Summary
Imagem molecular com laser assistida por matriz baseada em ionização/dessorção de imagem espectrometria de massa (MALDI-IMS) permite o mapeamento simultâneo de vários analitos em amostras biológicas. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e visualização da proteína β amiloide nos tecidos do cérebro de doença de Alzheimer e amostras de Angiopatia amiloide cerebral usando MALDI-IMS.
Abstract
A neuropatologia da doença de Alzheimer (AD) é caracterizada pelo acúmulo e agregação de peptídeos β amiloide (Aβ) em placas extracelulares do cérebro. Os peptídeos Aβ, compostos de 40 aminoácidos, gerados a partir de proteínas precursora amiloide (APP) por β e γ-secretases. Aβ é depositado não só no parênquima cerebral, mas também em leptomeníngeo e paredes dos vasos cerebrais, conhecidas como Angiopatia amiloide cerebral (CAA). Enquanto uma variedade de peptídeos Aβ foram identificados, detalhados de produção e distribuição de peptídeos Aβ individuais em tecidos patológicos do AD e CAA não tenha sido totalmente respondida. Aqui, nós desenvolvemos um protocolo do laser assistida por matriz baseada em dessorção/ionização imagem espectrometria de massa (MALDI-IMS) em tecidos de cérebro humano autópsia para obter o mapeamento abrangente da proteína. Para este efeito, espécimes humanos corticais foram obtidos pelo banco cérebro o Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Cryosections congelados são cortados e transferidos para óxido-índio-estanho (ITO)-revestido de lâminas de vidro. Espectros são adquiridos usando o sistema MALDI com uma resolução espacial até 20 µm. ácido sinapínico (SA) uniformemente é depositado no slide usando um pulverizador manual ou automático. Com as vantagens técnicas atuais de MALDI-IMS, um conjunto de dados típico de várias espécies Aβ dentro as mesmas seções de cérebros autopsiados humanos podem ser obtido sem sondas específicas. Além disso, de alta resolução (20 µm) imagens de um cérebro de AD e amostra de CAA grave mostram claramente que Aβ1-36 para Aβ1-41 foram depositados nos vasos leptomeníngeo, enquanto Aβ1-42 e Aβ1-43 foram depositados no parênquima cerebral como placa senil (SP). É possível adotar MALDI-IMS, como uma abordagem padrão em combinação com observações clínicas, genéticas e patológicas em compreender a patologia do AD, CAA, e outras doenças neurológicas, baseados na estratégia atual.
Introduction
Para fazer o diagnóstico e para compreender a patogênese de doenças neurodegenerativas, identificação molecular precisa de depósitos patológicos é essencial1. No curso de AD, Aβ é produzido para fazer SPs no parênquima cerebral e depositado em vasos muito antes da doença início2,3,4,5,6. Enquanto Aβ1-42 é o peptídeo predominante no SP de cérebros de AD, outras variantes Aβ, tais como N-terminal ou C-terminal truncado ou modificado Aβs, também são identificados em afetados AD cérebros7,8,9, 10. Uma imagem completa das espécies de ampla gama de Aβ no cérebro humano, especialmente com AD e cerebral Angiopatia amiloide (CAA)11, ajudará os cientistas entender a produção de Aβ, metabolismo e deposição.
Como a abordagem clássica de neuropatologia, imuno-histoquímica (IHC) tem sido o método mais conclusivo para determinar a localização de Aβs no cérebro tecidos12,13,14,15. Em geral, IHC não consegue distinguir as moléculas quando vários epítopos coexistirem simultaneamente. Por outro lado, uma análise de espectrometria de massa-baseado proteomic emergentes é uma abordagem valiosa especialmente para a análise de uma variedade de espécies Aβ em tecidos cerebrais, que não podem ser diferenciados com anticorpos16,17. A análise de espectrometria de massa base convencional de lysates do cérebro e imuno-precipitado amostras falha detectar pequenos peptídeos Aβ e perde informações de distribuição de Aβ no tecido cerebral.
Em obras anteriores, Visualizar os depósitos Aβ em cérebro de rato tem sido bem sucedido usando um modelo animal transgénico do anúncio, tais como APP23. No entanto, esse processo ainda precisa de avanços técnicos para comparar IMS e IHC com relação a resolução e sensibilidade de19,18,20. Neuropatologia AD deve ser estudada no cérebro humano, e usamos tecnologia MALDI-IMS em tecidos cerebrais de autópsia humana para obter proteína abrangente mapeamento21. Para este fim, nós desenvolvemos um protocolo para um tipo avançado de espectrometria de massa que tem vantagens em sua rapidez, sensibilidade e reprodutibilidade.
Protocol
Aqui, as amostras de tecido foram coletadas no Tokyo Metropolitan Hospital geriátrico, que presta serviços médicos comunitários para a população idosa no Japão. As amostras de autópsia cerebral utilizadas no estudo foram registradas para o banco de cérebro para pesquisa envelhecimento (abbr), com o consentimento dos parentes do falecido. A abbr é aprovado pelo Comitê de ética do Instituto de Gerontologia e Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital. Para todos os cérebros registrados no banco de cérebro, obtivemos escritos consentimentos informado para a sua utilização para pesquisas médicas de pacientes ou seus familiares. Os pacientes foram colocados em um quarto frio (4 ° C) até 2 horas após a morte para reduzir mudanças pós-morte no cérebro. Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Universidade Doshisha e o banco de cérebro para pesquisa envelhecimento, Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital e Instituto de Gerontologia.
1. preparação de cortes de tecido para IMS
- Amostra de tecido do processamento de um cérebro humano autopsiado
Nota: Certifique-se que a etapa de preparação de amostra para IMS preserva o estado original do tecido. Evite contaminação e post-mortem de mudanças. O passo seguinte é crucial.- Obter amostras corticais humanas para IMS do cérebro que foram removido, processado e armazenado a-80 ° C dentro de 8 h após a morte. Leve a amostra de cérebro do córtex occipital de pacientes e controles idade21.
- Preparação de cortes de tecido congelado
- Corte as seções de tecido em um criostato. Coloque lâminas de vidro de microscópio ITO-revestido condutor dentro o criostato21.
- Aquecer a amostra do cérebro de autópsia de-80 ° C a-22 ° C no interior do criostato.
- Anexe uma nova lâmina descartável para o criostato para cada experimento. Sempre tente usar uma parte limpa da lâmina.
- Colocar o cérebro de autópsia congelado no palco junto com uma pequena quantidade do composto OCT (suficiente para cobrir a área central do palco; ver Tabela de materiais).
- Escolha as condições de corte fino. Para IMS, use uma espessura de 10 – 12 μm para seções do cérebro humano. Para IMS e IHC, cinco a seis seções de cada amostra de tecido de corte.
- Quando a lâmina está apenas começando a cortar o tecido, gire a roda e o "cara" do bloco até que todo o tecido é exposto. Se houver uma raia pequena ou lágrima em toda a seção, espere um pouco mais no criostato até o ajuste da temperatura automaticamente resolve o problema. Contar alguns segundos antes de abrir o anticom rolo um tecido por baixo.
- Imediatamente, coloque o pedaço de tecido no lado ITO-revestido da lâmina de vidro. Descongele o pedaço de tecido, colocando um dedo por baixo do slide do lado não-ITO-revestidos. O tecido vai ficar com o slide; Certifique-se de que o tecido é liso como possível com sem rugas. Execute esta etapa à temperatura ambiente.
Nota: Usar luvas, máscaras e uma bata de laboratório, pois as amostras humanas podem conter contaminantes biológicos. Quando todas as seções foram feitas para o dia, limpe o criostato, escovas e mandris com toalhitas de laboratório e 200 mL de etanol a 100%.
- Enxaguar as secções de tecido
- Mergulhe as amostras em 40-100 mL de etanol a 70% por 30 s para remover lipídios endógenos e sais inorgânicos. Use um vidro frasco de coloração.
- Lavar as amostras com 40-100 mL de etanol a 100% por 30 s, 40 – 100 mL de solução de Carnoy para 3 min, 40-100 mL de etanol a 100% por 30 s, 40-100 mL de 0,1% o ácido trifluoroacético (TFA) por 1 min e 40 – 100 mL de etanol a 100% por 30 s. uso um copo frasco de coloração.
Nota: A solução de Carnoy é um fixador composto por seis partes de etanol, três partes de ácido acético e clorofórmio uma parte. - Seca no vácuo durante 30 min.
- Tratamento das secções de tecido com um vapor de ácido fórmico, para uma melhor ionização das proteínas dos tecidos do cérebro de autópsia Aβ
- Prepare a lâmina de vidro de forno e incubação deve ser usado para a posterior vaporização com 5 mL de ácido fórmico a 100%. Para obter um tratamento satisfatório com ácido, manter a umidade do ar em prato de vidro a incubação no nível de saturação, em toda esta etapa e manter a temperatura a 60 ° C. Coloque as lâminas de tecido em prato de vidro a incubação, evitando a imersão em ácido fórmico e tratar por 6 min.
- Pegue uma imagem óptica das amostras usando um scanner de filme, gel de scanner, ou um microscópio digital, etc. executar essa etapa à temperatura ambiente. O alinhamento da imagem óptica das amostras é necessário quando o alvo da amostra é colocado dentro do instrumento. Normalmente, não será possível reconhecer a seção de tecido por baixo da camada de matriz.
Nota: A maneira mais conveniente de tomar uma imagem óptica é usar um scanner de escritório. É uma boa ideia para salvar a imagem na pasta de armazenamento de dados de imagem. - Para correlacionar as imagens ópticas com as amostras, fazer marcas de guia que são visíveis na imagem óptica e por baixo da camada de matriz na óptica da câmera. A maneira mais fácil é detectar marcas de fluido correção de pelo menos três em torno da amostra antes de tomar a imagem óptica.
- Aplicação da matriz
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Preparação da solução de matriz
- Em um microtubo tolerante a solventes orgânico, preparar um 10 mg/mL solução de SA em 50% acetonitrila (ACN) e 0,1% TFA. Dissolva completamente o SA composto num Vortex ou breve sonication durante 10 min. loja a solução à temperatura ambiente até o uso.
Nota: Existem três opções diferentes para a pulverização de matriz: usando um aerógrafo, um pulverizador ultra-sônico ou um pulverizador automático.
- Em um microtubo tolerante a solventes orgânico, preparar um 10 mg/mL solução de SA em 50% acetonitrila (ACN) e 0,1% TFA. Dissolva completamente o SA composto num Vortex ou breve sonication durante 10 min. loja a solução à temperatura ambiente até o uso.
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A matriz de pulverização com um aerógrafo
- Execute a operação em uma temperatura constante (20 a 23 ° C) e humidade (40-60%). Os parâmetros para ajustar para pulverização ideal incluem o tamanho da gota, a quantidade de névoa, o ângulo e a distância entre o bocal e a seção de tecido e laboratório de temperatura e umidade. Ajuste a estas condições, verificando os resultados da microscopia.
Nota: Como fatores limitantes incluem o tamanho de cristal e a homogeneidade da cobertura da matriz e a migração/difusão indesejável dos analitos, menor é melhor para o tamanho da gota. Homogeneidade é também o ponto de inspeção.
- Execute a operação em uma temperatura constante (20 a 23 ° C) e humidade (40-60%). Os parâmetros para ajustar para pulverização ideal incluem o tamanho da gota, a quantidade de névoa, o ângulo e a distância entre o bocal e a seção de tecido e laboratório de temperatura e umidade. Ajuste a estas condições, verificando os resultados da microscopia.
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A matriz de pulverização com um pulverizador ultra-sônico
- Remova o tecido para ser pulverizado de exsicador e colocá-lo na câmara. Certifique-se que o tecido não está cobrindo a janela do sensor.
- Iniciar a preparação pressionando o botão Iniciar ; Geralmente, o tempo de preparação é em torno de 90 min. A preparação será regulada automaticamente através do monitoramento da espessura de camada de matriz e umidade. Após concluir a preparação, retirar a lâmina e armazená-lo no exsicador durante 15 minutos antes da leitura no instrumento MALDI.
- Limpe o pulverizador com 2-3 mL de 100% MeOH até que aparece a cabeça de spray limpa.
Nota: Uma fina névoa de gotículas de matriz é permitida penetrar no tecido por um lençol gravitacional. É gerado um tamanho de gota média de 20 μm; todos os diâmetros de gotículas são menos de 50 μm.
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A matriz de pulverização com um pulverizador automático
- Pulverize a solução de matriz na superfície do tecido com um pulverizador automático. Um flow constante de gás aquecido bainha (N2, fixado em 10 psi e 75 ° C) será entregue conjuntamente com a pulverização de solução de matriz. Use um sistema de bomba de solvente (fixado em 10 psi e 0,15 mL/min) para fornecer a solução de matriz.
Nota: O mais importante, trabalhar sob uma câmara de segurança para evitar qualquer inalação de aerossóis de matriz. Controle a temperatura e umidade para reproduzir a cristalização da matriz homogênea.
- Pulverize a solução de matriz na superfície do tecido com um pulverizador automático. Um flow constante de gás aquecido bainha (N2, fixado em 10 psi e 75 ° C) será entregue conjuntamente com a pulverização de solução de matriz. Use um sistema de bomba de solvente (fixado em 10 psi e 0,15 mL/min) para fornecer a solução de matriz.
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Preparação da solução de matriz
2. MALDI-IMS
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Realize a espectrometria de massa de altíssima velocidade.
- Realizar experimentos de imagem de alta produtividade e alta resolução espacial com MALDI-IMS, equipado com um Nd: YAG de 10KHz (355 nm) laser.
- Para medições de espectrometria de massa, defina as áreas de tecido usando o software de controle MALDI e software de análise de dados.
- Aquisição de espectros em uma modalidade linear positiva com uma escala em massa de m/z 2.000-20.000 e uma resolução espacial de 20 e 100 µm.
- Para fazer a calibração padrão, dissolver o padrão de calibração de peptídeos e proteína padrão de calibração com um rácio de 1:4 com ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinâmico (CHCA) em solução TA30 (TFA ACN:0.1% = 30:70) e em seguida dilui-lo x 10. Coloque 1 μL de calibração padrão no slide em quatro locais diferentes.
- Usando software de histologia molecular (ver Tabela de materiais), sobreposição de várias imagens simples, para encontrar a correlação espacial de vários sinais, tais como diferentes peptídeos Aβ colocalizing no SPs e paredes arteriais.
3. processamento de dados
- Para alinhamento espectral, alinhe todos os espectros com uma lista selecionada de m/z de uma anterior publicação21.
- Importar o conjunto de dados MALDI-IMS para software de análise estatística (consulte Tabela de materiais) com a subtração da linha de base.
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Regiões de interesse (ROIs) com base no conhecimento histológico de rastrear.
- Realizar uma análise univariada para as intensidades de média, desvio-padrão, descobrindo de discriminativa m/z-marcadores (análise ROC), testes de hipótese e descoberta de colocalized valores m/z.
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Crie um mapa de segmentação.
- Realizar uma análise multivariada sem supervisão para a segmentação espacial de grandes conjuntos de dados e uma análise de componentes para a extração de tendências subjacentes.
- Selecione ROIs anatômicas com base nas características histológicas, como parênquima e o espaço subaracnoideo.
- Atribuir estruturas como ROIs individuais e correlacioná-los com os dados processados de MS, a fim de identificar os peptídeos associados que permitiu que a segmentação de imagens da região.
Representative Results
Pacientes esporádicos com CAA (n = 5; média de idade = 83,2 y) e com idades entre indivíduos com placa senil livre (O SP) e CAA (n = 5; média de idade = 77,2 y) foram analisados (tabela 1). Os fenótipos de CAA de paciente #3 foram mais proeminentes neste estudo. Distribuições de Aβ1-40 e Aβ1-42 depósitos no tecido cerebral do paciente #3 foram visualizadas com MALDI-IMS (Figura 1). Havia sem sinais significativos nos cérebros ainda controle (pacientes #9 e #10), conforme mostrado na Figura 1. Aqui, o MALDI-IMS visualizado claramente que Aβ1-42 foi depositado preferencialmente como SPs no parênquima cerebral. Por outro lado, o Aβs mais curtos, tais como Aβ1-36 a 41-1, preferencialmente foram depositados nas áreas vascular leptomeníngeo (Figura 1).
Distribuições de Aβ40 e Aβ42 mais foram validadas com IHC usando seções congeladas adjacentes dos tecidos. O anticorpo anti-Aβ40 etiquetado CAA (setas na Figura 2B), que está em claro contraste com a distribuição de Aβ42 no parênquima cerebral como SPs. Para Aβ1-41, nós somos os primeiros a detectar este fragmento no cérebro humano, e geraram anticorpos específicos que podem diferenciar Aβ40 andAβ4221Aβ41.
A resolução espacial de MALDI-IMS geralmente é o fator mais importante a ser melhorado. Na Figura 1 e Figura 2 mostram MALDI-IMS com uma resolução de arremesso 100 µm e obter um perfil de distribuição global para uma área relativamente ampla de21. É difícil definir a deposição de amiloide exatamente no espaço subaracnoideo, incluindo estrutura vascular. Para retratar a estruturas de tecido fino de navios subaracnoideo e a superfície do córtex, de alta resolução de imagem MALDI (40 µm: Figura 3; 20 µm: Figura 4 e Figura 5) foi realizada. Como resultado, o MALDI-IMS demonstraram claramente que Aβs mais curtos, tais como Aβ1-36 a 41-1, são distribuídos nas paredes das artérias, que é comparável com o IHC.
MALDI-IMS demonstrado as distribuições detalhadas de ambos os Aβx-40 e 42-Aβx (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 11pE) no anúncio acompanhado com cérebro de CAA moderado. Por exemplo, enquanto Aβx-40 espécies apresentaram um perfil de distribuição semelhante a Aβ1-40, Aβx-42 espécies mostraram um padrão de distribuição diferente com Aβ1-4221. Pelo protocolo atual, imagens de íon único dos peptides Aβ individuais observados com MALDI-IMS são atribuídas às espécies Aβ. Por outro lado, adquiriu a imagem de dados podem ser investigados usando estatísticas multivariadas sem supervisão, a fim de obter a segmentação de imagem de regiões anatômicas de interesse para a uma análise mais aprofundada das proteínas indefinidas. A Figura 5 mostra um mapa de segmentação obtido com uma análise de k-meios bissectriz aplicada a mesma seção do paciente #321. Este método de cluster identificado com sucesso estruturas semelhantes a placa no parênquima (azul na Figura 5) e estruturas vasculares no espaço subaracnoideo (verde na Figura 5). É interessante encontrar uma pequena área circular no parênquima, que é detectado apenas em torno de uma arteríola pequena do parênquima, bem como no espaço subaracnoideo (roxo na Figura 5). Isto é verificado por imagens de único íon destes peptides Aβ individuais em Figura 5-5F.
Figura 1: secção do cérebro MALDI-IMS de um congelado AD/CAA. Vários C-terminal truncado Aβ peptídeos no anúncio que acompanha a CAA severo (paciente #3) são visualizados no painel esquerdo e controles (paciente #9 sobre o direito e o paciente #10 à esquerda em todas as imagens) no painel direito. Aβ1-36 a 41 Aβ1 preferencialmente são depositados em leptomeníngeo dos vasos sanguíneos, enquanto Aβ1-42 e Aβ1-43 são depositados no parênquima cerebral como placas senis no caso #3, quando não havia nenhum sinal dos pacientes controle cérebros (casos #9 e #10). Resolução = 100 μm. Barra de escala = 5 mm. Esta figura foi modificada com a permissão de Kakuda et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: MALDI-IMS de AD/CAA congelado no cérebro seções e partes adjacentes do córtex occipital do cérebro AD. (A - C) seções de cérebro congeladas AD/CAA e (D e E) seções adjacentes do córtex occipital do cérebro AD foram manchadas de imune e focadas na arteríola e parênquima cerebral, utilizando anticorpos contra Aβ40 (d: BA27) ou Aβ42 (E: anti-Aβ42 policlonal). Ambas as análises demonstraram que Aβ40 é depositado preferencialmente em vasos leptomeníngeo (setas no painel D) e arteríolas no espaço subaracnoideo e o parênquima cerebral, formando o CAA. Em contraste, Aβ42 principalmente é depositado no SPs. Para IMS, resolução = 100 μm. Barra de escala = 5 mm (A, Be C) = 5 mm, 500 (D e E). Esta figura foi modificada com a permissão de Kakuda et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Martins-IMS de AD/CAA congelado no cérebro seções (paciente #3) com uma resolução de 40 µm. Vários C-terminal e N-terminal truncado e modificado peptídeos Aβ no anúncio que acompanha a CAA severo (paciente #3). Aβ1-36 a 41 Aβ1 preferencialmente são depositados em leptomeníngeo dos vasos sanguíneos, enquanto Aβ1-42 e Aβ1-43 são depositados no parênquima cerebral como placas senis. Barras de escala = 1 mm (A-B), 2 mm (superior esquerdo). Resolução = 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: MALDI-IMS de AD/CAA congelado no cérebro seções (paciente #3) com uma resolução de 20 µm. Este painel mostra vários C-terminal e N-terminal truncado e modificado peptídeos Aβ no anúncio que acompanha a CAA severo (paciente #3). Aβ1-36 a 41 Aβ1 preferencialmente são depositados em leptomeníngeo dos vasos sanguíneos, enquanto Aβ1-42 e Aβ1-43 são depositados no parênquima cerebral como placas senis. Escala de barras = 200 μm (a, b, c), 1 mm (superior esquerdo). Resolução = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: mapa de segmentação, obtido por MALDI-IMS de uma seção de cérebro congelada AD, revela putativa placa senil, estruturas de grande navio subaracnoide e pequenas arteríolas parenquimatosas. (A) mapa de segmentação obtidos a partir de uma análise multivariada de imagem de dados MALDI-IMS. (B) Bisecting k-médias, análise de cluster com base identificado como placa e embarcação-como estruturas no córtex occipital. Os clusters e subestruturas e suas relações são mostradas como nós (e.g.,1-0-0). (C) Aβ distinto padrões de localização de peptídeo assemelhando-se a placas (azul), subaracnoide vasos (verdes) e estruturas de arteríola (vermelho). Observe que alguns clusters de vermelhos também são distribuídos no espaço subaracnoideo. Isto é verificado por imagens de único íon destes peptides Aβ individuais em uma resolução de 20 µm: Aβ (D) 1-40, (E) Aβ 1-41 e Aβ (F) 1-42. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Caso | Sexo | Idade na morte | Braak SP | CAA |
| 1 | M | 83 | C | 0,5 |
| 2 | M | 88 | C | 1 |
| 3 | M | 84 | C | 2 |
| 4 | M | 78 | C | 1 |
| 5 | M | 83 | C | 1 |
| 6 | M | 84 | Ó | 0 |
| 7 | M | 78 | Ó | 0 |
| 8 | M | 70 | Ó | 0 |
| 9 | M | 73 | Ó | 0 |
| 10 | M | 81 | Ó | 0 |
Tabela 1: dados clínicos e patológicos do AD com CAA casos e temas de SP O envelhecido. Amostras de corticais humanas para IMS e IHC foram obtidas pelo banco cérebro Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Cada espécime de cérebro foi retirado o córtex occipital de cinco pacientes e cinco controles idade-combinadas. A extensão da deposição de amiloide como mostrado por um anticorpo monoclonal Aβ foi definida por fases de Braak SP (amiloide). O de fase, não há quase nenhum placas senis em todo o isocórtex. Fase C, praticamente todas as áreas isocortical são afetadas. AD cérebros são invariáveis na fase C. Esta tabela foi modificada com a permissão de Kakuda et al.21.
Discussion
Aqui temos demonstrado um protocolo detalhado e resultados da visualização de Aβ e suas isoformas de vários cérebros autopsiados com AD e CAA com MALDI-IMS. O perfil de deposição de Aβs foi drasticamente alterado de Aβ1-42 para suas variações N - e C-terminal. Aβ1-41 foi primeiro identificado e visualizado no cérebro humano, com o atual protocolo e ainda mais foi validado com IHC21. Considerando que a morfologia de Aβ depositado pelo IMS com uma análise de alta resolução (20 μm) deve estar em bom acordo com IHC, IMS e IHC igualmente contribuam à distinção entre depósitos Aβ, pela sua localização e conteúdo de proteína, bem como pela sua morfologia. Como todo o experimento aqui descrito foi realizado no córtex occipital, estudando a localização das diferentes espécies de beta-amiloide em todas as regiões do cérebro vai ser generalizada com futuros experimentos usando o protocolo atual.
Passos críticos dentro do protocolo são etapas de preparação do tecido para obter uma eficaz ionização de agregados proteínas nos tecidos do cérebro humano. Uma camada de matriz é necessário para absorver a energia do laser e induzir a ionização de analitos e dessorção. Neste processo, uma secção de tecido inteiro homogênea é revestida com pequenos cristais. Cocrystallization homogênea da substância a analisar com a matriz é crucial para a imagem latente de alta sensibilidade e livre de artefato. Cada um dos métodos de três pulverização tem suas próprias vantagens. Revestimento de pulverizador manual é um dos métodos mais frequentemente utilizados. Um aerógrafo é conveniente; no entanto, requer operação hábil. Como precisa e reprodutível técnica experimental é essencial, usar um pulverizador Ultrassônico e/ou um pulverizador automático conforme descrito nos protocolos atuais é recomendado. No que diz respeito um equipamento ultra-sônico, é não ser influenciada pela umidade e a temperatura da sala porque ele é pulverizado em uma câmara. Entretanto, com um pulverizador automático, resolução espacial relativamente preservada com boa reprodutibilidade é obtida. Geralmente, a resolução espacial obtida com o aumento de três métodos na ordem de 1) aerógrafo, dispositivo 2) automático e pulverizador 3) ultra-sônico.
Mais importante ainda, este protocolo foi originalmente gerado para detectar e Visualizar Aβs em amostras de cérebro humano autopsiados. A visualização de Aβs com MALDI-IMS para ratos de APP23, que é gerada como um modelo animal de AD baseada a mutação Sueco-tipo de APP humano, tem sido relatada anteriormente por outros com método existente18,19. No entanto, o protocolo antigo aplicado a APP23 não foi suficiente para visualizar Aβ na sua resolução lateral e sensibilidade. Obras anteriores discutiram que altas concentrações de Aβ fora do limite de tecido são claramente artefatos em APP23 de imagem com seu protocolo18,19. Isso significa que os chamados 'borrão' entre reais SPs e IMS imagens devido a etapa de extração da matriz era inevitável com imagem MALDI-tipo. No entanto, no actual protocolo, o Borrão desapareceu e cada espectro representado cada SP único no parênquima cerebral.
Como mostrado aqui, poderemos rastrear Aβ1-41 pela primeira vez no anúncio e cérebros de CAA MALDI-IMS, bem como com o IHC, com um anticorpo específico por nossa própria geração21. De acordo com o modelo de processamento de Aβ, Aβ1-38 deriva Aβ1-45 através de Aβ1-42, enquanto Aβ1-41 deriva Aβ1-45 por γ-secretase gradual clivagem27,28,29,30,31 . Isto significa que o protocolo atual oferece suporte a este modelo. Quanto as limitações desta técnica, temos de considerar a heterogeneidade das amostras de cérebro humano autópsia. O passo mais crítico, em certo sentido, é avaliar o tecido cerebral de autópsia qualificado com prova de ética. Com o atual protocolo sobre os tecidos cerebrais de autópsia qualificado, MALDI-IMS individualmente pode acompanhar a toda distribuição das moléculas complexas tendo várias modificações, bem como factor desconhecido regulamenta a patogênese do anúncio, que ainda estão para ser definido. Além disso, no entendimento geral patogênese de várias neuropatologia no cérebro humano envelhecido, deve ser viável adotar MALDI-IMS, como uma abordagem padrão, em combinação com observações clínicas, genéticas e patológicas em doenças neurológicas .
Outro passo crítico de MALDI-IMS é o processo de mineração de dados do conjunto de dados obtido, que sempre é demorado. Mineração de dados manual de cada distribuição de pico exige que os usuários a clicar em cada imagem e procure por distribuições que podem correlacionar a morfologia da amostra analisada. Segmentação espacial automática pode ser usada como o primeiro passo de dados mineração, fornecendo uma visão geral do conjunto de dados e permitindo a rápida detecção de características proeminentes. Nesta abordagem, semelhanças entre os espectros de uma dada região são determinadas estatisticamente, e espectros similares são agrupados em um cluster. Todos os pixels são codificados por cores de acordo com sua atribuição de cluster (Figura 5). No presente estudo AD/CAA, a área de interesse é o espaço de depoimentos de Aβ na placa parenquimatosa e as estruturas vasculares subaracnoide e parenquimatosas. Os dois picos distintos que mais foram validados com IHC foram os valores de m/z de Aβ1-40 e Aβ1-4221. Assim, é fácil encontrar colocalized m/z com Aβ1-40 e Aβ1-42, que já foi anotado para N - e C-terminal truncado Aβ, bem como peptídeos desconhecidos, para posterior análise.
Weller e colegas relataram que Aβ se acumula nas paredes dos vasos, mais próximo de artérias do que ao redor das veias21. Além disso, foi proposto que o fluido intersticial (ISF) inclui Aβs excretados do parênquima cerebral para o linfonodo através um perivascular drenagem via22,23,24,25 ,26. O protocolo atual para gerar um mapa de segmentação com base em um conjunto de dados MALDI-IMS na resolução 20 µm suporta a possível existência de vias de drenagem perivascular do cérebro (Figura 5), que contribuem significativamente para o CAA em AD21 , 32. Além disso, podemos descobrir proteínas marcador colocalized com placa e vasculatura subaracnoidea, calculando-se a correlação de cada valores m/z. Na compreensão geral patogênese de várias neuropatologia no cérebro humano envelhecido, deve ser viável a adotar MALDI-IMS, como uma poderosa abordagem em combinação com dados IHC estabelecidas de clínica, genética e observações patológicas em neurológica doenças.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (cérebro proteína envelhecimento e demência controle 26117004; para mi e T.M.). Esta pesquisa foi parcialmente financiada pelo programa de investigação estratégica para Ciências do cérebro da Agência de Japão para pesquisa médica e desenvolvimento (AMED). Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as diretrizes de chegada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
| Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
| O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
| Scanner | EPSON | GT-980 | |
| Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
| Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
| Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
| Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
| Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
| Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
| MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
| Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
| Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
| Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
| Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
| Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |
References
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