Summary
Denne protokollen gir leserne å kunne etablere en porcine modell av Segmentinformasjon intestinal iskemi og deretter isolere og kultur intestinal stamceller for studier av epitelial reparasjon etter skade.
Abstract
Intestinal iskemi er fortsatt en viktig årsak til sykelighet og dødelighet i menneskelig og veterinary pasienter. Mange sykdommer prosesser føre intestinal iskemi, når blodtilførselen og derfor oksygen er redusert til tarmen. Dette fører til intestinal barriere tap og skade på underliggende vev. Intestinal stamceller ligger ved foten av krypten i Lieberkühn og er ansvarlig for intestinal fornyelse homeostase og følgende skade. Ex vivo celle kultur teknikker har tillatt for vellykket studiet av epitelial stamcelleforskningen interaksjoner ved å etablere oppdrettsforholdene som støtter vekst av tredimensjonale epithelial orgel-lignende systemer (kalt "enteroids" og" colonoids"fra små og store tarmen, henholdsvis). Disse enteroids er sammensatt av crypt og villus-lignende domener og modne alle celletyper innen epitel. Historisk har murine modeller vært benyttet for å studere intestinal skade. Men tilbyr en porcine modell flere fordeler som likhet i størrelse samt mage anatomi og fysiologi som mennesker. Ved å benytte en porcine modell, etablere vi en protokoll der Segmentinformasjon ledd av intestinal iskemi kan opprettes i en enkelt dyr, muliggjør studiet av ulik tid poeng iskemiske skader og reparere i vivo. I tillegg beskriver vi en metode for å isolere og kultur intestinal stamceller fra iskemiske løkkene av tarmen, tillater for videre studier av epitelial reparasjon, modulert av stamceller, ex vivo.
Introduction
Intestinal iskemiske skader, et resultat av nedsatt oksygen tilgjengelighet på grunn av en reduksjon eller fullstendig okklusjon av blodstrømmen til tarmen, forblir en vesentlig årsak til sykelighet og dødelighet i mennesker og dyr pasienter1,2. Iskemiske skader, påfølgende betennelse og cellular infiltrasjon, fører til mucosal barriere kompromiss. Slimhinnene barrieren er avgjørende for forebygging av bakteriell translokasjon og tilknyttede giftstoffer i systemisk sirkulasjon3,4. Etterfølgende reperfusion iskemiske vev kan føre til dannelse av skadelige frie radikaler som kan forverre skade5. Siden intestinal iskemi er sjelden forebygges, har nyeste forskning fokusert på fremmarsj teknikker for tidlig deteksjon av iskemi og utviklingen av romanen behandlingsmetoder som reduserer reperfusion skade eller mål mucosal reparasjon.
Dyremodeller har blitt brukt til å utvide vår grunnleggende vitenskapen kunnskap om ischemia-reperfusion skade og fortsatt avgjørende for translasjonsforskning. Gnager modeller er de mest brukte evne til å være genetisk manipulerte6. Flere nylig imidlertid har bruk av store dyr modeller, spesielt gris, vært orde for fremtidig translational studier av mange fordeler inkludert griser anatomiske og fysiologiske likhetene til mennesker7,8. En rekke skader modeller er utviklet for å studere ischemia-reperfusion skade og fullstendig vaskulær okklusjon, lav-flow iskemi og Segmentinformasjon hvem vaskulær okklusjon. En full gjennomgang av disse modellene er utenfor området for denne artikkelen men forfatterne dirigerer lesere til siste gjennomgang3.
I tillegg til i vivo modeller tilbyr bruk av ex vivo mobilnettet kultur systemer et lovende verktøy for å studere intestinal homeostase og reparasjon etter skade. Intestinal stamceller er ansvarlig for mobilnettet spredning og omsetning av intestinal epithelial fôr. Når isolert fra normal eller skadde tarmen, intestinal stamceller kan opprettholdes i kultur og tjene som et verktøy eller modell stilk cellen og epithelial cellebiologi. Metoder for å isolere og etablere dette tredimensjonale kultur systemer (kalt enteroids og colonoids når avledet fra små og store tarmen, henholdsvis) har blitt beskrevet for en rekke arter og organ systemer9,10 ,11,12,13. Spesielt i mage-tarmkanalen, har disse kultur-systemer blitt brukt til modell gastrointestinal sykdom som kreft, patogen infeksjon og inflammatorisk tarm sykdom14. På denne tiden er det ingen rapporter som beskriver isolasjon og vedlikehold av intestinal stamceller fra ischemically skadet tynntarmen i noen arter. Derfor beskriver her vi prosessen med intestinal iskemi i en roman, store dyr porcine modell som resulterer i reproduserbar skader og muligheten til å isolere intestinal stamceller fra normal og ischemically skadet tarmen for ytterligere studier av utvinning ex vivo.
Protocol
For disse eksperimentene, ble alle dyrestudier godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av North Carolina State University.
1. forberedelse for kultur
Merk: Alle reagenser er oppført i Tabellen for materiale. Bestemt vekstfaktor konsentrasjoner er oppført i tabell 1.
- Forberede en 0,5 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning i destillert deionisert vann (ddH2O). Bland tilstrekkelig og justere pH 7,4 med NaOH og/eller HCl løsninger.
Merk: Utgjør EDTA lagerløsning frisk før hvert eksperiment. - Forberede dissosiasjon reagens #1 (DR #1) som følger og plassere på is: kombinere fosfat bufret saline uten Ca2 + og Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT), 10 µM Y27632 og 1 X antibiotika-Antimycotic løsning (Anti-Anti) inneholder penicillin, streptomycin og amfotericin B.
Merk: Legg Y27632 umiddelbart før vev samling. - Forberede dissosiasjon reagens #2 (DR #2) som følger og plasser i en 37 ° C vannbad: kombinere PBS uten Ca2 + og Mg2 +, 0,5 M EDTA, 10 µM Y27632 og 1 X Anti-Anti. Merk: Legg Y27632 umiddelbart før vev samling.
- Forberede intestinal epithelial stilk cellen (IESC) media som følger: blanding 25 mL avansert DMEM/F12 medium med 1 X N2 supplement, 1 X B-27 supplement, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax og 1 X Anti-Anti. Lagre på 4 ° C før bruk.
- Forberede en master blanding av redusert vekstfaktor kjelleren membran matrise (matrise) og supplerende vekstfaktorer som følger: tine matrix på is. I et microcentrifuge rør, legge 100 ng/mL rekombinant menneskelige Noggin, 500 ng/mL rekombinant menneskelige R-Spondin 1, 50 ng/mL rekombinant menneskelige epidermal vekstfaktor (EGF), 100 ng/mL rekombinant menneskelige Wnt3a, 10 mM nikotinamid, 10 nM gastrin, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 og 2,5 µM glykogen syntase kinase 3 hemmer (GSK3i, CHIR99021). Når matrix er tint opp, supplere med vekstfaktor mix (gjør master mix) og lagre på is.
Merk: Pass på å unngå introdusere luftbobler som dette oppretter gjenstand innenfor matrise patty under plating. - Forvarm en 24-og vev kultur parabol i en 37 ° C inkubator før du starter celle isolering prosedyrer.
2. kirurgisk modell av iskemi og vev samling
- Bruk åtte til ti-uke-gamle Yorkshire crossbred griser av begge kjønn (anbefales). Fjern alle mate 16-18 h før kirurgi. Kan griser tilgang til vann bestandig.
- Planlegge griser kommer minst 48 timer før eksperimenter å tillate miljømessige acclimation.
Merk: Kvalifiserte veterinær og/eller laboratorium teknikere veiledet av en med lisens veterinarian gi rutinemessig dyr omsorg og hjelp med bedøvende prosedyrer. - Premedicate gris med xylazine (1.5 mg/kg intramuskulært (IM)) og ketamin (11-20 mg/kg (IM))15. Når sedate, intubate gris orotracheally.
- Opprettholde griser under narkose med isoflurane (2-5%) fordampet i 100% O2 inntil euthanasia.
- Plasser en intravenøs (IV) kateter (øre vene anbefales) og administrere en erstatning væske som lactated ringesignaler løsning frekvensen vedlikehold av 15 mL/kg/t.
- Utføre rutine bedøvende overvåking inkludert puls oximetry, electrocardiography og indirekte blodtrykk målinger15. Overvåke gris respirasjonsfrekvens og krefter og ventilere manuelt eller mekanisk nødvendig hvis slutten tidevanns CO2 stiger over 55-60 mmHg.
Merk: Riktig anestesi er bekreftet av kontinuerlig overvåking av trender i hjertefrekvens (slag i minuttet utvalg 80-130), ikke-invasiv blodtrykk (betyr arterieblodtrykk 75-100 mmHg), og respirasjonsfrekvens (10-25 åndedrag/min)16og periodisk kontroll fraværet av kjeven og anal tone. Dybden av anestesi kan også bedømmes av muskelavslapping og muskel fasciculation etter kirurgisk stimulans. Okulære reflekser er vanligvis ingen verdi16. Analgesi fås som anvist av institusjoner IACUC policy. I dette tilfellet kan en opioider, som buprenorfin, administreres under operasjonen. - Plasser grisen på en varmeputen og holde i dorsal recumbency for kirurgiske prosedyren.
- Barbere ventrale magen og prep kirurgisk skrubb (chlorhexidine løsning) og isopropylalkohol.
- Gjøre et 8-10-cm ventrale midtlinjen snitt ved hjelp av en skalpell blad sentrert på navlen til magen.
- Identifisere den tynntarm (jejunum) ca 40 cm muntlige ileocecal veikrysset. Avgrense ti cm lang ledd av jejunum av circumferentially ligating tarmen to ganger, én cm mellom hver ligatur, før du oppretter senere looper 10 cm ligger muntlig (figur 1).
- Opprett to løkker per punkt av iskemi ved siden av hverandre, en for iskemi og én for iskemi med en ekstra 1h av reperfusion hvis ønskelig. For å opprette fullstendig iskemi (ingen flyten av arterier eller årer), klemme eller ligate er hvem blodkar bruke bulldog vaskulær klemmer, buede Halstead mygg hemostats, eller 2-0 ikke-absorberbare silke for 1, 2, 3 og 4h og fjern klemmer 1t av reperfusion, om ønskelig.
Merk: Forfatterne opprettet alle ledd av iskemi i rekkefølge med 4h iskemiske loopen og kommet flytte proximally (å redusere totale kirurgi tid). For å håndtere muligheten at nabolandet iskemiske intestinal segmenter kan skade tilstøtende looper, kan rekkefølgen på iskemiske looper varieres. Dette kan endre kirurgisk totaltiden.
Merk: Tidsramme på reperfusion kan varieres basert på problemstillingen severdigheter eller hvis terapi vil bli testet i reperfusion perioden. Men som vevsskade blir mer alvorlig fra øke varigheten for iskemi alene, bidrar reperfusion skade sannsynlig ikke til ytterligere epithelial skade. Reperfusion spiller sannsynligvis en rolle etter milde perioder iskemiske skader. - Mellom iskemi tidspunkt, holde magen dekket eller lukkes med et sterilt håndkle og/eller en håndkle klemme.
Merk: I en enkelt dyr for dette eksperimentet, åtte iskemiske segmentene kan opprettes. Identifisere et ekstra jejunal segment, minst 5-10 cm proksimale til siste iskemiske sløyfen, som skal fungere som en vanlig internkontroll. - Hindre ca tre hvem fartøyer per bulldog vaskulær klemme eller buet Halstead mygg hemostat. Hensyn må tas under hemostat søknad fordi fartøyene er lett traumatisert. Prøv å stable fartøyene i kjevene av klyper.
- På slutten av eksperimentet følgende eutanasi med pentobarbital 85-100 mg/kg IV, samle alle ledd av tissue benytter metzenbaum saks, etter døden er bekreftet uten hjerterytme auscultated og tap av det hornhinnen refleks. Start ved å samle et kontroll stykke normal jejunum minst 5 - 10 cm proksimale til siste iskemiske sløyfen.
- Separate og lagre looper fra hver skade punkt i små beholdere med iskald PBS til klar for krypten isolasjon.
Merk: Hvis ønskelig, gjøre iskemiske looper lenge nok for å dele inn i separate prøver for histology og intestinal stamcelleforskningen kultur; forfatterne har imidlertid funnet at løkkene større enn ca 10 cm lange er mest sannsynlig å bli hemoragisk.
3. krypten (stilk cellen) isolasjon fra iskemiske og sløyfer
- Invertere hver bue av tynntarmen bruker 20-dimensjon på ledningen og tissue tang for å avsløre slimhinnen. Tie toppen og bunnen av loopen på ledningen med Sutur (2-0 ikke-absorberbare silke eller tilsvarende).
- Etter inversjon, skyll hver bue i isen kalde PBS skal fjerne luminal rester.
- Plasser prøver umiddelbart i 50 mL konisk rør som inneholder DR #1 på is 30 min.
- Samle looper begynner med kontroll og følge med ledd av gradvis økende varighet for ischemia. Looper fra mindre skadet vev (dvs. kontroll og 1t iskemiske vevet) kan rokkes forcefully, knipser håndleddet for best resultat. Vev fra alvorlig skadet vev (3 og 4 h av iskemi) bør være forsiktig rystet eller invertert bare som for mye risting vil føre krypten avbrudd og flere vev. Rør skal ristet eller invertert hver 5 min på isen.
- Overføre prøver til DR #2 i 10 min i et 37° C vannbad. Riste eller invertere rør hver 5 min.
- Etter overføring vev, sentrifuge konisk rør som inneholder DR #1 fra 2-4 h skadet løkkene fjerne EDTA supernatant (200 x g i 5 min). Disse vev er svært skadet er det mulig crypts har allerede blitt skilt. Fjerne nedbryting og resuspend pellets med en liten mengde PBS (5 mL) og videre til trinn 3.9.
- Fjerne prøver fra DR #2 og plasser vevsprøver direkte i 25 mL kaldt PBS på is (etiketten som vask #1). Plass eksemplene på en orbital shaker på is på 60 rpm. Riste eller invertere hver rør for 30 s hver 2 til 5 minutter.
- Etter overføring vev, spin konisk rør som inneholder DR #2 fra 2-4 h skadet looper fjerne EDTA supernatant (200 x g i 5 min). Disse vev er svært skadet er det mulig at crypts har blitt atskilt. Fjerne nedbryting og resuspend pellets med en liten mengde PBS (5 mL) og videre til trinn 3.9.
- Fjerne en 50 µL aliquot fra vask #1 (eller fra DR) etter graden av crypt dissosiasjon og mengde rusk. Plasser vev i en ny 50 mL konisk tube (vask #2 #3, etc.) fylt med 25 mL kaldt PBS og rist til intakt crypts er isolert med minimal rusk og villi.
Merk: Målet er å isolere en ren brøkdel med intakt Krypter og minimal rusk. Hver ekstra vask renser cellene men for mye risting vil begynne å føre til sekundære vev/celleskader. De beste resultatene med minst forurensning vil videre oppnås hvis crypts er belagt fra en wash trinn og ikke fra et dissosiasjon reagens skritt. - Fjern gjenværende vevet sentrifuge 50 mL konisk rør 200 x g i 5 minutter for å fjerne nedbryting, og resuspend gjenværende krypten pellet i mindre volum PBS (5 mL).
- Bruker en invertert mikroskop, undersøke 50 µL dele hver prøve antall Krypter/brøkdel. Målet er 50-100 Krypter/50 µL, dette blir størrelsen på den endelige matrix patty.
Merk: Hvis prøven for konsentrert, fortsette å legge kaldt PBS til ønsket konsentrasjon er nådd. Hvis prøven er også fortynnet, bestemme antall dele nødvendig å nå ønsket krypten avkastningen og justere. - Aliquot riktig volum av crypts (bestemmes av aliquot observasjoner) inn i et microcentrifuge rør. For eksempel hvis utvalget inneholder 50 Krypter/50 µL så aliquot 50 µL per patty X 3 replikerer = 150 µL / microcentrifuge rør. Hvis utvalget inneholder bare 25 Krypter/50 µL så 2 dele nødvendig patty X 3 replikerer = 300 µL/rør.
- Pellet Krypter 200 x g i 5 min på 4° C.
- Forsiktig resuspend pelleted Krypter med riktig volum av master mix (50 µL per brønn). Bland godt av raskt pipettering 15 ganger uten luftbobler.
Merk: Cool pre pipette spissen med kaldt sterilt PBS før aspirating master mix. Dette vil hjelpe holde master mix fra å spre seg. Tips kan også holdes i kjøleskapet og plassert i panseret umiddelbart før å bruke. - Dispensere en 50 µL master blande addisjonstegn krypten dråpe i midten av hver brønn av en forvarmes 24 godt plate.
- Inkuber kultur plate i 30 min på 37 ° C.
- Overlappe hver matrise patty med 500 µL / vel av IESC media (ingen ekstra vekstfaktorer som trengs på dag 0 de finnes i master mix).
- Legg til 500 µL sterilt PBS alle ubrukte brønner igjen på tallerkenen å opprettholde fuktighet.
- Telle antall belagt Krypter dag 0.
Merk: Det er nyttig å pre rutenett hver celle kultur plate i kvadranter å sikre mer nøyaktig telling. - Telle antall enterospheres hver 24 h og overvåke enteroid utvikling daglig.
- Legg vekstfaktorer til hver godt hver 48 h. fjerne IESC media hver 96 h og erstatte med 500 µL frisk media (vekst faktorer må deretter legges til media).
Representative Results
Komplett intestinal iskemi ble opprettet i intestinal løkker ved å benytte vaskulær okklusjon Sutur eller prøveklemmer som vist i figur 1. Ved å frigjøre klemmer, kan en kontrollert periode reperfusion utføres, og tillater for ytterligere studier av påfølgende reperfusion skade hvis ønskelig. Alle dyrene overlevde under prosedyren med minimal komplikasjon til euthanasia. Den vanligste kirurgiske komplikasjonen ble hypotensjon, som løst med tilskudd av en positiv inotrope som dobutamin.
Hvis utført riktig, iskemiske skader starter på spissen av intestinal villus og overføre ned i krypten som varigheten av iskemi øker (figur 2). En vanlig feil med kirurgiske teknikken kan oppstå når blodkar ikke samskrevet eller festet jevnt. Resultatet er en hemoragisk ischemia (Figur 3), der tynnvegget venen kollapser før arterien, slik at ytterligere blod å infiltrere vev. Dette er grovt sett som en mørk lilla serosal overflate (Figur 3venstre) sammenlignet med en lysere overflate i fullstendig iskemi (Figur 3høyre).
Etter fjerning av iskemiske intestinal looper var intestinal Krypter med hell isolere følger dissosiasjon protokollen (Figur 4). Som forventet, Krypter fra mer alvorlig skadet timepoints ble ofte brutt (f, fragment) og krypten fraksjoner inneholdt mer bakgrunn mobilnettet rusk i forhold til de som gjennomgikk nei eller mild skade. Under protokollen, må alvorlig skadet tarmen ristes forsiktig for å unngå ytterligere skade på underliggende vev. Risting kan for lag resultere i ytterligere krypten skader og fleste av crypts havne i DR løsninger som inneholder EDTA, noe som resulterer i flere avbrudd.
Når belagt, Krypter fra alle tidspunkt av iskemi overleve og kunne blitt etablert i kultur (figur 5). Når normal og mildt skadet intestinal crypts er belagt i kultur, enterospheres skjema innen 24-48 timer. Med alvorlig iskemiske skader (3 og 4 h), intestinal crypts overleve, men er skadet, som resulterer i dannelsen av mye mindre kuler først. 72-120 h blitt enteroids mer komplekse med åpenbare sentrale lumen og spirende strukturer. Total, det er en redusert vekst effektivitet i Krypter samt en redusert størrelsen på enteroids fra den etterlate tarmen tissue (Gonzalez, L.M., upubliserte Data, 2017).
Figur 1 : Kirurgisk modell av komplett intestinal iskemi i en porcine modell. A) normal svin jejunum exteriorized. B) hvem skip har vært samskrevet med Sutur opprette intestinal ischemia. C) ischemia opprettet med bulldog vaskulær klemmer for å tillate vev reperfusion hvis ønsket. D) intestinal blodkar umiddelbart etter fjerning av vaskulær klyper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Histologic bevis (hematoxylin og eosin (H & E) flekken) på økende epithelial skade etter lengre varighet for fullstendig intestinal iskemi. Skade starter på spissen av villus gradvis tap av enkeltcelle epiteliale lag, villus blunting og cellular skade utvide til krypten base med alvorlige skader (opptil 4 h varighet). 100 µm skala bar. Jeg = Ischemia. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Brutto- og histologic bevis på hemoragisk iskemi. A) brutto fotografi sammenligne hemoragisk iskemi (venstre loop) og fullstendig iskemi (høyre loop). Når er blodkar ikke samskrevet eller festet jevnt, kan blod fortsette å infiltrere vev, som resulterer i flere betennelse og skade. B) H & E bilder av hemoragisk iskemi av økende varighet fra 1-4 h. I tillegg cellular skade sett med komplett iskemi, er det bevis på røde blodlegemer infiltrasjon i den omkringliggende lamina propria. 100 µm skala bar. Jeg = Ischemia. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Dele intestinal Krypter isolert fra ledd av iskemiske og normal tarm. Komplett, intakt intestinal crypts (stjerner) var med hell isolere fra hver bue av tarmen. Som forventet, Krypter fra mer alvorlig skadet tidspunkt var ofte brutt (f, fragment) og krypten fraksjoner inneholdt mer bakgrunn mobilnettet rusk i forhold til de som gjennomgikk nei eller mild skade. 100 µm skala bar. Jeg = Ischemia. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Gang løpet av intestinal stamcelleforskningen vekst etter isolasjon fra iskemiske ledd av tynntarm. Når normal intestinal Krypter var belagt i kultur, dannet enterospheres innen 24-48 timer. Med alvorlig iskemiske skader (3 og 4 h), Krypter overleve, men utgjør mye mindre kuler først. 72-120 h blitt enteroids mer komplekse med åpenbare sentrale lumen og spirende strukturer. 20 µm skala bar ikke oppgitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Vekstfaktor | Fortynner | Lager konsentrasjon | Lager fortynning | Arbeider fortynning |
| R-Spondin | PBS | 100 X | 100 µg/ml | 1 µg/ml |
| Noggin | SW/0.1%BSA | 1000 X | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| EGF | 10mM eddiksyre | 10 000 X | 500 µg/ml | 50 ng/ml |
| A-83-01 | DMSO | 1000 X | 500 ΜM | 500 nM |
| SB202190 | DMSO | 3000 X | 30 mM | 10 ΜM |
| Nikotinamid | SW | 1000 X | 1 M | 1 mM |
| Gastrin | PBS | 10 000 X | 100 ΜM | 10 nM |
| Y-27632 | PBS | 1000 X | 10 mM | 10 ΜM |
| LY2157299 | DMSO | 10 000 X | 5 mM | 0,5 ΜM |
| CHIR99021 | PBS | 1000 X | 2.5 mM | 2,5 ΜM |
| Wnt3a | PBS | 2000 X | 200 µg/ml | 100 ng/ml |
Tabell 1: vekstfaktor reagens tabell. Sammendrag av vekstfaktor lager løsninger og arbeider løsninger brukes i denne protokollen.
Discussion
Utviklingen av en porcine modell av Segmentinformasjon intestinal iskemi utvider på tidligere murine modeller av muliggjør studiet av flere tidspunkt for vev skade innenfor samme dyret. Det er flere kritisk diskusjon rundt denne protokollen inkludert riktig fartøyet hemorroider, vev reperfusion og vellykket krypten cellekultur.
Riktig fartøyet hemorroider er avgjørende for etableringen av en modell av komplett ischemia. Hvis suture er knyttet ujevnt eller klemmen ikke strammet helt, blod fra arteria tykke vegger kan fortsette å angi vevet og kan ikke avsluttes på grunn av sammenbruddet av tynne vegger venen. Dette resulterer i bloduttredelse blod i lamina propria forårsaker ytterligere vevsskade. Imidlertid avhengig av iskemiske skader blir studert, kan fullstendig eller hemoragisk iskemi være ønsket. For eksempel under intestinal transplantasjon, er tarm helt atskilt fra den vascular forsyningen (arterien og venen) i resection fasen av prosedyren, som resulterer i fullstendig intestinal iskemi. Alternativt, men når mesentery er vridd under en hendelse som en intestinal Tarmslyng, venøs retur er ofte hindret først fører til ytterligere blod i vevet før arterial tilførsel blir hindret, dermed skape hemoragisk ischemia.
Iskemiske skader resulterer i skade på vev starter på villus spissen og utvide nedover til bunnen av crypt3. Under iskemi, energi i form av adenosin trifosfat fortsetter å bli brukt og genererer metabolitten hypoxanthine. Når vev er reperfused med oksygen, hypoxanthine blir metaboliseres xantin oksidase og produserer superoxide frie radikaler fører til mucosal skade og attraksjon av vev skade nøytrofile17,18. Arter forskjeller i slimhinnene vaskulær arkitektur samt varierende uttrykk for xantin oksidase, resultere i varierende grad av reperfusion skade3. Feline og gnager modeller av ischemia-reperfusion er mer utsatt for reperfusion skade reaktive oksygen metabolitter19,20. Derimot ble griser funnet for å ha mindre xantin oksidase, og derfor mindre reperfusion skade, noe som gjør denne modellen mer sammenlignbar med den menneskelige tarmen iskemi21. På denne tiden har bruk av knockout eller transgene svin modeller å studere intestinal skade ikke blitt beskrevet, gjør dette en stor begrensning av denne modellen. Valg av riktig dyr modellen avhengig sykdommen prosessen eller bestemt betingelse forskeren ønsker å studere. For eksempel har svin modeller av iskemiske skader opptil 6 h vært beskrevet22, mens mest iskemiske prosedyrer i murine modeller er 45-60 min23.
Vellykket isolering av intestinal Krypter fra normal og ischemically skadet tarmen muliggjør studiet av epitelial utvinning i kultur. Dette systemet lar forskeren fokusere unikt på epitel alene, så det er ikke vascular forsyning eller immun celle komponent å vurdere. Dette gir mulighet til å studere tarmepitelet vekselsvirkningene og gjenoppretting etter skade i tillegg til responsen på ulike vekstfaktorer eller behandlinger administreres under kirurgi eller følgende krypten isolasjon av supplere kultur media. Dette trinnet er den vanskeligste, som isolasjon fra etterlate looper krever forsiktig risting og rask fjerning av EDTA inneholder løsninger i tilfelle crypts har blitt for tidlig avstand. Hvis disse løkkene av tarmen ikke er grundig vasket, har crypts potensial til å bli forurenset i kultur. Som et resultat, lagt antibiotika-antimycotic løsning til begge DR løsninger i tillegg til IESC media. En annen diskusjon point fokuserer på tarmen samlet som en normal kontroll. Som dyrene gjennomgår anestesi med mulige endringer i systemisk vevsperfusjon, sammen med muligheten for sirkulerende inflammatoriske mediatorer sekundært til iskemi, kan med "normale" kontroll vev ikke representere en sann kontroll. I disse eksperimentene er det å merke at kontroll vevet syntes grovt og histologisk sammenlignbare til vev fra dyr som ikke gjennomførte iskemi i andre eksperimenter (Gonzalez, L.M., upubliserte Data, 2017).
I sammendraget beskriver denne metoden en reproduserbar modell av svin intestinal iskemi, som tett modeller hva som skjer i menneskelige iskemiske skader. I tillegg isolering av intestinal stamceller fra iskemiske looper er beskrevet, som tjener til å studere epithelial reparasjon og mulig respons på behandling i kultur.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 og Institutt for klinisk Sciences formidling midler
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free | Fisher Scientific | BP-399 | Dilute 1:10 |
| Distilled, deionized water (ddH2O) | Used to prepare EDTA and PBS | ||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Scientific | 20688 | |
| Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED45 | Make fresh before each experiment; pH 7.4 |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Gibco | 15240-096 | Anti-Anti solution |
| Recombinant human Wnt-3a | R & D Systems | 5036 WN/CF | |
| Recombinant human Rspondin1 | R & D Systems | 4645- RS | |
| Recombinant human Noggin | R & D Systems | 6057-NG | |
| Recombinant human EGF | R & D Systems | 236-EG | |
| LY2157299 | SelleckChem | 52230 | |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
| Human [leu]15-Gastrin 1 | Sigma Aldrich | G9145 | |
| SB202190 | Sigma Aldrich | 57067 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Water, WFI Quality | Corning, Inc. | 25-055-CM | Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Matrigel Matrix, GFR | Corning, Inc. | 356231 | Phenol red free |
| 24 Well Culture Dish | Corning, Inc. | 3524 | |
| Conical Tube, 50 ml | Corning, Inc. | 430828 | |
| Scalpel Handle | World Precision Instruments | 500236 | |
| Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 | World Precision Instruments | 504169 | |
| Tissue Forceps | World Precision Instruments | 15918 | |
| Debakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501239 | |
| Mayo Scissors | World Precision Instruments | 501752 | Curved or straight |
| Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments | 501739 | |
| Mosquito Forceps, Curved | World Precision Instruments | 503724-12 | Curved or straight (503728-12) |
| Hopkins Bulldog Clamp | Stoelting Co. | 52120-40P | Straight |
| Silk, 2-0 | Henry Schein | 685S-BUT | Any similar brand is acceptable |
| Towel Clamps | World Precision Instruments | 501700 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | V503382 | |
| Wire suture, 20 gauge | Henry Schein | 19075 | Cut and straighten before use. |
| Surgical Towels | Henry Schein | ST1833 | Any similar product is acceptable. |
| Lactated Ringers Solution | Henry Schein | 9851 | |
| Chlorhex antiseptic scrub (4%) | Henry Schein | VINV-CHMX-SCRB | Any similar brand is acceptable |
| Isopropyl Alcohol 70% | Henry Schein | MS071HS | Any similar brand is acceptable |
| IV catheter, 22 gauge | Henry Schein | 2225PUR | May need 20g or 24 g depending on size of the vein |
| Xylazine (100 mg/ml) | Henry Schein | 33198 | |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 11695-6835-1 | Controlled medication |
| Isoflurane solution | Henry Schein | 10015516 | |
| Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) | Vortech Pharm. | Multiple brands of Pentobarbital Sodium available. | |
| Heating pad | Gaymar | Tpump Core Warming System; others are available. | |
| Mindray Datascope Monitor | Mindray North America | Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable | |
| Vaporizer | Vetland Medical | Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available. | |
| Fluid Pump | Abbott Hospira | Plum A+; Any similar manufacturer is recommended. |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Blikslager, A. T. Treatment of gastrointestinal ischemic injury. Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).
- Podolsky, D. K. Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense. Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
- Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids-Current and future applications. Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. J Vis Exp. (97), (2015).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2015).
- Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. (1995).
- Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).
- Schoenberg, M. H., et al. Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine. Gut. 32 (8), 905-912 (1991).
- Nilsson, U. A., et al. Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine. Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).
- Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event. J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia. Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).
- Shegarfi, H., et al. Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion. Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).
- Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. (111), (2016).
