die Anhäufung und Aggregation von Amyloid-β (Aβ) Peptide in extrazelluläre Plaques des Gehirns. Die Aβ-Peptide, bestehend aus 40 Aminosäuren entstehen aus Amyloid-Precursor-Protein (APP) von β und γ-Secretases. Aβ lagert sich nicht nur im zerebralen Parenchym, sondern auch in Leptomeningeal und zerebralen Gefäßwänden, bekannt als zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA). Während eine Vielzahl von Aβ-Peptide wurden identifiziert, die Produktionsfeinplanung und Verteilung der einzelnen Aβ-Peptide in pathologischen Geweben von AD und CAA nicht vollständig beantwortet. Hier entwickeln wir ein Protokoll des Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-basierte bildgebende Massenspektrometrie (MALDI-IMS) auf menschlichen Autopsie Hirngewebe, umfassende Protein Zuordnung zu erhalten. Zu diesem Zweck wurden menschliche kortikalen Exemplare von Brain Bank am Tokyo Metropolitan Institut für Gerontologie erhalten. Gefrorene Cryosections werden geschnitten und an Indium-Zinn-Oxid (ITO)-Glas-Objektträger beschichtet. Spektren werden erworben durch die MALDI-System mit einer räumlichen Auflösung bis zu 20 µm. Sinapinic Säure (SA) ist gleichmäßig auf der Folie verwenden entweder eine automatische oder eine manuelle Spritze hinterlegt. Mit den aktuellen technischen Vorteilen der MALDI-IMS erhalten Sie ein typischen Datensatz von Aβ-Gattungen innerhalb der gleichen Abschnitte des menschlichen autopsied Gehirne ohne spezifische Sonden. Darüber hinaus mit hoher Auflösung (20 µm) Bildgebung eines AD Gehirn und schweren CAA-Beispiel zeigt deutlich, dass Aβ1-36 Aβ1-41 in Leptomeningeal Gefäße, abgelagert wurden, während Aβ1-42 und Aβ1-43 in zerebralen Parenchym als senile Plaques (SP) abgelagert wurden. Es ist möglich, MALDI-IMS als einen Standardansatz in Kombination mit klinischen, genetischen und pathologische Beobachtungen im Verständnis der Pathologie des AD, CAA, anzunehmen und anderen neurologischen Erkrankungen auf Basis der aktuellen Strategie.
Introduction
Um die Diagnose zu stellen und der Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen zu verstehen, ist genaue molekulare Identifizierung der pathologischen Ablagerungen wichtig1. Im Zuge der AD, Aβ produziert, um SPs in der zerebralen Parenchym zu machen und in Gefäßen abgelagert lange vor Krankheit Beginn2,3,4,5,6. Aβ1-42 ist das vorherrschende Peptid in der SP AD Gehirne, andere Aβ-Varianten, z. B. N-terminale oder C-terminale abgeschnitten oder Aβs geändert, auch in betroffenen AD Gehirne7,8,9identifiziert werden, 10. Ein vollständiges Bild von der breiten Palette von Aβ-Arten im menschlichen Gehirn, vor allem mit AD und zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA)11, hilft Wissenschaftlern Aβ-Produktion, Stoffwechsel und Ablagerung zu verstehen.
Als der klassische Ansatz der Neuropathologie wurde Immunhistochemie (IHC) die schlüssigste Methode zur Bestimmung der Lage des Aβs im Gehirn Gewebe12,13,14,15. Im Allgemeinen kann IHC Moleküle nicht unterscheiden, wenn mehrere Epitope gleichzeitig koexistieren. Im Gegensatz dazu ist eine aufstrebende Massenspektrometrie-basierte Proteomic Analyse einen wertvollen Ansatz vor allem für die Analyse von einer Vielzahl von Aβ-Arten im Hirngewebe, die mit Antikörpern16,17unterscheiden lassen. Die konventionellen Massenspektrometrie-basierte Analyse von Gehirn Lysates und Immuno-ausgefällt Proben nicht kleinere Aβ-Peptide erkennen und verliert Verteilungsinformationen von Aβ im Hirngewebe.
In früheren Arbeiten war Visualisierung von Aβ-Ablagerungen im Gehirn der Maus mit einem transgenen Tiermodell von AD, z. B. APP23 erfolgreich. Dieser Prozess benötigt allerdings noch technische Weiterentwicklungen, IMS und IHC in Bezug auf Auflösung und Empfindlichkeit18,19,20zu vergleichen. AD Neuropathologie auf menschliche Gehirne untersucht werden, und wir auf menschlichen Autopsie Hirngewebe MALDI-IMS-Technologie verwendet, um umfassende Protein Mapping21zu erhalten. Zu diesem Zweck entwickelten wir ein Protokoll für eine erweiterte Art der Massenspektrometrie, das Vorteile in seiner Schnelligkeit, Sensitivität und Reproduzierbarkeit.
Protocol
Hier sammelten Gewebeproben im Tokyo Metropolitan Geriatrische Krankenhaus bietet Community-basierte medizinische Dienstleistungen für die ältere Bevölkerung in Japan. Die Gehirn-Autopsie-Proben in der Studie verwendeten waren der Gehirn-Bank für Aging Forschung (BBAR) die Einwilligung der Angehörigen des Erblassers registriert. Die BBAR ist von der Ethikkommission der Tokyo Metropolitan geriatrische Klinik und Institut für Gerontologie zugelassen. Für alle Gehirne in der Gehirn-Bank registriert erhielten wir schriftliche informierte Zustimmung für ihren Einsatz für die medizinische Forschung von den Patienten oder deren Familien. Die Patienten wurden in einem Raum kalt (4 ° C) innerhalb von 2 h nach dem Tod, postmortale Veränderungen im Gehirn zu reduzieren platziert. Alle hier beschriebene Methoden wurden für Alternsforschung, Tokyo Metropolitan geriatrische Klinik und Institut für Gerontologie der Doshisha Universität und der Gehirn-Bank genehmigt.
1. Vorbereitung von Gewebeschnitten für IMS
- Verarbeitung Gewebeprobe eines menschlichen Gehirns Autopsie
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Probe Vorbereitungsschritt für IMS den ursprünglichen Zustand des Gewebes bewahrt. Vermeiden Sie Verunreinigungen und Post-Mortem-Änderungen. Der folgende Schritt ist entscheidend.- Gehirne, die entfernt wurden, verarbeitet und gespeichert bei-80 ° C innerhalb von 8 h Post-mortem einzuholen Sie menschlichen kortikalen Exemplare für IMS. Nehmen Sie das Gehirn Exemplar aus der okzipitalen Kortex von Alzheimer-Patienten und Kontrollen Alter abgestimmt21.
- Vorbereitung der gefrorene Gewebeschnitte
- Geschnitten Sie die Gewebeschnitte auf einem Kryostat. Leitfähige ITO-beschichtete Glasobjektträger innerhalb der Kryostat21zu platzieren.
- Wärmen Sie die Autopsie-Gehirn-Probe von-80 ° C bis-22 ° C im Inneren des Kryostaten.
- Legen Sie eine neue Einweg Klinge auf Kryostaten für jedes Experiment. Immer versuchen Sie, einen sauberen Teil der Klinge verwenden.
- Setzen Sie die gefrorenen Autopsie Gehirne auf der Bühne zusammen mit einer kleinen Menge OCT Verbindung (genug, um den zentralen Bereich der Bühne; decken siehe Tabelle der Materialien).
- Wählen Sie die Bedingungen für dünn schneiden. Verwenden Sie für IMS eine Dicke von 10 – 12 μm für menschliche Gehirn Abschnitte. Schneiden Sie für IMS und IHC fünf bis sechs Abschnitte aus jede Gewebeprobe.
- Wenn die Klinge gerade erst anfangen ist, um das Gewebe zu schneiden, drehen Sie das Rad und "Gesicht" der Block, bis aller Gewebe freiliegt. Warten Sie über den Abschnitt gibt es einen kleinen Streifen oder riss ein wenig mehr in den Kryostaten bis die Temperaturanpassung automatisch behebt. Zählen Sie ein paar Sekunden vor dem Öffnen der Anti-Roll mit einem Taschentuch unter.
- Legen Sie sofort die Gewebe-Scheibe auf der ITO-beschichtete Seite des gläsernen Objektträger. Tauen Sie das Gewebe Slice indem man einen Finger unter der Folie auf die ITO-unbeschichteten Seite. Das Gewebe wird zur Folie kleben; Stellen Sie sicher, dass das Gewebe so flach wie möglich ohne Falten ist. Führen Sie diesen Schritt bei Raumtemperatur.
Hinweis: Tragen Sie Handschuhe, Masken und ein Labor-Kleid, weil der humanen Proben biologischen Verunreinigungen enthalten können. Wenn alle Abschnitte für den Tag vorgenommen wurden, Reinigen der Kryostat, Bürsten und Chucks mit Labor-Feuchttücher und 200 mL 100 % Ethanol.
- Spülen die Gewebeschnitte
- Tauchen Sie die Proben in 40 – 100 mL 70 % igem Ethanol für 30 s, endogene Lipide und anorganische Salze zu entfernen. Verwenden Sie ein Glas Glas Färbung.
- Waschen Sie die Proben mit 40 – 100 mL 100 % Ethanol für 30 s, 40 – 100 mL Carnoy Lösung für 3 min, 40 – 100 mL 100 % Ethanol für 30 s, 40 – 100 mL 0,1 % Trifluoroacetic Säure (TFA) für 1 min und 40 – 100 mL 100 % Ethanol 30 S. Zwecken ein Glas Färbung von Glas.
Hinweis: Carnoy Lösung ist ein Fixiermittel, bestehend aus sechs Teilen Ethanol, drei Teile Essigsäure und Chloroform ein Teil. - In einem Vakuum für 30 min trocknen.
- Behandlung von Gewebeschnitten mit Ameisensäure Dampf für eine bessere Ionisation der Aβ Proteine aus Autopsie Hirngewebe
- Bereiten Sie den Ofen und Inkubation Objektträger für die anschließende Verdampfung mit 5 mL 100 % Ameisensäure verwendet werden. Um eine zufrieden stellende Säurebehandlung zu erreichen, halten Sie die Luftfeuchtigkeit in der Inkubation Glasschale auf Sättigungsniveau in diesem Schritt und halten Sie die Temperatur bei 60 ° C. Die Gewebe-Folien in der Inkubation Glasschale unter Vermeidung Untertauchen in der Ameisensäure und 6 min beschallen.
- Nehmen ein optisches Bild der Proben mit einem Filmscanner, Gel-Scanner oder einer digitalen Mikroskop usw. führen Sie diesen Schritt bei Raumtemperatur. Die Ausrichtung des optischen Bildes der Proben ist notwendig, wenn das Probe-Ziel im Inneren des Gerätes befindet. In der Regel werden nicht möglich, Abschnitt Gewebe unter der Matrixschicht zu erkennen.
Hinweis: Der bequemste Weg, um ein optisches Bild nehmen soll einen Büro-Scanner verwenden. Es ist eine gute Idee, das Bild in der Bildgebung Daten-Speicher-Ordner zu speichern. - Um die optische Bilder mit den Proben zu korrelieren, machen Sie Guide-Marken, die in das optische Bild und unter der Matrixschicht in die Kamera-Optik sichtbar sind. Am einfachsten ist es, vor Ort mindestens drei Korrektur Fluid Markierungen um die Probe vor der Einnahme des optischen Bildes.
- Matrix Anwendung
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Vorbereitung der Matrix-Lösung
- In einem organischen Lösungsmittel-toleranten Reaktionscup bereiten eine 10 mg/mL SA-Lösung in 50 % Acetonitril (ACN) und 0,1 % TFA. Gründlich auflösen der SA Verbindung durch aufschütteln oder kurze Beschallung für 10 min. Store die Lösung bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung.
Hinweis: Es gibt drei verschiedene Optionen für Matrix Spritzen: mit einem Airbrush, ein Ultraschall-Zerstäuber oder eine automatische Spritze.
- In einem organischen Lösungsmittel-toleranten Reaktionscup bereiten eine 10 mg/mL SA-Lösung in 50 % Acetonitril (ACN) und 0,1 % TFA. Gründlich auflösen der SA Verbindung durch aufschütteln oder kurze Beschallung für 10 min. Store die Lösung bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung.
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Sprühen die Matrix mit einer airbrush
- Führen Sie den Vorgang bei konstanter Raumtemperatur (20-23 ° C) und Luftfeuchtigkeit (40 – 60 %). Die Parameter anpassen für optimale Spritzen enthalten die Größe der Tropfen, die Höhe der Nebel, den Winkel und die Entfernung zwischen der Sprühdüse Abschnitt Gewebe und Labor Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Einstellen Sie diese Bedingungen durch Überprüfen der Mikroskopie Ergebnisse.
Hinweis: Kleiner als limitierende Faktoren der Kristallgröße und Homogenität des Matrix-Abdeckung und die unerwünschte Migration/Verbreitung von Analyten gehören, ist besser für die Tropfengröße. Homogenität ist auch der Punkt der Inspektion.
- Führen Sie den Vorgang bei konstanter Raumtemperatur (20-23 ° C) und Luftfeuchtigkeit (40 – 60 %). Die Parameter anpassen für optimale Spritzen enthalten die Größe der Tropfen, die Höhe der Nebel, den Winkel und die Entfernung zwischen der Sprühdüse Abschnitt Gewebe und Labor Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Einstellen Sie diese Bedingungen durch Überprüfen der Mikroskopie Ergebnisse.
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Sprühen die Matrix mit einer Ultraschall-Sprühgerät
- Entfernen Sie das Gewebe aus der Exsikkator gesprüht werden und legen Sie sie in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe das Sensorfenster nicht verdeckt ist.
- Starten Sie die Vorbereitung durch die Start -Taste drücken; Vorbereitungszeit ist in der Regel rund 90 Minuten. Die Vorbereitung wird automatisch geregelt, über die Überwachung der Matrix Schichtdicke und Nässe. Nachdem die Vorbereitung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Folie und speichern Sie es in den Exsikkator für 15 min vor dem Lesen in der MALDI-Instrument.
- Reinigen Sie die Spritze mit 2 – 3 mL 100 % MeOH bis den Sprühkopf erscheint zu reinigen.
Hinweis: Ein feiner Nebel Matrix Tropfen darf versinken in das Gewebe durch ein Gravitations Blatt. Eine durchschnittliche Tröpfchengröße von 20 μm entsteht; alle Tröpfchen Durchmesser sind weniger als 50 μm.
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Sprühen die Matrix mit einer automatischen sprayer
- Sprühen Sie die Matrixlösung auf der Gewebeoberfläche, mit einer automatischen Sprayer. Einen konstanten Fluss der beheizten Hülle Gas (N2, eingestellt auf 10 Psi und 75 ° C) wird gemeinsam mit dem Matrix-Lösung Spray geliefert werden. Verwenden Sie ein Lösungsmittel Pumpensystem (eingestellt auf 10 Psi und 0,15 mL/min), die Matrixlösung zu liefern.
Hinweis: Arbeiten Sie am wichtigsten ist, unter einem Sicherheitsschrank, Einatmen von Aerosolen Matrix zu vermeiden. Kontrolle der Raumtemperatur und Luftfeuchtigkeit, homogene Matrix Kristallisation zu reproduzieren.
- Sprühen Sie die Matrixlösung auf der Gewebeoberfläche, mit einer automatischen Sprayer. Einen konstanten Fluss der beheizten Hülle Gas (N2, eingestellt auf 10 Psi und 75 ° C) wird gemeinsam mit dem Matrix-Lösung Spray geliefert werden. Verwenden Sie ein Lösungsmittel Pumpensystem (eingestellt auf 10 Psi und 0,15 mL/min), die Matrixlösung zu liefern.
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Vorbereitung der Matrix-Lösung
2. MALDI-IMS
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Durchführen Sie ultraschnelles Massenspektrometrie.
- Hoher Durchsatz und hohe räumliche Auflösung imaging Experimente durchführen, mit MALDI-IMS-ausgestattet mit einem nd: YAG 10kHz (355 nm) Laser.
- Definieren Sie für Massenspektrometrie Messungen die Gewebe-Bereiche mit Hilfe der MALDI-Steuerungs-Software und Software zur Datenanalyse.
- Erwerb von Spektren in einem positiven linearen Modus mit einem Massenbereich von 2.000 – 20.000 m/Z und einer räumlichen Auflösung von 20 bis 100 µm.
- Um die Kalibrierung standard machen, auflösen, Kalibrierstandards Peptid und Protein Kalibrierstandards mit einem Verhältnis von 1:4 mit Alpha-Cyano-4-Hydroxyl-cinnamic Acid (CHCA) in TA30 Lösung (ACN:0.1% TFA = 30: 70) und verdünnen Sie es 10 X. Platz 1 μL der Kalibrierung standard auf der Folie an vier verschiedenen Standorten.
- Mit molekularen Histologie-Software (siehe Tabelle der Materialien), Überlagerung mehrerer Einzelbilder, die räumliche Korrelation der verschiedenen Signale, wie z. B. verschiedene Aβ-Peptide in SPs und Arterienwände colocalizing zu finden.
(3) die Verarbeitung der Daten
- Richten Sie für die spektral Ausrichtung alle Spektren zu einer ausgewählten m/Z-Liste aus einer früheren Veröffentlichung21.
- Software zur statistischen Analyse der MALDI-IMS-Datensatz importieren (siehe Tabelle der Materialien) mit Grundlinie Subtraktion.
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Regionen von Interesse (ROIs) basierend auf histologischen wissen zu verfolgen.
- Eine Univariate Analyse durchführen, für die mittlere Intensitäten, Standardabweichungen, Aufdeckung von diskriminierendem m/Z-Marker (ROC-Analyse), Hypothesentests und Entdeckung des colocalized m/Z-Werte.
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Erstellen Sie eine Segmentierung Karte.
- Führen Sie eine unbeaufsichtigte multivariate Analyse für die räumliche Segmentierung von großen Datasets und ein Komponenten-Analyse für die Gewinnung von Grundtendenzen.
- Wählen Sie anatomische ROIs basierend auf histologischen Merkmale, z. B. Parenchym und den Subarachnoidalraum.
- Weisen Sie Strukturen als individuelle ROIs und Korrelieren sie mit MS Daten um die damit verbundenen Peptide zu identifizieren, die die Bild Segmentierung der Region erlaubt.
Representative Results
Sporadische Alzheimer-Patienten mit CAA (n = 5; mittleres Alter = 83,2 y) und im Alter von Probanden mit senilen Plaques frei (SP-O) und CAA (n = 5; mittleres Alter = 77,2 y) wurden analysiert (Tabelle 1). Die CAA-Phänotypen der Patient #3 wurden in dieser Studie prominentesten. Verteilungen der Aβ1 40 und Aβ1-42 Ablagerungen im Gehirngewebe von Patienten #3 wurden mit MALDI-IMS (Abbildung 1) visualisiert. In nichtpathologischer Kontrolle Gehirnen (Patienten #9 und #10), gab es keine signifikante Signale, wie in Abbildung 1dargestellt. MALDI-IMS visualisiert hier deutlich, dass Aβ1-42 in der zerebralen Parenchym vorzugsweise als SPs hinterlegt wurde. Im Gegensatz dazu, wurden kürzere Aβs, wie Aβ1-36, 1-41, abgelagert bevorzugt auf Leptomeningeal vaskulären Bereich (Abbildung 1).
Verteilung von Aβ40 und Aβ42 wurden mit IHC mit angrenzenden Gefrierschnitte der Gewebe weiter validiert. Der Anti-Aβ40-Antikörper mit der Bezeichnung CAA (Pfeile in Abb. 2 b), die im deutlichen Gegensatz zu der Verteilung der Aβ42 in der zerebralen Parenchym als SPs ist. Für Aβ1-41 wir sind die ersten, die dieses Fragment im menschlichen Gehirn zu erkennen, und wir haben spezifische Antikörper, die Aβ41 von Aβ40 andAβ4221unterscheiden können generiert.
Die räumliche Auflösung der MALDI-IMS ist in der Regel der wichtigste Faktor verbessert werden. Zeigen Sie in Abbildung 1 und Abbildung 2 MALDI-IMS mit einer 100 µm-Pitch-Auflösung und erhalten Sie ein Gesamtprofil Verteilung für einen relativ weiten Bereich21zu. Es ist schwierig, Amyloid Ablagerungen genau an den Subarachnoidalraum, einschließlich vaskuläre Struktur zu definieren. Feine Gewebestrukturen subarachnoidale Schiffe und die Oberfläche des Kortex, darzustellen hochauflösende MALDI-Imaging (40 µm: Abbildung 3; 20 µm: Abbildung 4 und Abbildung 5) wurde durchgeführt. Infolgedessen zeigte MALDI-IMS deutlich, dass kürzere Aβs, wie Aβ1-36, 1-41, vergleichbar mit IHC in den Wänden der Arterien, verteilt werden.
MALDI-IMS demonstriert die detaillierte Verteilungen der Aβx 40 und Aβx-42 (X = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 11pE) n. Chr. mit moderaten CAA Gehirn begleitet. Während Aβx-40 Arten ein ähnliche Verteilungsprofil an Aβ1-40 zeigte, zeigte Aβx-42 Arten beispielsweise eine unterschiedliche Verteilungsmuster mit Aβ1-4221. Durch das aktuelle Protokoll werden einzelne Ionen-Bilder der einzelnen Aβ-Peptide beobachtet mit MALDI-IMS Aβ Arten zugeordnet. Im Gegensatz dazu erwarb Bild, das Daten mit unbeaufsichtigten multivariate Statistik Erlangung Bild Segmentierung der anatomischen Regionen von Interesse für die weitere Analyse der undefinierten Proteine untersucht werden können. Abbildung 5 zeigt eine Segmentierung-Karte mit einer bisecting angewendet, um den gleichen Abschnitt von Patient #321k-Means-Analyse zu erhalten. Diese Cluster Methode identifiziert erfolgreich Plaque-artige Strukturen in das Parenchym (blau in Abb. 5) und vaskulären Strukturen in den Subarachnoidalraum (grün in Abbildung 5). Es ist interessant zu erfahren, eine kleine Kreisfläche in das Parenchym der erkannt wird, nur um eine kleine Arteriola in das Parenchym sowie in den Subarachnoidalraum (lila in Abbildung 5). Dies wird von einzelnen Ion Bilder dieser einzelnen Aβ-Peptide in Abbildung 5überprüft-5F.
Abbildung 1: MALDI-IMS eine gefrorene AD/CAA Gehirn Abschnitt. Verschiedene C-terminale abgeschnitten Aβ Peptide in AD begleitende schwere CAA (Patient #3) werden im rechten Fensterbereich im linken Panel und Kontrollen (Patient #9 rechts und Patient #10 auf der linken Seite in allen Bildern) visualisiert. Aβ1-36 Aβ1-41 sind bevorzugt in Leptomeningeal Blutgefäße abgelagert, während Aβ1-42 und Aβ1-43 in der zerebralen Parenchym als senilen Plaques abgelagert werden für den Fall, dass #3, zwar gab es kein Signal in der Kontrollpatienten Gehirne (Fälle #9 und #10). Auflösung = 100 μm. Maßstabsleiste = 5 mm. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Kakuda Et Al.21geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: MALDI-IMS von gefrorenen AD/CAA Gehirn-Abschnitte und angrenzenden Abschnitte des okzipitalen Kortex aus AD Gehirn. (A - C) der AD/CAA Gehirn Gefrierschnitte (D und E) angrenzenden Abschnitte des okzipitalen Kortex aus AD Gehirn waren immun-gefärbten und konzentrierte sich auf Arteriola und zerebralen Parenchym mit Antikörpern gegen Aβ40 (D: BA27) oder Aβ42 (E: Anti-Aβ42 polyklonale). Beide Analysen gezeigt, dass Aβ40 bevorzugt in Leptomeningeal Blutgefäßen (Pfeile im Bedienfeld " D") und Arteriolen in den Subarachnoidalraum und der zerebralen Parenchym bilden CAA hinterlegt ist. Im Gegensatz dazu ist Aβ42 hauptsächlich in SPs hinterlegt. Für IMS, Auflösung = 100 μm. Maßstabsleiste = 5 mm (A, Bund C) = 5 mm, 500 (D und E). Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Kakuda Et Al.21geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: MALD-IMS von gefrorenen AD/CAA Gehirn Abschnitte (Patient #3) bei einer Auflösung von 40 µm. Verschiedene C-terminalen und N-terminale abgeschnitten und Aβ-Peptide in AD begleitende schwere CAA (Patient #3) geändert. Aβ1-36 Aβ1-41 sind bevorzugt in Leptomeningeal Blutgefäße abgelagert, während Aβ1-42 und Aβ1-43 in der zerebralen Parenchym als senilen Plaques abgelagert werden. Skalieren von Balken = 1 mm (A-B), 2 mm (oben links). Auflösung = 40 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: MALDI-IMS von gefrorenen AD/CAA Gehirn Abschnitte (Patient #3) mit einer Auflösung von 20 µm. Dieses Panel zeigt verschiedene C-terminalen und N-terminale abgeschnitten und Aβ-Peptide in AD begleitende schwere CAA (Patient #3) geändert. Aβ1-36 Aβ1-41 sind bevorzugt in Leptomeningeal Blutgefäße abgelagert, während Aβ1-42 und Aβ1-43 in der zerebralen Parenchym als senilen Plaques abgelagert werden. Skalieren von Balken = 200 μm (a, b, C), 1 mm (oben links). Auflösung = 20 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Segmentierung Karte, erhalten durch MALDI-IMS von einem AD Gehirn Gefrierschnitte zeigt vermeintliche senilen Plaques, großes subarachnoidale Schiff Strukturen und kleine parenchymatösen Arteriolen. (A) Segmentierung Karte aus einer multivariaten Bildanalyse von MALDI-IMS-Daten gewonnen. (B) Bisecting k-Means-basierte Cluster Analyse Plaque-Like und Schiff-wie Strukturen im okzipitalen Kortex identifiziert. Die Cluster und Unterkonstruktionen und ihre Beziehungen werden als Knoten (e.g.,1-0-0) angezeigt. (C) unterschiedliche Aβ-Peptid Lokalisierung Muster ähnlich Plaketten (blau), subarachnoidale Schiffe (grün) und Arteriola (rot) Strukturen. Beachten Sie, dass ein paar rote Cluster auch in den Subarachnoidalraum verteilt sind. Dies wird von einzelnen Ion Bilder dieser einzelnen Aβ-Peptide mit einer 20 µm Auflösung überprüft: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41 und (F) Aβ 1-42. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Fall | Geschlecht | Alter bei Tod | Braak SP | CAA |
| 1 | M | 83 | C | 0,5 |
| 2 | M | 88 | C | 1 |
| 3 | M | 84 | C | 2 |
| 4 | M | 78 | C | 1 |
| 5 | M | 83 | C | 1 |
| 6 | M | 84 | O | 0 |
| 7 | M | 78 | O | 0 |
| 8 | M | 70 | O | 0 |
| 9 | M | 73 | O | 0 |
| 10 | M | 81 | O | 0 |
Tabelle 1: klinische und pathologische Daten von AD mit CAA Fällen und im Alter von SP O. Menschlichen kortikalen Exemplare für IMS und IHC wurden von der Brain-Bank am Tokyo Metropolitan Institut für Gerontologie erhalten. Jedes Gehirn-Muster stammen von der okzipitalen Kortex von fünf Alzheimer-Patienten und fünf Steuerelemente Alter abgestimmt. Das Ausmaß des Amyloid Ablagerungen wie gezeigt von einem Aβ monoklonale Antikörper wurde etappenweise Braak SP (Amyloid) bezeichnet. In Phase O gibt es fast keine senilen Plaques in den Isocortex. In Stadium C sind praktisch alle Isocortical Bereiche betroffen. AD-Gehirne sind unveränderlich in Phase C. Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung von Kakuda Et Al.21geändert.
Discussion
Hier zeigten wir ein detailliertes Protokoll und Ergebnisse der Visualisierung von Aβ und seine Isoformen aus mehreren autopsied Gehirne mit AD und CAA mit MALDI-IMS. Die Ablagerung Profil des Aβs änderte drastisch aus Aβ1-42 in N und C-terminalen Variationen. Aβ1-41 wurde zum ersten Mal identifiziert und im menschlichen Gehirn mit dem aktuellen Protokoll visualisiert und mit IHC21weiter validiert wurde. Wenn man bedenkt, dass die Morphologie der hinterlegten Aβ von IMS mit einer hochauflösenden Analyse (20 μm) muss in guter Übereinstimmung mit IHC, tragen IMS und IHC gleichermaßen zur Unterscheidung von Aβ-Einlagen durch ihre Lage und Proteingehalt sowie durch ihre Morphologie. Da das gesamte Experiment hier beschriebenen im okzipitalen Kortex durchgeführt wurde, wird die Lokalisierung von Beta-Amyloid-Arten in allen Gehirnregionen zu studieren mit weiteren Untersuchungen über das aktuelle Protokoll verallgemeinert werden.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls sind Gewebe Vorbereitungsschritte, eine effektive Ionisierung der aggregierten Proteinen im menschlichen Gehirn Gewebe zu erhalten. Eine Matrixschicht ist erforderlich, um die Laserenergie absorbieren und Desorption und Ionisation des Analyten zu induzieren. In diesem Prozess wird ein gesamte Gewebe Abschnitt homogen mit kleinen Kristallen beschichtet. Homogene Cocrystallization des Analyten mit der Matrix ist entscheidend für hohe Empfindlichkeit und artefaktfrei Imaging. Jede der drei Spray Methoden hat seine eigenen Vorteile. Manuelle Spritzen gehört zu den am häufigsten verwendeten Methoden. Ein Airbrush ist praktisch; Es erfordert jedoch geschickte Bedienung. Präzise und reproduzierbare experimentelle Technik unverzichtbar ist, wird mit einem Ultraschall Sprüher und/oder eine automatische Spritze wie beschrieben in die aktuellen Protokolle empfohlen. In Bezug auf ein Ultraschall Sprüher wird es nicht durch die Feuchtigkeit und die Temperatur des Raumes beeinflusst werden, weil es in eine Kammer gesprüht wird. Unterdessen wird durch eine automatische Spritze relativ erhaltener räumlicher Auflösung mit guter Reproduzierbarkeit erreicht. In der Regel die räumliche Auflösung erreicht mit der Erhöhung der drei Methoden in der Reihenfolge der Airbrush (1), (2) automatische Geräte- und (3) Ultraschall Sprüher.
Am wichtigsten ist, wurde dieses Protokoll ursprünglich generiert, um zu erkennen und Aβs im menschlichen Gehirn Autopsie Proben zu visualisieren. Die Visualisierung von Aβs mit MALDI-IMS für APP23 Mäuse, die als Tiermodell Werbeanzeige auf der Grundlage der Schwedisch-Art Mutation des menschlichen APP erzeugt wird, wurde früher von anderen mit einer bestehenden Methode18,19berichtet. Das ehemalige Protokoll angewendet APP23 reichte jedoch nicht, Aβ in seine laterale Auflösung und Empfindlichkeit zu visualisieren. Frühere Arbeiten besprochen, daß hohe Aβ-Konzentrationen außerhalb der Begrenzungen des Gewebes sind eindeutig Artefakte im APP23 Bildgebung mit ihrem Protokoll18,19. Das bedeutet, dass die so genannte "zwischen realen SPs und IMS Bilder aufgrund der Matrix Extraktionsschritt Unschärfe" mit MALDI-Typ Bildgebung unvermeidlich war. Jedoch in das aktuelle Protokoll die Unschärfe verschwand und jedes Spektrum vertreten alle Einzel-SP in der Anwesenheit von.
Wie hier gezeigt, wir können Aβ1-41 n. Chr. erstmals verfolgen und CAA Gehirne mit MALDI-IMS sowie mit IHC, mit einem spezifischen Antikörper durch unsere eigene Generation21. Nach der Aβ-Verarbeitungsmodell leitet sich Aβ1-38 von der Aβ1-45 über Aβ1-42, während Aβ1-45 von γ-Sekretase schrittweise Spaltung27,28,29,30,31 Aβ1-41 abgeleitet . Dies bedeutet, dass das aktuelle Protokoll dieses Modell unterstützt. Für die Grenzen dieser Technik müssen wir die Heterogenität der Proben aus menschlichen Autopsie Gehirn betrachten. Der wichtigste Schritt, in gewisser Weise ist qualifizierte Autopsie Hirngewebe mit ethischen Beweis zu beurteilen. Mit dem aktuellen Protokoll über diese qualifizierten Autopsie Hirngewebe können MALDI-IMS individuell verfolgen den gesamten Vertrieb komplexer Moleküle, nachdem mehrere Modifikationen sowie unbekannte zur Regulierung der Pathogenese der AD, die noch zu definiert. Darüber hinaus muss die allgemeine Pathogenese der verschiedenen Neuropathologie in Alter menschliche Gehirne zu verstehen, es MALDI-IMS als einen Standardansatz in Kombination mit klinischen, genetischen und pathologische Beobachtungen bei neurologischen Erkrankungen übernehmen durchführbar .
Ein weiterer entscheidender Schritt der MALDI-IMS ist Data-Mining-Prozess aus dem gewonnenen Datensatz, welcher immer zeitaufwändig. Manuelle Data-Mining für jede Distribution Peak muss die Benutzer klicken sich durch jedes Bild und suchen Sie nach Distributionen, die auf die Morphologie der analysierten Probe korrelieren können. Automatische räumliche Segmentierung kann als erster Schritt der Daten Bergbau, bietet eine Übersicht der eingestellten Daten und ermöglicht die schnelle Erkennung von herausragenden Merkmale verwendet werden. Bei diesem Ansatz Ähnlichkeiten zwischen Spektren einer bestimmten Region werden statistisch bestimmt und ähnliche Spektren in einem Cluster gruppiert sind. Alle Pixel sind farblich gekennzeichnet, entsprechend ihrer Cluster-Zuordnung (Abbildung 5). In der vorliegenden Studie AD/CAA ist der Bereich von Interesse der Raum der Aβ-Ablagerungen in parenchymatösen Plaque und den Subarachnoidalraum und parenchymatösen vaskulären Strukturen. Die zwei markanten Gipfel mit IHC weiter validiert wurden waren die m/Z-Werte von Aβ1 40 und Aβ1-4221. So ist es einfach, colocalized m/Z mit Aβ1 40 und Aβ1-42, die bereits kommentierte, N und C-terminalen abgeschnittene Aβ sowie unbekannte Peptide zur weiteren Analyse zu finden.
Weller und Kollegen haben berichtet, dass Aβ in Gefäßwänden, mehr um Arterien als um21Adern ansammelt. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass die interstitielle Flüssigkeit (ISF) Aβs enthält, die Lymphknoten über eine perivaskuläre Entwässerung Weg22,23,24,25 aus der zerebralen Parenchym ausgeschieden ,26. Das aktuelle Protokoll eine Segmentierung Karte basierend auf einem MALDI-IMS-Daten-Satz mit einer 20 µm Auflösung generieren unterstützt die mögliche Existenz von perivaskuläre Entwässerung Wege des Gehirns (Abbildung 5), die wesentlich, CAA in AD21 beitragen , 32. Darüber hinaus können wir entdecken, Markerproteine colocalized mit Plakette und subarachnoidale Gefäßsystem durch die Berechnung der Korrelation von jedem m/Z-Werten. Es muss für das Verständnis der allgemeine Pathogenese der verschiedenen Neuropathologie in Alter menschliche Gehirne, machbar, MALDI-IMS als ein leistungsfähiger Ansatz in Kombination mit etablierten IHC Daten von klinischen, genetischen und pathologische Beobachtungen bei neurologischen anzunehmen Krankheiten.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen unterstützt (Gehirn Protein Altern und Demenz Kontrolle 26117004; M.I und th.M.). Diese Forschung wurde teilweise durch die strategische Forschungsprogramm Brain Sciences von der Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) unterstützt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien ankommen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
| Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
| O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
| Scanner | EPSON | GT-980 | |
| Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
| Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
| Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
| Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
| Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
| Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
| MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
| Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
| Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
| Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
| Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
| Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |
References
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