Summary
Molekylær bildebehandling med matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering-basert bildebehandling massespektrometri (MALDI-IMS) tillater samtidig tilordning av flere analytter i biologiske prøver. Her presenterer vi en protokoll for oppdagelse og visualisering av amyloid β protein på hjernen vev av Alzheimers sykdom og cerebral amyloid angiopathy prøver ved hjelp av MALDI-IMS.
Abstract
Neuropathology av Alzheimers sykdom (AD) er preget av Oppsamling og aggregering av amyloid β (Aβ) peptider i ekstracellulære plaketter av hjernen. Aβ-peptider som består av 40 aminosyrer, genereres fra amyloid forløper proteiner (APP) av β - og γ-secretases. Aβ er avsatt ikke bare i cerebral parenchyma, men også i leptomeningeal og cerebral fartøy vegger, kjent som hjerne amyloid angiopathy (CAA). Mens en rekke Aβ peptider ble identifisert, detaljert produksjon og distribusjon av individuelle Aβ peptider i patologisk vev annonse og CAA har ikke fullt adressert. Her utvikle vi protokollen matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering-basert bildebehandling massespektrometri (MALDI-IMS) på menneskelig obduksjon hjernen vev å få omfattende protein kartlegging. For dette formålet, ble menneske kortikale prøver innhentet fra hjernen banken på Tokyo Metropolitan Institute av Gerontology. Frosne cryosections kuttes og overført til indium-tin-oxide (ITO)-belagt glass lysbilder. Spectra er ervervet ved hjelp av MALDI systemet med en romlig oppløsning opptil 20 µm. Sinapinic syre (SA) avsettes jevnt på lysbildet med enten automatisk eller en manuell sprøyta. Med gjeldende tekniske fordelene ved MALDI-IMS, kan en typisk sett forskjellige Aβ arter innen samme delene av menneskelig autopsied hjernen fås uten spesifikk sonder. Videre med høy oppløsning (20 µm) avbildning av en annonse hjernen og alvorlig CAA eksempel viser tydelig at Aβ1-36 til Aβ1-41 var satt inn leptomeningeal fartøy, mens Aβ1-42 og Aβ1-43 avsatt på cerebral parenchyma som senil plakk (SP). Det er mulig å adoptere MALDI-IMS som en tilnærming i kombinasjon med klinisk, genetisk og patologisk observasjoner forstå patologi annonse, CAA, og andre nevrologiske sykdommer basert på gjeldende strategi.
Introduction
For å gjøre diagnosen og forstå patogenesen av nevrodegenerative lidelser, er presise molekylære identifikasjon av patologisk innskudd viktig1. I Annonsen, Aβ er produsert for å gjøre SPs i cerebral parenchyma og deponert i fartøy lenge før sykdommen utbruddet2,3,4,5,6. Aβ1-42 er den dominerende peptid på SP AD hjerner, andre Aβ varianter, som N-terminal eller C-terminalen avkuttet eller endret Aβs, identifiseres også i berørte AD hjerner7,8,9, 10. Et fullstendig bilde av bredt spekter av Aβ arter i menneskelige hjerne, spesielt med Annonsen og cerebral amyloid angiopathy (CAA)11, vil hjelpe forskere til å forstå Aβ produksjon, metabolisme og deponering.
Som den klassiske tilnærmingen til neuropathology, har immunohistochemistry (IHC) vært den mest avgjørende metoden for å bestemme plasseringen av Aβs i hjernen vev12,13,14,15. IHC kan generelt skille molekyler når flere epitopes eksistere samtidig. En voksende masse massespektrometri-baserte proteomic analyse er derimot en verdifull tilnærming spesielt for å analysere en rekke Aβ arter i hjernen vev, som kan være med antistoffer16,17. Konvensjonelle masse massespektrometri-basert analyse av hjernen lysates og immun-igangsatte prøver svikter å merker mindre Aβ peptider og mister distribusjonsinformasjon av Aβ i hjernevevet.
I tidligere arbeider, har visualisere Aβ innskudd i musen hjerner vært vellykket bruker en transgene dyr modell av annonse, for eksempel APP23. Denne prosessen trenger imidlertid fortsatt tekniske fremskritt sammenligne IMS og IHC med hensyn til oppløsning og følsomhet18,19,20. AD neuropathology bør studeres på menneskelige hjerne, og vi brukte MALDI-IMS teknologi på menneskelig obduksjon hjernen vev for å få omfattende protein kartlegging21. For dette formålet utviklet vi en protokoll for en avansert massespektrometri som har fordeler i hurtighet, følsomhet og reproduserbarhet.
Protocol
Her ble vevsprøver samlet på Tokyo Metropolitan geriatrisk Hospital, som gir fellesskapet-baserte medisinske tjenester til eldre befolkningen i Japan. Hjernen obduksjon eksemplene brukes i studien ble registrert til hjernen banken for aldring forskning (BBAR) med samtykke av den avdøde slektninger. BBAR er godkjent av den etiske komiteen av Tokyo Metropolitan geriatrisk sykehus og Institutt for Gerontology. For alle hjernen registrert på hjernen bank, innhentet vi skriftlig informert samtykker bruke for medisinsk forskning fra pasienter eller deres familier. Pasientene ble plassert i et kaldt (4 ° C) rom innen 2 timer etter å redusere postmortem endringer i hjernen. Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av Doshisha University og hjernen banken for aldring forskning, Tokyo Metropolitan geriatrisk sykehus og Institutt for Gerontology.
1. forberedelse av vev IMS
- Behandling vev eksemplar av en menneskelig autopsied hjerne
Merk: Kontroller at prøven forberedelse skritt for IMS beholder den opprinnelige tilstanden av vev. Unngå forurensning og evaluering. Følgende trinn er avgjørende.- Få menneske kortikale prøver IMS hjernen som ble fjernet, behandlet og lagret på-80 ° C i 8 h postmortem. Ta hjernen prøven fra occipital cortex AD pasienter og alder-matchet kontroller21.
- Forberedelse av frossent
- Kuttet delene vev på en kryostaten. Plass ledende ITO-belagt glass objektglass inne kryostaten21.
- Varm obduksjon hjernen prøven fra-80 ° C-22 ° c i kryostaten.
- Legge ved en ny engangsbladet kryostaten for hvert eksperiment. Alltid prøve å bruk en ren del av bladet.
- Sette frosne obduksjon hjernen på scenen sammen med en liten mengde OCT sammensatte (nok til å dekke sentrum scenen; se Tabellen for materiale).
- Velg betingelsene for tynne snitting. IMS, bruk en tykkelse på 10-12 μm menneskelige hjerne deler. IMS og IHC, kuttet fem til seks delene fra hver Vevsprøve.
- Når bladet er bare å begynne å kutte vevet, slå hjulet og "ansikt" blokken før alle vev blir utsatt. Hvis det er en liten strek eller rive delen, vent litt mer i kryostaten til Luminance automatisk løser det. Telle et par sekunder før åpning stabiliser med et papir under.
- Umiddelbart plassere vev slice på ITO-belagt side av av objektglass. Tine vev slice ved å sette en finger under lysbildet på den ikke-ITO-belagt siden. Vevet vil holde seg til lysbildet. Kontroller at vevet er så flat som mulig med noen rynker. Utføre dette trinnet ved romtemperatur.
Merk: Bruke hansker og masker en laboratorium kjole fordi menneskelige prøvene kan inneholde biologiske forurensninger. Når alle deler er gjort for dagen, ren kryostaten, børster og hiver med laboratoriet kluter og 200 mL av 100% etanol.
- Skylling delene vev
- Fordype eksemplene i 40-100 mL 70% etanol for 30 s fjerne endogene lipider og uorganisk salter. Bruk et glass flekker glasset.
- Vask prøvene med 40-100 mL av 100% etanol for 30 s, 40-100 mL av Carnoys løsning for 3 min, 40-100 mL av 100% etanol for 30 s, 40-100 mL av 0,1% trifluoroacetic acid (TFA) for 1 min, og 40-100 mL av 100% etanol for 30 s. Bruk et glass farging krukke.
Merk: Carnoys løsning er et bindemiddel består av seks deler etanol, tre deler eddiksyre og en del kloroform. - Tørr i et vakuum i 30 min.
- Behandling av vev med en maursyre damp for en bedre ionisering Aβ proteiner fra obduksjonen hjernen vev
- Forberede av ovnen og inkubasjon objektglass skal brukes for den påfølgende fordamping med 5 mL til 100% maursyre. For å oppnå et tilfredsstillende syre behandling, holde luftfuktighet inkubasjon glass retten på fargemetning igjennom hele dette trinnet og holde temperaturen på 60 ° C. Plasser vev lysbildene i inkubasjon glass rett og unngå neddykking i maursyre og behandle for 6 min.
- Ta en optisk image av eksemplene bruker en filmskanner, gel skanner eller en digital mikroskop, etc. utføre dette trinnet ved romtemperatur. Justeringen av optisk bildet av prøvene er nødvendig når prøven målet er plassert inne i instrumentet. Vanligvis vil det ikke være mulig å gjenkjenne delen vev under matrise laget.
Merk: Den mest praktiske måten å ta en optisk image er å bruke en office-skanner. Det er lurt å lagre bildet i mappen for bildebehandling data-lagring. - Til relatere optisk bildene med eksemplene, gjør guide merker som vises både i den optisk image og under matrise laget i kameraet optikk. Den enkleste måten er å oppdage minst tre korreksjon væske merkene rundt prøven før du tar den optisk image.
- Matrix-programmet
-
Tilberedning av matrise
- I en organisk løsemiddel-tolerant microtube, forbereder en 10 mg/mL SA løsning i 50% acetonitrile (ACN) og 0,1% TFA. Grundig oppløse SA sammensatt av vortexing eller kort sonication for 10 min. Store løsningen ved romtemperatur før bruk.
Merk: Det finnes tre ulike alternativer for matrise sprøyting: bruker spraymaling, en ultralyd sprøyta eller en automatisk sprøyta.
- I en organisk løsemiddel-tolerant microtube, forbereder en 10 mg/mL SA løsning i 50% acetonitrile (ACN) og 0,1% TFA. Grundig oppløse SA sammensatt av vortexing eller kort sonication for 10 min. Store løsningen ved romtemperatur før bruk.
-
Sprøyting matrisen med en airbrush
- Utføre operasjonen på konstant romtemperatur (20-23 ° C) og luftfuktighet (40%-60%). Parameterne for å justere for optimal sprøyting inkluderer størrelsen på slippverktøyet, mengden av tåke, vinkel og avstand mellom sprededyse og delen vev og laboratoriet temperatur og luftfuktighet. Justere disse vilkårene ved å sjekke mikroskopi resultatene.
Merk: Som Begrensende faktorer inkluderer krystall størrelse og homogenitet av matrix og uønsket overføring/spredningen av analytter, mindre er bedre for størrelsen slipp. Homogenitet er også poenget med inspeksjon.
- Utføre operasjonen på konstant romtemperatur (20-23 ° C) og luftfuktighet (40%-60%). Parameterne for å justere for optimal sprøyting inkluderer størrelsen på slippverktøyet, mengden av tåke, vinkel og avstand mellom sprededyse og delen vev og laboratoriet temperatur og luftfuktighet. Justere disse vilkårene ved å sjekke mikroskopi resultatene.
-
Sprøyting matrisen med en ultralyd sprøyta
- Fjerne vevet sprayes fra desiccator og plassere den i kammeret. Kontroller at vevet ikke dekker vinduet sensor.
- Starte forberedelse ved å trykke Start -knappen; prep tid er vanligvis rundt 90 min. Utarbeidelse vil reguleres automatisk via overvåking av matrix lagtykkelse og fuktighet. Når forberedelsene er fullført, Fjern lysbildet og lagre den i desiccator i 15 min før du leser det i MALDI apparatet.
- Rengjør sprøyta med 2-3 mL 100% MeOH til spray hodet vises rene.
Merk: En fin tåke av matrix dråper er tillatt å synke inn i vevet av et gravitasjons ark. En gjennomsnittlig dråpestørrelse på 20 μm genereres; alle slippverktøy diameter er mindre enn 50 μm.
-
Sprøyting matrisen med en automatisk sprøyta
- Spray matrix løsningen på vevet overflaten med en automatisk sprøyta. En konstant flow oppvarmet skjede gass (N2, satt til 10 psi og 75 ° C) vil bli levert conjointly med matrix løsning spray. Bruke et løsemiddel pumpesystem (satt til 10 psi og 0,15 mL/min) å levere matrix løsningen.
Merk: Viktigst, fungerer under en sikkerhet regjering å unngå noen innånding av matrix aerosoler. Kontrollere rom temperatur og luftfuktighet å reprodusere homogen matrise krystallisering.
- Spray matrix løsningen på vevet overflaten med en automatisk sprøyta. En konstant flow oppvarmet skjede gass (N2, satt til 10 psi og 75 ° C) vil bli levert conjointly med matrix løsning spray. Bruke et løsemiddel pumpesystem (satt til 10 psi og 0,15 mL/min) å levere matrix løsningen.
-
Tilberedning av matrise
2. MALDI-IMS
-
Utføre ultra-high-speed massespektrometri.
- Utføre høy gjennomstrømming og høy romlig oppløsning tenkelig eksperimenter med MALDI-IMS utstyrt med en 10 kHz Nd:YAG (355 nm) laser.
- For massespektrometri målinger, definere vev områder ved hjelp av programvare for MALDI og dataanalyse programvare.
- Erverve spectra i en positiv lineær modus med en masse rekke m/z 2000-20.000 og en romlig oppløsning på 20 og 100 µm.
- For å gjøre kalibrering standard, oppløse peptid kalibrering standard og protein kalibrering standard med forholdet av 1:4 med alpha-Cyano-4-hydroksyl-cinnamic syre (CHCA) i TA30 løsning (ACN:0.1% TFA = 30:70) og deretter fortynne den 10 x. Sted 1 μL kalibrering standard på lysbildet på fire forskjellige steder.
- Benytter molekylær histology programvare (se Tabell for materiale), overlegg flere enkeltbilder finne romlige korrelasjon av ulike signaler, for eksempel ulike Aβ peptider colocalizing SPs og arterial vegger.
3. databehandling
- For spectral justering, justeres alle spektra til en valgt m/z-liste fra en tidligere publikasjon21.
- Importere MALDI-IMS datasettet til statistisk analyse software (se Tabell for materiale) med opprinnelig subtraksjon.
-
Spor regioner av interesse (ROIs) basert på histologiske kunnskap.
- Utføre en univariate analyse for mener intensiteten, standardavvik, avdekke discriminative m/z-markører (ROC analyse), hypotese tester og oppdagelsen av colocalized m/z-verdier.
-
Opprette kart segmentering.
- Utføre en unsupervised multivariabel analyse for den romlige segmenteringen av store datasett og en komponent analyse for utvinning av underliggende trendene.
- Velg anatomiske ROIs basert på histologiske egenskaper, som parenchyma og subarachnoid space.
- Tilordne strukturer som individuelle ROIs og relatere dem til MS-behandlet for å identifisere de tilknyttede peptidene som tillot bilde oppdeling av regionen.
Representative Results
Sporadiske Annonsen pasienter med CAA (n = 5; middelalder = 83,2 y) og alderen fag med senil plakk gratis (SP O) og CAA (n = 5; middelalder = 77.2 y) ble analysert (tabell 1). CAA fenotyper av pasient #3 var mest fremtredende i denne studien. Distribusjoner av Aβ1-40 og Aβ1-42 innskudd i hjernevevet fra pasient #3 var visualisert med MALDI-IMS (figur 1). Det var ingen betydelig signaler i nonpathological kontroll hjernen (pasienter #9 og #10), som vist i figur 1. Her, visualisert MALDI-IMS tydelig at Aβ1-42 fortrinnsvis avsettes som SPs i cerebral parenchyma. Derimot var kortere Aβs, som Aβ1-36 til 1-41, fortrinnsvis avsatt på leptomeningeal vaskulære områder (figur 1).
Distribusjoner av Aβ40 og Aβ42 ble ytterligere bekreftet med IHC bruke frosne deler av vev. Anti-Aβ40 antistoffer merket CAA (piler i figur 2B), som er i klart kontrast til distribusjon av Aβ42 i den cerebral parenchyma som SPs. Vi er først til å oppdage denne fragment i menneskelige hjerne Aβ1-41, og vi har generert spesifikke antistoffer som kan skille Aβ41 fra Aβ40 andAβ4221.
Den romlig oppløsningen på MALDI-IMS er vanligvis den viktigste faktoren å forbedres. I figur 1 og figur 2 viser MALDI-IMS med 100 µm pitch oppløsning og få en generell distribusjon profil for en relativt stort område21. Det er vanskelig å definere amyloid deponering akkurat på subarachnoid rommet, inkludert Vaskulær struktur. Å framstille fint vev strukturer av subarachnoid fartøy og overflaten av cortex, høy oppløsning MALDI imaging (40 µm: Figur 3; 20 µm: Figur 4 og figur 5) ble utført. Resultatet demonstrert MALDI-IMS tydelig at kortere Aβs, som Aβ1-36 til 1-41, er fordelt på veggene i blodårene, som er sammenlignbare med IHC.
MALDI-IMS vist detaljert distribusjonen av både Aβx-40 og Aβx-42 (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 11pE) i AD sammen med moderat CAA hjernen. For eksempel, mens Aβx-40 arter viste en lignende distribusjon profil til Aβ1-40, Aβx-42 arter viste en annen fordelingsmønster med Aβ1-4221. Av gjeldende protokollen tilordnes én ion bilder av personlige Aβ peptider observert med MALDI-IMS Aβ arter. Derimot kjøpt image data kan undersøkes med unsupervised multivariat statistikk for å få bildesegmentering av anatomiske regioner av interesse for ytterligere analyse av udefinert proteiner. Figur 5 viser kart segmentering oppnådd med en bisecting k-analyse på samme delen fra pasienten #321. Denne klynging metoden identifisert plakk-lignende strukturer i parenchyma (blå i figur 5C) og vaskulære strukturer i subarachnoid rommet (grønn i figur 5C). Det er interessant å finne en liten sirkulær område i parenchyma, som oppdages bare rundt en liten arteriole i parenchyma og subarachnoid space (lilla i figur 5C). Dette er bekreftet av enkelt ion bilder av disse personlige Aβ peptider i figur 5 d-5F.
Figur 1: MALDI-IMS av en frossen AD/CAA hjernen delen. Ulike C-terminalen avkortet Aβ peptider i AD følger alvorlig CAA (pasientens #3) kan visualiseres i informasjonsvinduet og kontroller (pasientens #9 til høyre og pasienten #10 til venstre i alle bilder) i panelet til høyre. Aβ1-36 til Aβ1-41 settes fortrinnsvis i leptomeningeal blodkar, mens Aβ1-42 og Aβ1-43 er avsatt i cerebral parenchyma som senil plaketter i tilfelle #3, mens det var ingen signal i kontroll pasientene hjerne (tilfeller #9 og #10). Oppløsning = 100 μm. Skala bar = 5 mm. Dette tallet er endret med tillatelse fra Kakuda et al.21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: MALDI-IMS av frosne AD/CAA hjernen seksjoner og deler av occipital cortex fra AD hjerner. (A - C) frosne AD/CAA hjernen inndelingene og (D og E) deler av occipital cortex fra AD hjernen var immun-farget og fokusert på arteriole og cerebral parenchyma, bruker antistoffer mot Aβ40 (D: BA27) eller Aβ42 (E: anti-Aβ42 polyklonale). Begge analyser har vist at Aβ40 fortrinnsvis deponert i leptomeningeal blodkar (piler i panelet D) og arterioler i subarachnoid space og cerebral parenchyma danner CAA. Derimot deponert Aβ42 hovedsakelig i SPs. IMS, oppløsning = 100 μm. Skala bar = 5 mm (A, Bog C) = 5 mm, 500 (D og E). Dette tallet er endret med tillatelse fra Kakuda et al.21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: MALD-IMS av frosne AD/CAA hjernen deler (pasientens #3) med en oppløsning på 40 µm. Ulike C-terminalen og N-terminal avkortet og endret Aβ peptider i AD følger alvorlig CAA (pasientens #3). Aβ1-36 til Aβ1-41 settes fortrinnsvis i leptomeningeal blodkar, mens Aβ1-42 og Aβ1-43 er avsatt i cerebral parenchyma som senil plaketter. Skalere barer = 1 mm (AB), 2 mm (venstre). Oppløsning = 40 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: MALDI-IMS av frosne AD/CAA hjernen deler (pasientens #3) med en oppløsning på 20 µm. Dette panelet viser ulike C-terminalen og N-terminal avkortet og endret Aβ peptider i AD følger alvorlig CAA (pasientens #3). Aβ1-36 til Aβ1-41 settes fortrinnsvis i leptomeningeal blodkar, mens Aβ1-42 og Aβ1-43 er avsatt i cerebral parenchyma som senil plaketter. Skalere barer = 200 μm (a, b, c), 1 mm (venstre). Oppløsning = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: segmentering kart, ved MALDI-IMS på en frossen AD hjernen inndeling, avslører antatte senil plakk, store subarachnoid fartøyet strukturer og små parenchymal arterioler. (A) segmentering kart Hentet fra en multivariabel bildeanalyser MALDI-IMS data. (B) Bisecting k-midler basert klynging analyse identifisert plakk-like og fartøy-lignende strukturer i occipital cortex. Klynger og underlag og deres forbindelser vises som noder (e.g.,1-0-0). (C) distinkte Aβ peptid lokalisering mønstre som ligner plaketter (blå), subarachnoid fartøy (grønn) og arteriole (rød) strukturer. Merk at noen røde klynger er også distribueres i subarachnoid rommet. Dette er bekreftet av enkelt ion bilder av disse personlige Aβ peptider 20 µm oppløsning: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41, og (F) Aβ 1-42. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Saken | Kjønn | Alder ved død | Lily juli SP | LUFTFARTSTILSYNET |
| 1 | M | 83 | C | 0,5 |
| 2 | M | 88 | C | 1 |
| 3 | M | 84 | C | 2 |
| 4 | M | 78 | C | 1 |
| 5 | M | 83 | C | 1 |
| 6 | M | 84 | O | 0 |
| 7 | M | 78 | O | 0 |
| 8 | M | 70 | O | 0 |
| 9 | M | 73 | O | 0 |
| 10 | M | 81 | O | 0 |
Tabell 1: klinisk og patologiske data annonse med CAA tilfeller og alderen SP O fag. Menneske kortikale prøver for Direktemeldinger og IHC ble innhentet fra hjernen banken på Tokyo Metropolitan Institute av Gerontology. Hver hjernen prøven ble tatt fra occipital cortex av fem AD pasienter og fem alder-matchet kontroller. Omfanget av amyloid avsettelse som vist av en Aβ monoklonalt antistoff ble definert av Lily juli SP (amyloid) stadier. På scenen O er det nesten ingen senil plaketter gjennom isocortex. På scenen C, blir nesten alle de isocortical områdene berørt. AD hjerner er ufravikelig på scenen C. Denne tabellen er endret med tillatelse fra Kakuda et al.21.
Discussion
Her vi viste en detaljert protokoll og resultater for visualisering av Aβ og dens isoformene fra flere autopsied hjernen med Annonsen og Luftfartstilsynets med MALDI-IMS. Deponering profilen Aβs ble drastisk endret fra Aβ1-42 til sine N - og C-terminalen varianter. Aβ1-41 ble først identifisert visualisert i menneskelige hjerne med gjeldende protokollen og ble ytterligere bekreftet med IHC21. Tatt i betraktning at morfologi av avsatt Aβ av IMS med en høy oppløsning analyse (20 μm) må være i god avtale med IHC, bidrar IMS og IHC like til å skille Aβ innskudd av deres plassering og protein innhold samt deres morfologi. Som hele eksperimentet beskrevet her ble gjennomført i occipital cortex, vil studere lokaliseringen av ulike beta-amyloid arter i alle regioner, hjernen være generalisert med senere eksperimenter ved hjelp av gjeldende protokollen.
Avgjørende skritt i protokollen er vev forberedelse skritt å få en effektiv ionisering aggregert proteiner i hjernen vev. En matrise laget er nødvendig å absorbere på laseren energi og indusere desorpsjon og ioniseringen av analytter. I denne prosessen er en hele vev delen homogent belagt med små krystaller. Homogen cocrystallization av analytt med matrix er avgjørende for høy følsomhet og gjenstand-fri bildebehandling. Hver av de tre spray metodene har sine egne fordeler. Manuell spray belegg er en av de mest brukte metodene. En airbrush er praktisk; det krever imidlertid dyktigste drift. Presis og reproduserbar eksperimentelle teknikk er viktig, anbefales bruker en ultralyd sprøyta og/eller en automatisk sprøyta som beskrevet i gjeldende protokollene. Med hensyn til en ultralyd sprøyta, vil det ikke bli påvirket av luftfuktighet og temperatur i rommet fordi det er sprayet inn et kammer. I mellomtiden med en automatisk sprøyta oppnås relativt bevarte romlig oppløsning med god reproduserbarhet. Vanligvis romlig oppløsning med tre metoder økningen i 1) airbrush, 2) automatisk enhet og 3) ultralyd sprøyta.
Høyst betydelig, ble denne protokollen opprinnelig generert for å oppdage og visualisere Aβs i autopsied hjernen prøver. Visualisering av Aβs med MALDI-IMS for APP23 mus, som genereres som en dyremodell annonse basert på svensk-type mutasjon av menneskelig APP, har blitt rapportert tidligere av andre med en eksisterende metode18,19. Men var tidligere protokollen på APP23 ikke tilstrekkelig til å visualisere Aβ i laterale oppløsning og følsomhet. Tidligere arbeider diskutert at høye Aβ konsentrasjoner utenfor vev grensen er tydelig gjenstander i APP23 imaging med deres protokollen18,19. Det betyr at den såkalte "blur" mellom ekte SPs og IMS bilder på grunn av matrix utvinning trinnet var uunngåelig med MALDI-type imaging. Men i gjeldende protokollen, uskarphet forsvant og hver spektrum representert hver enkelt SP i hjernen parenchyma.
Som vist her, vi kan spore Aβ1-41 for første gang i AD og CAA hjernen med MALDI-IMS og med IHC, med et spesifikt antistoff av vår egen generasjon21. Ifølge Aβ behandling modellen stammer Aβ1-38 fra Aβ1-45 via Aβ1-42, mens Aβ1-41 stammer fra Aβ1-45 ved γ-secretase gradvis cleavage27,28,29,30,31 . Dette betyr at gjeldende protokollen støtter denne modellen. Som for begrensninger av denne teknikken, må vi vurdere heterogenitet prøvene fra menneskelige obduksjon hjerne. Det viktigste trinnet i en forstand, er å vurdere kvalifiserte obduksjon hjernevev etiske bevis. Med gjeldende protokollen på de kvalifiserte obduksjon hjernen vev, kan MALDI-IMS individuelt spore hele fordelingen av komplekse molekyler har flere endringer, samt ukjent factor(s) regulerer patogenesen av Annonsen, som enda blir definert. Videre forstå samlede patogenesen av ulike neuropathology i alderen menneskelige hjerne, må det være mulig å adoptere MALDI-IMS som en tilnærming, i kombinasjon med klinisk, genetisk og patologisk observasjoner i nevrologiske sykdommer .
En annen viktig trinn i MALDI-IMS er data mining prosessen fra innhentet datasettet, som alltid tidkrevende. Manuell datamining hver topp distribusjon krever brukerne klikker gjennom hvert bilde og se etter distribusjoner som kan relateres til morfologi av analysert prøven. Automatisk romlige segmentering kan brukes som første trinn i data mining, gir en oversikt over datasettet og tillater rask påvisning av fremtredende. I denne likheter mellom spektra av et område er statistisk bestemmes og lignende spectra er gruppert i en klynge. Alle bildepunkter er fargekodet etter klynge oppdrag (figur 5). AD/CAA studien er området av interesse for Aβ depositions i parenchymal plakk og subarachnoid og parenchymal vaskulære strukturer. De to karakteristiske toppene som ble ytterligere bekreftet med IHC var m/z-verdier fra Aβ1-40 og Aβ1-4221. Dermed er det lett å finne colocalized m/z med Aβ1-40 og Aβ1-42 som var allerede kommentert til N - og C-terminalen avkortet Aβ, samt ukjent peptider, for videre analyse.
Weller og kolleger har rapportert at Aβ akkumuleres i fartøyet vegger, mer rundt arterier enn rundt vener21. Dessuten, det har blitt foreslått at den interstitielle væsken (ISF) inkluderer Aβs utskilt fra cerebral parenchyma til den lymfeknute via en perivascular drenering veien22,23,24,25 ,26. Gjeldende protokollen for å generere en segmentering kart basert på en MALDI-IMS datasett 20 µm oppløsning støtter den mulige eksistensen av perivascular drenering stier av hjernen (figur 5), som bidrar betydelig til CAA i AD21 , 32. Videre kan vi oppdage markør proteiner colocalized med plakk og subarachnoid blodkar ved å beregne korrelasjon av hver m/z-verdier. Forstå generelle patogenesen av ulike neuropathology i alderen menneskelige hjerne, må det være mulig å vedta MALDI-IMS som en effektiv tilnærming i kombinasjon med etablerte IHC data av klinisk, genetisk og patologisk observasjoner i nevrologiske sykdommer.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet var støttes delvis av Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (hjernen Protein aldring og demens kontroll 26117004, M.I. og T.M.). Denne forskningen ble delvis støttet av strategisk forskningsprogrammet for hjernen vitenskap fra Japan byrået for medisinsk forskning og utvikling (AMED). Alle eksperimentene ble utført i samsvar med retningslinjene som ANKOMME.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
| Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
| O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
| Scanner | EPSON | GT-980 | |
| Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
| Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
| Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
| Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
| Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
| Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
| MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
| Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
| Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
| Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
| Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
| Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |
References
- Kovacs, G. G. Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine. International Journal of Molecular Sciences. 17, E189 (2016).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
- Braak, H., Braak, E.
- Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).
- Bateman, R. J., et al. Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).
- Iwatsubo, T., et al. Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron. 13, 45-53 (1994).
- Reinert, J., et al. Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer's disease and transgenic mouse models. Acta Neuropathologica Communications. 4, 24 (2016).
- Saido, T. C., et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron. 14, 457-466 (1995).
- Harigaya, Y., et al. Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer's disease brain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).
- Vinters, H. V. Cerebral amyloid angiopathy. A critical review. Stroke. 18, 311-324 (1987).
- Saito, T., et al. Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43. Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).
- Suzuki, N., et al. High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy. The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).
- Miyasaka, T., et al. Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).
- Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).
- Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer's Brains. ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).
- Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry. Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).
- Stoeckli, M., et al.
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).
- Kakuda, N., et al. Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry. Acta Neuropathologica Communications. 5, 73 (2017).
- Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease. Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).
- Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease and their potential impact on therapy. Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).
- Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).
- Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).
- Hawkes, C. A., et al. Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy. Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).
- Kakuda, N., et al. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).
- Matsumura, N., et al. γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment. Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).
- Morishima-Kawashima, M., et al. Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain. The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).
- Takami, M., et al. γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment. The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).
- Kakuda, N., et al. Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).
- Carlred, L., et al. Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry. Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).
