Summary
Detta protokoll kan läsarna att framgångsrikt etablera en svin modell av segmentell intestinal ischemi och därefter isolera och kultur intestinal stamceller för studien av epitelial reparation efter skada.
Abstract
Intestinal ischemi förblir en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet och veterinärmedicinska patienter. Många sjukdomsprocesser resultera i intestinal ischemi, när blodtillförseln och därför syre minskas till tarmen. Detta leder till tarmbarriären förlust och skador i underliggande vävnad. Intestinal stamceller uppehålla sig vid basen av kryptor av Lieberkühn och ansvarar för intestinal förnyelse under homeostas och följande skada. Ex vivo cell kultur tekniker har tillåtit för framgångsrika studier av epitelial stamceller interaktioner genom att upprätta odlingsbetingelser som stöder tillväxten av tredimensionella epiteliala organ-liknande system (kallas ”enteroids” och ” colonoids ”från små och stora inälvan, respektive). Dessa enteroids är sammansatt av kryptan och villus-liknande domäner och mogna för att innehålla alla de celltyper som finns inom epitel. Murina modeller har historiskt använts för att studera intestinal skada. Men erbjuder en svin modell flera fördelar inklusive likheten mellan storlek samt gastrointestinala anatomi och fysiologi som människor. Genom att utnyttja en svin modell, upprätta vi ett protokoll där segmentell slingor av intestinal ischemi kan skapas inom ett enda djur, gör det möjligt att studera olika tidpunkter av ischemisk skada och reparera i vivo. Dessutom beskriver vi en metod för att isolera och kultur de intestinala stamcellerna från ischemisk slingor av tarmen, vilket möjliggör fortsatt studiet av epitelial reparation, moduleras av stamceller, ex vivo.
Introduction
Intestinal ischemisk skada, till följd av minskad syre tillgänglighet på grund av en minskning eller komplett ocklusion av blodflödet till tarmen, är fortfarande en betydande orsak till sjuklighet och dödlighet i människors och djurs patienter1,2. Ischemisk skada, tillsammans med efterföljande inflammation och cellulär infiltration, leder till slemhinnor barriär kompromiss. Slemhinnor barriären är kritisk till att förebygga bakteriell translokation och associerade gifter i den systemiska cirkulation3,4. Efterföljande reperfusion av ischemisk vävnad kan resultera i bildandet av skadliga reaktiva syreradikaler som kan förvärra skadan5. Eftersom intestinal ischemi är sällan förebyggas, har mest aktuella forskning fokuserat på att vidareutveckla metoder för tidig upptäckt av ischemi och utvecklingen av nya terapeutiska metoder som minskar reperfusion skada eller målet slemhinnor reparation.
Djurmodeller har använts i stor utsträckning att expandera vår grundläggande vetenskap kunskap om ischemi-reperfusionsskada och förbli imperativ för translationell forskning. Djurmodeller har varit den mest använda på grund av deras förmåga att vara genetiskt manipulerade6. Mer nyligen dock har användningen av stora djurmodeller, särskilt gris, förespråkats för framtida translationella studier på grund av ett antal fördelar inklusive svin anatomiska och fysiologiska likheter människor7,8. En mängd skada modeller har utvecklats för att studera ischemi-reperfusionsskada och inkluderar komplett vaskulär ocklusion, lågt flöde ischemi och segmentell mesenterica vaskulär ocklusion. En fullständig översyn av dessa modeller är utanför sfären av denna artikel men författarna direkt läsare till en nyligen granskning3.
Förutom i vivo modeller erbjuder ex vivo cellulära kultur system ett lovande verktyg för att studera intestinal homeostas och reparation efter skada. Intestinal stamceller ansvarar för cellulär proliferation och omsättning av intestinal epitel slemhinnan. När isolerade från normal eller skadade tarmen, intestinal stamceller kan upprätthållas i kultur och fungera som ett verktyg eller en modell för att studera stamceller och epitelial cellbiologi. Metoder att isolera och fastställa dessa tredimensionella kultur system (som kallas enteroids och colonoids när härrör från små och stora inälvan, respektive) har beskrivits för en mängd arter och orgel system9,10 ,11,12,13. Specifikt inom magtarmkanalen, har dessa kultur-system använts till modell gastrointestinal sjukdom inklusive cancer, patogen infektion och inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom14. Vid denna tid finns det inga rapporter som beskriver isolering och underhåll av intestinal stamceller från ischemically skadade tunntarmen i alla arter. Därför, här beskriver vi processen för intestinal ischemi i en roman, stora svin djurmodell vilket ger reproducerbara skada och förmågan att isolera intestinal stamceller från normala och ischemically skadade tarmen för ytterligare studier av återhämtning för ex vivo.
Protocol
För dessa experiment godkändes alla djurstudier av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av North Carolina State University.
1. beredning för kultur
Obs: Alla reagenser som listas i Tabell för material. Specifika tillväxtfaktor koncentrationer anges i tabell 1.
- Bered en 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syra i destillerat avjoniserat vatten (ddH2O). Blanda tillräckligt och justera pH till 7,4 med hjälp av NaOH och HCl lösningar.
Obs: Gör upp EDTA stamlösning färska innan varje experiment. - Förbereda dissociation reagens #1 (DR #1) som följer och placera på is: kombinera fosfatbuffrad saltlösning utan Ca2 + och Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1,4-Ditiotreitol (DTT), 10 µM Y27632 och 1 X antibiotikum-Antimycotic lösning (anti Anti) som innehåller penicillin, streptomycin och amfotericin B.
Lägg Till Y27632 omedelbart före vävnad samlingen. - Förbereda dissociation reagens #2 (DR #2) som följer och placera i 37 ° C vattenbad: kombinera PBS utan Ca2 + och Mg2 +, 0,5 M EDTA, 10 µM Y27632 och 1 X anti Anti. Lägg Till Y27632 omedelbart före vävnad samlingen.
- Förbered intestinal epitelial stamceller (IESC) enligt följande: blanda 25 mL avancerade DMEM/F12 medium med 1 X N2 tillägg, 1 X B-27 tillägg, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax och 1 X anti Anti. Förvaras vid 4 ° C fram till användning.
- Förbereda en master mix av minskad tillväxtfaktor basalmembranet matris (matris) och kompletterande tillväxtfaktorer som följer: Tina matrisen på is. Lägg till 100 ng/mL i en mikrocentrifug rör, rekombinant mänsklig skalle, 500 ng/mL rekombinant human R-Spondin 1, 50 ng/mL rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (EGF) 100 ng/mL rekombinant human-Wnt3a, 10 mM nikotinamid, 10 nM gastrin, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 och 2,5 µM glykogen syntetas 3 tyrosinkinashämmare (GSK3i, CHIR99021). När matrisen är tinade, komplettera med tillväxtfaktor mix (gör master mix) och lagra på is.
Obs: Var noga med att undvika att införa luftbubblor som detta kommer att skapa artefakt inom matrix patty under plätering. - Pre varm en 24-väl vävnadsodling maträtt i en 37 ° C inkubator före start cell isolering förfaranden.
2. kirurgiska modell av ischemi och vävnad samling
- Användning åtta till tio veckor gamla Yorkshire korsavlade svin oavsett kön (rekommenderas). Ta bort allt foder 16-18 h före operation. Tillåta grisar tillgång till vatten hela tiden.
- Schemalägga svinen att anlända minst 48 h innan experimenten att möjliggöra miljömässiga acklimatisering.
Obs: Utbildad veterinär eller laboratorium tekniker under tillsyn av en legitimerad veterinär ge rutinmässiga djurens vård och hjälp med bedövningsmedel förfaranden. - Premedicate gris med xylazin (1,5 mg/kg intramuskulärt (IM)) och ketamin (11-20 mg/kg (IM))15. När stillsam, intubation gris orotracheally.
- Upprätthålla grisar under narkos med isofluran (2-5%) förångas i 100% O2 fram till tidpunkten för dödshjälp.
- Placera en intravenös (IV) kateter (örat ven rekommenderas) och administrera en ersättning vätska såsom ringer ringers lösning underhåll uppgå till 15 mL/kg/h.
- Utföra rutinen bedövningsmedel övervakning inklusive pulsoximetri, EKG och indirekta blodtryck mätningar15. Övervaka grisen andningsfrekvens och ansträngning och ventilera manuellt eller mekaniskt som behövs om slutet tidal CO2 stiger över 55-60 mmHg.
Observera: Lämplig anestesi bekräftas av kontinuerlig övervakning av trender i puls (intervallet 80-130 slag/min), icke-invasivt blodtryck (medelvärde artärtryck 75-100 mmHg), och andningsfrekvens (10-25 andetag/min)16och periodisk kontroll för frånvaro av käken och anal ton. Djup av anestesi kan också bedömas som grad av muskelavslappning och muskel fasciculation efter kirurgiskt stimulus. Okulär reflexer är oftast ingen värdet16. Smärtlindring kan tillhandahållas som regisserad av principen institutioner IACUC. I det här fallet kan en opioid, såsom buprenorfin, administreras under operation. - Placera grisen på en värmedyna och hindrar i dorsala koordinationsrubbning för det kirurgiska ingreppet.
- Raka ventrala buken och prep använder kirurgisk scrub (klorhexidin lösning) och isopropylalkohol.
- Gör ett 8-10-cm ventrala mittlinjen snitt med hjälp av en skalpell blad centrerad på umbilicus tillgång till buken.
- Identifiera den tunntarm (jejunum) ca 40 cm muntligen ileocecal korsningen. Avgränsa tio-cm långa slingor av jejunum genom maskrad ligating tarmen två gånger, en cm mellan varje ligatur, innan du skapar efterföljande loopar 10 cm ligger muntligen (figur 1).
- Skapa två slingor per tidpunkt av ischemi intill varandra, en för ischemi och en för ischemi med en ytterligare 1h reperfusion på om så önskas. För att skapa kompletta ischemi (inget flöde av antingen artärer eller vener), klämma eller ligera den mesenteriska kärlsystemet med bulldog vaskulär klämmor, böjda Halstead mygga Peanger eller 2-0 icke-absorberbara silk för 1, 2, 3 och 4h och sedan ta bort klämmorna för 1h reperfusion, om så önskas.
Obs: Författarna skapade alla slingor av ischemi i ordning börjar med 4h ischemisk slingan och fortskred flyttar proximalt (till att minimera totala kirurgi tid). För att lösa möjligheten att angränsande ischemisk intestinal segment kan skada intilliggande loopar, kan ordningen på ischemisk slingor varieras. Detta kan förändra total kirurgisk tid.
Obs: Tidsramen reperfusion kan varieras utifrån forskningsfrågan av intresse eller om terapier vill testas under reperfusion. Dock som vävnadsskador blir svårare från ökar varaktigheten för ischemi ensam, bidrar reperfusionsskada sannolikt inte till ytterligare epitelial skador. Reperfusion spelar sannolikt en roll efter milda perioder av ischemisk skada. - Mellan ischemi tidpunkter, hålla buken täcks eller stängas med en steril handduk eller en handduk klämma.
Obs: Inom ett enda djur för detta experiment, åtta ischemisk segment kan skapas. Identifiera ett ytterligare jejunal segment, minst 5-10 cm proximalt sista ischemisk slingan, som ska fungera som en normal internkontroll. - Hindra cirka tre mesenteriala fartyg per bulldog vaskulär klämma eller böjda Halstead mygga hemostat. Försiktighet måste iakttas under hemostat ansökan eftersom fartygen är enkelt traumatiserade. Försök att stapla fartygen i käftarna på klämmorna.
- I slutet av experimentet, följande eutanasi med pentobarbital 85-100 mg/kg IV, samla alla slingor av vävnad med metzenbaum sax, efter döden har bekräftats med inga hjärtslag auscultated och förlust av hornhinnans reflexen. Börja genom att samla en kontroll bit av normala jejunum minst 5 - 10 cm proximalt till den sista ischemiska slingan.
- Avskiljer och lagrar slingor från varje skada tidpunkt i små behållare iskall PBS förrän du är klar för crypt isolering.
Obs: Om så önskas, göra ischemisk loopar tillräckligt länge för att dela upp i separata prover för histologi och intestinal stamceller kultur; Författarna har dock funnit att loopar större än cirka 10 cm lång är mest sannolikt att bli hemorragisk.
3. crypt (stamceller) isolering från ischemisk och reglerkretsar
- Invertera varje loop av tunntarmen med ett 20-gauge tråd och vävnad pincett för att exponera slemhinneepitel. Slips i toppen och botten av slingan säkert till tråd med sutur (2-0 icke-absorberbara silke eller motsvarande).
- Efter invertering, skölj varje slinga i is kallt PBS att avlägsna luminala skräp.
- Placera prover omedelbart i 50 mL koniska rör som innehåller DR #1 på isen i 30 min.
- Samla in loopar börjar med kontroll och följ med slingor av inkrementellt ökande varaktighet av ischemi. Slingor från mindre skadad vävnad (dvs. kontroll och 1 h ischemisk vävnad) kan skakas kraftigt, knäppa handleden för bästa resultat. Vävnader från allvarligt skadad vävnad (3 och 4 h av ischemi) bör vara försiktigt rockade eller inverterad endast eftersom för mycket skakar kommer att orsaka störningar i kryptan och ytterligare vävnad förstörs. Rören bör skakas eller inverterad var 5 minut medan på is.
- Över prover till DR #2 under 10 minuter i 37° C vattenbad. Skaka eller invertera rören var 5 minut.
- Efter överföra vävnader, Centrifugera de koniska rör som innehåller DR #1 från 2-4 h skadad slingor att ta bort den supernatant EDTA (200 x g för 5 min). Dessa vävnader är mycket skadade är det möjligt kryptor har redan blivit separerade. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten med en liten volym av PBS (5 mL) och fortsätt till steg 3,9.
- Ta bort prover från DR #2 och placera vävnadsprover direkt i 25 mL kall PBS på is (etikett som Wash #1). Placera proverna i orbitalskak på isen vid 60 rpm. Fortsätter att skaka eller invertera varje tub för 30 s varje 2 till 5 min.
- Efter överföra vävnader, snurra de koniska rör som innehåller DR #2 från 2-4 h skadad slingor för att ta bort EDTA supernatant (200 x g för 5 min). Dessa vävnader är mycket skadade är det möjligt att kryptor har blivit separerade. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten med en liten volym av PBS (5 mL) och fortsätt till steg 3,9.
- Ta bort en 50 µL alikvot tvätta #1 (eller från DR) att kontrollera graden av kryptan dissociation och mycket skräp. Placera vävnad i en ny 50 mL koniska tub (tvätta #2, #3, etc.) fylld med 25 mL kall PBS och skaka tills intakt kryptor är isolerade med minimal skräp och villi.
Obs: Målet är att kunna isolera en ren bråkdel med intakt kryptor och minimal skräp. Varje ytterligare tvätt kommer att rensa cellerna men för mycket skakar börjar att leda till sekundära vävnads-eller cellprodukter skador. Dessutom kommer bäst resultat med minst förorening att uppnås om kryptor är pläterade från en tvättningen och inte från en dissociation reagens steg. - Ta bort återstående vävnaden Centrifugera 50 mL koniska rören vid 200 x g i 5 minuter för att ta bort supernatanten och återsuspendera kvar crypt pelleten i mindre volym av PBS (5 mL).
- Använder ett inverterat Mikroskop, undersöka 50 µL portioner av varje prov att avgöra antalet kryptor/fraktion. Målet är 50-100 kryptor/50 µL, eftersom detta kommer att vara storleken på den slutliga matrix patty.
Obs: Om provet är alltför koncentrerade, Fortsätt att lägga till kalla PBS tills önskad koncentration uppnås. Om provet är alltför utspädd, bestämma Antal portioner som behövs för att nå önskad crypt avkastning och justera. - Alikvotens lämpliga volymer av kryptor (bestäms av alikvotens observationer) in i en mikrocentrifug rör. Till exempel om provet innehåller 50 kryptor/50 µL sedan alikvotens 50 µL per patty X 3 replikerar = 150 µL / mikrocentrifug rör. Om provet innehåller endast 25 kryptor/50 µL sedan 2 portioner behövs / patty X 3 replikerar = 300 µL/tube.
- Pellet kryptor vid 200 x g under 5 minuter vid 4° C.
- Försiktigt resuspendera pelleterat kryptor med lämplig volym av master mix (50 µL per brunn). Blanda omsorgsfullt genom att snabbt pipettering 15 gånger utan att skapa luftbubblor.
Obs: Cool pre pipettspetsen med kall steril fosfatbuffrad Koksaltlösning före aspirera huvudmixen. Detta kommer att hålla huvudmixen från utspridning. Tips kan även förvaras i kylskåp och placeras i huven omedelbart före användning. - Fördela en 50 µL master mix plus crypt droplet i mitten av varje brunn före värmde 24 väl platta.
- Inkubera kultur plattan under 30 minuter vid 37 ° C.
- Radarbild varje matris patty med 500 µL / väl av IESC media (ingen ytterligare tillväxtfaktorer som behövs på dag 0 eftersom de finns inom huvudmixen).
- Tillsätt 500 µL sterilt PBS eventuella oanvända brunnar kvar på plattan att behålla fuktigheten.
- Räkna antalet guldpläterade kryptor dag 0.
Obs: Det är bra att före rutnät varje cell kultur plattan i kvadranter för att säkerställa mer exakt räkna. - Räkna antal enterospheres varje 24 h och övervaka enteroid utveckling dagligen.
- Lägg till tillväxtfaktorer för att varje väl varje 48 h. bort IESC media varje 96 h och ersätta med 500 µL färska media (tillväxtfaktorer måste sedan läggas till media).
Representative Results
Komplett intestinal ischemi skapades i liten tarm loopar genom att utnyttja vaskulär ocklusion med sutur eller klämmor som visas i figur 1. Genom att släppa klämmorna, kan en kontrollerad period reperfusion utföras, vilket möjliggör ytterligare studie av efterföljande reperfusionsskada om så önskas. Alla djur överlevde under förfarandet med minimal komplikation till dödshjälp. Den vanligaste kirurgiska komplikationen var hypotoni, vilken försvann med tillskott av en positiv inotrop såsom dobutamin.
Om utförs korrekt, ischemisk skada börjar på spetsen av den intestinala villus och migrera ner i kryptan som varaktigheten av ischemi ökar (figur 2). Ett vanligt misstag med operationsteknik som kan uppstå när blodkärlen inte sammanskrivna eller spänns jämnt. Resultatet är en hemorragisk ischemi (figur 3), där tunna venen kollapsar innan artären, vilket möjliggör ytterligare blod att infiltrera vävnader. Detta är grovt ses som en mörk lila serös yta (figur 3, vänster) jämfört med en blekare yta under komplett ischemi (figur 3, höger).
Efter avlägsnande av ischemisk intestinal slingor isolerades intestinal kryptor framgångsrikt efter protokollet dissociation (figur 4). Som förväntat, kryptor från mer allvarligt skadad tidpunkter ofta bröts (f; fragment) och crypt fraktioner innehöll mer bakgrund cellulära skräp jämfört med de som genomgick nr eller lindriga skador. Under protokollet, måste svårt skadade tarmen skakas försiktigt för att undvika ytterligare skador i underliggande vävnad. Alltför grovt kan skakningar resultera i ytterligare crypt skada och majoriteten av de kryptor hamna i DR lösningar som innehåller EDTA, vilket resulterar i ytterligare störningar.
När förgylld, kryptor från alla tidpunkter av ischemi överleva och kunna etablera sig i kultur (figur 5). När normala och lindrigt skadade intestinal kryptor är klädd i kultur, enterospheres form inom 24-48 h. Med svår ischemisk skada (3 och 4 h), intestinal kryptor överlever men skadas, vilket resulterar i bildandet av mycket mindre områdena initialt. Av 72-120 h blir enteroids mer komplexa med uppenbara central lumen och spirande strukturer. Sammantaget finns det en minskad tillväxt effektivitet i kryptor samt en minskad storlek på enteroids som härrör från den allvarligt skadad Tarmvävnaden (Gonzalez, L.M., opublicerade Data, 2017).
Figur 1 : Kirurgiska modell av komplett intestinal ischemi i en svin modell. (A) normal svin jejunum exteriorized. (B) mesenteriala fartyg har varit sammanskrivna med sutur skapa intestinal ischemi. (C) ischemi skapats med bulldog vaskulär klämmor för att möjliggöra vävnad reperfusion om så önskas. (D) intestinal vaskulatur omedelbart efter borttagning av vaskulär klämmorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Histologiska bevis (hematoxylin och eosin (H & E) fläcken) öka epitelial skador efter längre löptider komplett intestinal ischemi. Skador börjar på spetsen av villus med gradvis förlust av enstaka cell epitelskiktet, villus avtrubbning och cellulära skador sträcker sig ner till kryptan bas med svåra skador (upp till 4 h varaktighet). 100 µm skalstapeln. Jag = ischemi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Brutto och histologiska bevis för hemorragisk ischemi. (A) brutto fotografi jämföra hemorragisk ischemi (vänster loop) och komplett ischemi (höger loop). När vaskulatur inte sammanskrivna eller spänns jämnt, kan blod fortsätta att infiltrera vävnaderna, vilket resulterar i ytterligare inflammation och skador. (B) H & E bilder av hemorragisk ischemi av ökande varaktighet från 1-4 h. Utöver cellulära skador sett med komplett ischemi, finns det bevis för röda blodkroppar infiltration i omgivande lamina propria. 100 µm skalstapeln. Jag = ischemi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Alikvoter av intestinal kryptor isolerade från slingor av ischemisk och normala tarmen. Komplett, intakt tarm kryptor (asterisker) var framgångsrikt isolerade från varje slinga av tarmen. Som förväntat, kryptor från mer allvarligt skadad tidpunkter ofta bröts (f; fragment) och crypt fraktioner innehöll mer bakgrund cellulära skräp jämfört med de som genomgick nr eller lindriga skador. 100 µm skalstapeln. Jag = ischemi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Tidsförloppet för intestinal stamcellstillväxt efter isolering från ischemisk slingor av Liten inälva. När normala intestinal kryptor var klädd i kultur, bildade enterospheres inom 24-48 h. Med svår ischemisk skada (3 och 4 h), kryptor överleva men bildar mycket mindre områdena initialt. Av 72-120 h blir enteroids mer komplexa med uppenbara central lumen och spirande strukturer. 20 µm skala bar om inget annat anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tillväxtfaktor | Spädningsvätska | Beståndet koncentration | Beståndet utspädning | Arbetar utspädning |
| R-Spondin | PBS | 100 X | 100 µg/ml | 1 µg/ml |
| Skalle | SW/0.1%BSA | 1000 X | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| EGF | 10mM ättiksyra | 10 000 X | 500 µg/ml | 50 ng/ml |
| A-83-01 | DMSO | 1000 X | 500 ΜM | 500 nM |
| SB202190 | DMSO | 3000 X | 30 mM | 10 ΜM |
| Nikotinamid | SW | 1000 X | 1 M | 1 mM |
| Gastrin | PBS | 10 000 X | 100 ΜM | 10 nM |
| Y-27632 | PBS | 1000 X | 10 mM | 10 ΜM |
| LY2157299 | DMSO | 10 000 X | 5 mM | 0,5 ΜM |
| CHIR99021 | PBS | 1000 X | 2,5 mM | 2,5 ΜM |
| Wnt3a | PBS | 2000 X | 200 µg/ml | 100 ng/ml |
Tabell 1: tillväxtfaktor reagens tabell. Sammanfattning av tillväxtfaktor stamlösningar och fungerande lösningar som används i detta protokoll.
Discussion
Utvecklingen av en svin modell av segmentell intestinal ischemi expanderar vid tidigare murina modeller genom att tillåta för studier av flera tidpunkter av vävnadsskada inom samma djur. I området i närheten finns det flera kritiska diskussionspunkter i detta protokoll inklusive korrekt fartyget ligatur, vävnad reperfusion och framgångsrika crypt cellodling.
Ordentlig fartyget ligatur är avgörande för skapandet av en modell av komplett ischemi. Om suturen är knuten ojämnt eller klämman inte dras åt helt, blod från den tjocka artären kan fortsätta att ange vävnaden och kan inte avsluta på grund av kollapsen av tunnväggiga venen. Detta resulterar i extravasering av blod i lamina propria orsakar ytterligare vävnadsskada. Dock beroende på vilken typ av ischemisk skada som studeras, kan komplett eller hemorragisk ischemi önska. Till exempel håller på tarmtransplantation avskiljs tarmen fullständigt från vaskulära leverans (artär och ven) under fasen resektion av förfarandet, vilket resulterar i fullständig intestinal ischemi. Alternativt, dock när krös är vriden under ett evenemang såsom en intestinal tarmvred, den venöst återflöde ofta blockeras först, leder till ytterligare blod inom vävnaden innan arteriell försörjning hindras, vilket skapar hemorragisk ischemi.
Ischemisk skada leder till vävnadsskada börjar på villus spetsen och sträcker sig ner till basen av crypt3. Under ischemi, energi i form av adenosintrifosfat fortsätter att användas och genererar den metabolit hypoxantin. När vävnaden är reperfused med syre, hypoxantin blir metaboliseras av xantin oxidas och producerar superoxid fria radikaler leder till slemhinnor skada och attraktion av vävnad skada neutrofiler17,18. Arter skillnader i slemhinnor vaskulära arkitektur samt varierande uttryck av xantin oxidas, leda till olika grader av reperfusion skada3. Feline och gnagare modeller av ischemi-reperfusion är mer mottagliga för reperfusionsskada från reaktivt syre metaboliter19,20. Däremot befanns svin har mindre xantin-oxidas och därför mindre reperfusionsskada, vilket gör denna modell mer jämförbar med human intestinal ischemi21. Vid denna tid, har användning av knockout eller transgena svin modeller att studera intestinal skada inte beskrivits, vilket gör detta till en stor begränsning av denna modell. Val av rätt djur modell beror på sjukdomen som är processaa eller grundförutsättningen forskaren vill studera. Exempelvis varit svin modeller av ischemisk skada upp till 6 h beskrivs22, mest ischemisk förfaranden i murina modeller är 45-60 min23.
Framgångsrika isolering av intestinal kryptor från normala och ischemically skadat tarmen möjliggör studiet av epitelial återhämtning i kultur. Detta system tillåter forskare att fokusera unikt på epitelet ensam, eftersom det inte kärlen eller immunceller komponent att överväga. Detta ger möjlighet att studera epitelial cell interaktioner och återhämtning efter skada förutom att bemöta olika tillväxtfaktorer, eller behandling under kirurgi eller följande crypt isolering genom att komplettera kultur media. Detta steg återstår den svåraste, eftersom isolering från allvarligt skadad looparna kräver milda skakningar och snabb borttagning av EDTA-innehållande lösningar om kryptor har blivit förtidigt dissocierade. Om dessa slingor av tarmen inte tvättas grundligt, har kryptor potential att bli smittade på kultur. Som ett resultat, lades antibiotika-antimycotic lösning till både DR lösningar utöver IESC media. En annan diskussionsfråga fokuserar på tarmen samlas in som en normal kontroll. Som djuren genomgå anestesi med möjliga förändringar i systemisk vävnadsperfusion, tillsammans med möjligheten av cirkulerande inflammatoriska mediatorer sekundärt till ischemi, får även ”normala” kontroll vävnad inte representera en sann kontroll. I dessa experiment är det att notera att kontroll vävnaden verkade grovt och histologiskt jämförbar med vävnad från djur som inte genomgick ischemi i andra experiment (Gonzalez, L.M., opublicerade Data, 2017).
Sammanfattningsvis beskriver denna metod en reproducerbar modell av svin intestinal ischemi, som noga modeller vad som sker i människors ischemisk skada. Dessutom beskrivs isolering av intestinal stamceller från ischemisk loopar, som tjänar till att studera epitelial reparation och möjliga svar på behandling av kultur.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Projektet stöddes av NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 och inst. för kliniska vetenskaper spridning medel
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free | Fisher Scientific | BP-399 | Dilute 1:10 |
| Distilled, deionized water (ddH2O) | Used to prepare EDTA and PBS | ||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Scientific | 20688 | |
| Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED45 | Make fresh before each experiment; pH 7.4 |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Gibco | 15240-096 | Anti-Anti solution |
| Recombinant human Wnt-3a | R & D Systems | 5036 WN/CF | |
| Recombinant human Rspondin1 | R & D Systems | 4645- RS | |
| Recombinant human Noggin | R & D Systems | 6057-NG | |
| Recombinant human EGF | R & D Systems | 236-EG | |
| LY2157299 | SelleckChem | 52230 | |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
| Human [leu]15-Gastrin 1 | Sigma Aldrich | G9145 | |
| SB202190 | Sigma Aldrich | 57067 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Water, WFI Quality | Corning, Inc. | 25-055-CM | Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Matrigel Matrix, GFR | Corning, Inc. | 356231 | Phenol red free |
| 24 Well Culture Dish | Corning, Inc. | 3524 | |
| Conical Tube, 50 ml | Corning, Inc. | 430828 | |
| Scalpel Handle | World Precision Instruments | 500236 | |
| Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 | World Precision Instruments | 504169 | |
| Tissue Forceps | World Precision Instruments | 15918 | |
| Debakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501239 | |
| Mayo Scissors | World Precision Instruments | 501752 | Curved or straight |
| Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments | 501739 | |
| Mosquito Forceps, Curved | World Precision Instruments | 503724-12 | Curved or straight (503728-12) |
| Hopkins Bulldog Clamp | Stoelting Co. | 52120-40P | Straight |
| Silk, 2-0 | Henry Schein | 685S-BUT | Any similar brand is acceptable |
| Towel Clamps | World Precision Instruments | 501700 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | V503382 | |
| Wire suture, 20 gauge | Henry Schein | 19075 | Cut and straighten before use. |
| Surgical Towels | Henry Schein | ST1833 | Any similar product is acceptable. |
| Lactated Ringers Solution | Henry Schein | 9851 | |
| Chlorhex antiseptic scrub (4%) | Henry Schein | VINV-CHMX-SCRB | Any similar brand is acceptable |
| Isopropyl Alcohol 70% | Henry Schein | MS071HS | Any similar brand is acceptable |
| IV catheter, 22 gauge | Henry Schein | 2225PUR | May need 20g or 24 g depending on size of the vein |
| Xylazine (100 mg/ml) | Henry Schein | 33198 | |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 11695-6835-1 | Controlled medication |
| Isoflurane solution | Henry Schein | 10015516 | |
| Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) | Vortech Pharm. | Multiple brands of Pentobarbital Sodium available. | |
| Heating pad | Gaymar | Tpump Core Warming System; others are available. | |
| Mindray Datascope Monitor | Mindray North America | Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable | |
| Vaporizer | Vetland Medical | Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available. | |
| Fluid Pump | Abbott Hospira | Plum A+; Any similar manufacturer is recommended. |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Blikslager, A. T. Treatment of gastrointestinal ischemic injury. Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).
- Podolsky, D. K. Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense. Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
- Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids-Current and future applications. Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. J Vis Exp. (97), (2015).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2015).
- Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. (1995).
- Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).
- Schoenberg, M. H., et al. Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine. Gut. 32 (8), 905-912 (1991).
- Nilsson, U. A., et al. Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine. Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).
- Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event. J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia. Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).
- Shegarfi, H., et al. Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion. Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).
- Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. (111), (2016).
