Summary
Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.
Abstract
Die Reparatur der Doppelstrang-Brüche (DSB) in DNA ist ein hochgradig koordinierten Prozess, erfordern die Bildung und Auflösung der Reparatur Multi-Protein-komplexe. Dieser Prozess wird durch eine Vielzahl von Proteinen, die der Verein zu fördern und Abgrenzung von Proteinen an dieser Läsionen geregelt. Vielen Dank im großen Teil auf die Fähigkeit, funktionale Bildschirme eine riesige Bibliothek von Proteinen führen, gibt es eine größere Wertschätzung der Gene für die Doppel-Strang DNA Bruch Reparatur notwendig. Oft Knockout oder chemischen Inhibitors Bildschirme identifizieren Proteine beteiligt Reparaturprozesse mithilfe erhöhte Toxizität als Marker für ein Protein, das für DSB-Reparatur erforderlich ist. Zwar nützlich für identifizierende neuartige zelluläre Proteine, die bei der Aufrechterhaltung der Genom-Treue, erfordert Funktionsanalyse die Bestimmung der ob das Protein des Interesses Lokalisierung, Bildung oder Auflösung von Reparatur-komplexe fördert.
Die Anhäufung von Reparatur-Proteine kann ohne weiteres als unterschiedliche nuklearen Brennpunkte durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie erkannt werden. So können Assoziation und Dissoziation dieser Proteine an Standorten von DNA-Schäden durch die Beobachtung dieser nuklearen Brennpunkte in repräsentativen Abständen nach der Induktion der Doppel-DNA-Strangbrüche zugegriffen werden. Dieser Ansatz kann auch falsch lokalisierten Reparatur-Faktor-Proteine, identifizieren, wenn Reparatur Mängel nicht gleichzeitig mit unvollständigen Verzögerungen bei der Reparatur auftreten. In diesem Szenario können langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen entwickelt werden zum Ausdruck bringen, eine seltene schneiden Endonuklease (z.B. SceI) in den Zellen wo die Anerkennung-Website für das besagte Enzym in das zelluläre Genom integriert wurde. Die daraus resultierende Läsion ist besonders schwer zu lösen, wie treu Reparatur wird das Enzym Anerkennung Website, woraufhin eine weitere Runde der Spaltung wieder einzuführen. Infolgedessen sind Unterschiede in der Kinetik der Reparatur beseitigt. Wenn Reparatur komplexe nicht gebildet werden, hat Lokalisierung behindert worden. Dieses Protokoll beschreibt die Methodik, die notwendigen Änderungen in Reparatur Kinetik sowie Reparatur Protein Lokalisierung zu identifizieren.
Introduction
Jeden Tag, jede Zelle im menschlichen Körper wird bombardiert mit einer geschätzten 10.000 DNA-Läsionen1. Diese existentielle Bedrohung gefährdet uns für Mutationen, Onkogenese sowie Zelle Tod. Zum Schutz der Genom-Treue haben Säugerzellen entwickelt, um auf DNA-Schäden mit einer komplexen Abfolge von Protein-Verbände und Änderungen reagieren. Diese Antwort gliedert sich in mehrere Wege, zusammen bekannt als DNA-Schaden Antwort (DDR)2,3. Die DDR besteht aus der Ansammlung von DNA-Reparatur-Proteine an DNA-Läsionen, koordiniert sowohl zeitlich als auch räumlich. DDR induziert häufig Zellzyklus Festnahme zur Vermeidung der Ausbreitung oder Verstärkung von Schäden, die während der Replikation von beschädigten DNA2,4,5auftreten können. Im Gegenzug ist es auch notwendig für die zelluläre Lebensfähigkeit ausschalten Zellzyklus Festnahme durch Reparatur komplexe absetze, nachdem die Reparatur abgeschlossen ist.
Unter den verschiedenen Arten von DNA-Schäden sind DSB die meisten schädlichen. DSB reparieren können Chromosomen-Rearrangements oder großflächige Streichungen wie der Verlust des gesamten Chromosoms Arme Nichtbeachtung. Die Reparatur des DSB gliedert sich in zwei Bahnen6,7,8. Homologe Rekombination (HR) erfordert eine Schwester Chromosom als DNA-Vorlage zu verwenden und somit beschränkt sich auf späte S und G2/M-Phase des Zellzyklus9,10. Nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) verfügt nicht über diese Einschränkungen aber kann verursachen kleine Deletionen bei der DSB11,12Reparatur.
DSB reparieren speziell und die DDR im Allgemeinen sind aktive Bereiche der Untersuchung. Trotz in bequem getrennten Bahnen organisiert wird, gibt es viel Redundanz. In der Tat sind viele Proteine (BRCA1, BRCA2 und komplexe z. B. RPA) in mehreren Bahnen13,14,15,16beteiligt. Die Reparatur einer Läsion durch einen Weg, kann zu einen Schaden Mittelstufe, die durch einen anderen Weg14repariert werden muss. Die Verflechtung dieser Wege, kombiniert mit ihrer komplexen Aufgabe recruiting die richtigen Proteine an die richtige Stelle für die genaue Zeitspanne notwendig, erfordert einen mehrstufigen Regulierungsprozess.
Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigt die Feinheiten der DDR durch den Nachweis, dass Reparatur Komplexbildung, Auflösung und Lokalisierung jeweils separat beeinträchtigt17sein können. Das übergeordnete Ziel der das folgende Protokoll soll endgültig sezieren die Fähigkeit der Zellen, DSB zu reparieren. Mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie, kann Ansammlung von Reparatur-Proteine an den Standorten des Schadens zu den repräsentativen Zeitpunkten nach der Induktion der DSB visualisiert werden.
Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile für häufig verwendete Ansätze. Häufig ist die Reparatur zu einzelnen Zeitpunkten untersucht und nicht in der Lage, den dynamischen Prozess der Versammlung und Dissoziation der Reparatur komplexe vertreten. Beobachten das gesamte Spektrum der Reparatur von der erstmaligen Aktivierung der vollen Auflösung sorgt dafür, dass eine Verzögerung bei der Reparatur ist nicht als vollständige Hemmung misidentified. Umgekehrt, es versichert, dass die Induktion einer Reparatur-Antwort, die nicht in der Lage, diese Antwort zu inaktivieren ist nicht als die normale oder die übermäßige Aktivierung identifiziert ist.
Verzögerten Eiweiß Komplexbildung und die MIS Lokalisierung von Reparatur-Proteine können jedoch nicht eindeutig mit diesem Ansatz unterschieden werden. Um festzustellen, ob Reparatur-Proteine falsch lokalisierten versus in ihrer Lokalisation verzögert sind, kann eine "Long-Lasting" DSB durch enzymatische Spaltung der zellulären DNA eingeführt werden. Die daraus resultierende Läsion ist jedes Mal nachschneiden, die es repariert wird, wodurch sich unterschiedliche großen nuklearen Reparatur und Aufhebung der zeitlichen Beschränkung von der Einstellung. Dies kann erreicht werden, indem Sie ändern das bestehende Konzept mit dem Einsatz von einer seltenen schneiden Endonuklease (z.B. SceI) induzieren eine lang anhaltende DSB. Die Langlebigkeit der DSB ermöglicht die Visualisierung der schwer fassbaren Reparatur-Proteine durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Die verbesserte Fülle könnte auch die Visualisierung verbessern, bei der Erkennung durch Einschränkung der Antikörper-Qualität, ein Feature behindert wird, die nützlich sein könnten, wenn weniger untersuchten Proteine identifiziert werden, als mit Auswirkungen auf die DNA-Reparatur.
Insbesondere bieten wir explizite Anweisungen für ein Kostenloses Bild Verarbeitung und Analyse-Software (z. B.ImageJ). Dies entfernt eine große finanzielle Hürde in Bildanalyse, die Vernehmung von DNA-Reparatur von einem breiteren Publikum zu öffnen.
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Protocol
Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll für U2OS Zellen, in denen ein-SceI Anerkennung Seite18geschrieben wird. Die Zellen müssen nicht U2OS sein aber müssen-SceI-Website enthalten. Das Protokoll muss möglicherweise angepasst (z.B.Anzahl der Zellen ausgesät und Inkubationszeiten) werden je nach Art der verwendeten Zellen.
1. definieren die Kinetik der Komplexbildung der DSB-Reparatur
- Wachsen Sie U20S-DRGFP Zellen auf einem 10 cm Gewebekultur Teller bis zu 85 – 90 % konfluierende.
- Entfernen Sie das Medium und bei Raumtemperatur (RT) in 3 mL EDTA für 2 min inkubieren.
- Mit 1 mL Trypsin EDTA zu ersetzen und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Stellen Sie sicher, dass die Zellen von der Oberfläche der Platte durch Betrachtung unter dem Mikroskop getrennt sind. Neutralisieren Sie Trypsin mit 5 mL der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
- Bestimmen Sie die Konzentration der Zellen in dieser Suspension mit einer Hemocytometer und die Trypan blau Ausschluss-Methode.
- Samen 6 x 103 Zellen/Brunnen in 200 µL ein Glasboden 96-Well-Platte. 4 x 106 Samenzellen in 8 mL auf 12 mm Deckgläsern alternativ in einen 10 cm Teller gelegt.
Hinweis: Jede gut oder Deckglas stellt einen einzigen Zeitpunkt, einschließlich der Kontrolle. - Wachsen Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Induktion DSB
- Ersetzen Sie die Medien aus der 96-Well-Platte/10 cm Schale mit H2O2 verdünnt, um eine Konzentration von 25 µM mit DMEM + 10 % FBS und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
- Waschen Sie die Zellen, die 3 X mit 1 x PBS und ersetzen mit frischen DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt. Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 0, 1, 4, 8, 24 und 48 h. Stellen Sie sicher, dass frische Verdünnungen von H2O2 für jedes Experiment verwendet werden.
Hinweis: Um zu vermeiden, töten Zellen bei der hier verwendeten H2O2 Konzentration, sicherstellen Sie, dass die Dosis der Schaden gering ist, genug, so dass der Großteil der Zellen Apoptose und Seneszenz vermieden wird. Es ist wichtig, den Recovery-Prozess zu beobachten. Dies geschieht am besten durch Messung der Empfindlichkeit zu einer Reihe von Dosen. Führen Sie ein MTT-Assay oder andere Zelle Lebensfähigkeit Assay für die minimale Konzentration von Wasserstoffperoxid zu bestimmen, die verwendet werden können.
- Befestigung und permeabilizing Zellen
- Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 1 X PBS. Entfernen Sie ein Deckglas aus 10 cm Teller für jeden Zeitpunkt und legen Sie sie in einem einzigen Brunnen von einer 24-Well-Platte zur Befestigung. Verwenden Sie die Nadel und Pinzette zu entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und Zellen von der Oberfläche des Deckglases kratzen zu vermeiden.
- Update der Zellen durch Inkubation für 15 min bei 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei Zeiten nach 1 h H2O2 Exposition und frische DMEM-Ersatz (0, 1, 4, 8, 24 und 48 h) bezeichnet.
- Waschen Sie die festen Deckgläsern 3 Mal mit PBS. Permeabilize Sie die Zellen mit 0,5 % nicht-ionische Reinigungsmittel in 1 X PBS verdünnt. 15 min bei RT, vor dem Waschen mit PBS 3 X inkubieren.
Hinweis: Nach Permeabilisierung kann Lagerung von Deckgläsern mit PBS-Puffer bei 4 ° C für mindestens eine Woche.
- Reparieren von komplexen Visualisierungen
- Blockieren der 96-Well-Platte/Deckgläsern in einer Lösung von 3 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel in 1 X PBS verdünnt (3 % BSA Lösung) für 1 h bei RT
- Brüten Sie mit Primärantikörpern, die auf die Reparatur-Protein des Interesses, entsprechend den Vorgaben des Herstellers in 3 % BSA Lösung für 1 h bei RT, vor dem Waschen 3 Mal mit 1 X PBS verdünnt.
- Inkubieren Sie die 96-Well-Platte/Deckgläsern, mit Sekundärantikörper laut Protokoll des Herstellers in 3 % BSA Lösung verdünnt. Bestätigen Sie, dass die sekundäre Fluorophore nicht überlappende Erregung oder Emissionsspektren verfügen.
- Fügen Sie nach dem Waschen der Zellen mit PBS 3 Mal DAPI, entsprechend den Vorgaben des Herstellers in 1 X PBS verdünnt und 5 min bei RT inkubieren.
- Montieren Sie die Deckgläsern auf Objektträger mit einem Tropfen des Montage-Agents, sicherstellen, dass die Seitenflächen der Zelle nach unten. Drücken Sie vorsichtig die Deckgläsern und überschüssigen Montage-Agent mit einem Tuch aufsaugen.
- Versiegeln der Deckgläsern mit transparenten Nagellack trocknet schnell und sorgen für eine vollständige Abdichtung des Deckglases mit der Folie.
- Nehmen Sie die confocal Mikroskopbilder durch die Konzentration auf das DAPI-Kanal, vor anderen Kanälen (mit Signalen von DNA-Reparatur-gen von Interesse) um zu vermeiden, Einführung von Voreingenommenheit in das Experiment.
- Alternativ können Bilder erworben werden, indem man Z-Profile aus der gewünschten Region und kondensiert das Bild in einer Ebene alle nachweisbaren Herde zu visualisieren.
Hinweis: Wenn DSB Auflösung oder Protein des Interesses zu gewählten Zeitpunkten nicht beachtet wird, bestimmen wann DSB beheben, indem Sie zunächst den unterschiedlichsten Zeitpunkten auswählen (0-48 h post DSB Induktion). Die Zeitpunkte des Interesses variieren je nach der Methode der DSB-Induktion und Reparatur Proteins des Interesses.
- Verwenden Sie kostenlose ImageJ-Software, um die Kerne in der Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Bildern zu definieren.
Hinweis: Um Mikroskopaufnahmen zu öffnen, muss der Bio-Formate-Plugin in ImageJ installiert werden.- Öffnen Sie die konfokale Bilder (.czi oder .tif) indem Sie die Image-Datei in das ImageJ-Fenster ziehen oder durch Auswahl von "Bio-Formate Importeur" aus der Symbolleiste "Plugin" von ImageJ.
Hinweis: Die "Option Bio-Formate" Importieren "" Fenster wird angezeigt. - Wählen Sie "Split Kanäle" konstitutiven DAPI und fluoreszierende Bilder im Fenster "Bio-Formate-Importoption" das Bild aufgeteilt.
- Wählen Sie "Colorized" in "Farb-Optionen" aus dem Dropdown-Menü. Wählen Sie "OK" zum Öffnen der DAPI und Histon H2AX (H2AX) Bilder als separate Windows und wählen Sie das DAPI-Bild.
- Wählen Sie "Bildsymbolleiste" und "Threshold anpassen" Option zum Kerne auswählen.
Hinweis: Eine "Schwelle" Fenster wird angezeigt. - Passen Sie den Bild-Schwellenwert von der unteren Leiste des Fensters "Schwelle" ganz nach rechts schieben. Einstellen der oberen Leiste, bis die Kerne mit deutlichen Konturen und der Hintergrund schwarz komplett rot angezeigt werden. Wählen Sie nicht gelten. Schließen Sie das Fenster "Anpassen Threshold".
- Wählen Sie die Symbolleiste "Analyze" und "Analysieren Partikel" Option. Sehen Sie eine "Teilchen analysieren" Fenster auf dem Bildschirm erscheinen.
- Geben Sie die minimale Größe eines Kerns.
Hinweis: Partikel unterhalb der Größe eingegeben werden nicht als Kerne gezählt werden. - Wählen Sie aus dem Menü "Zeigen" "Konturen". Wählen Sie die Option "Hinzufügen zum Manager". Klicken Sie auf "OK", um ein "ROI-Manager"-Fenster geöffnet.
Hinweis: Die Umrisse der Kerne werden in einem separaten Fenster angezeigt. - Zuweisen der Kerne, die vom Fenster "ROI-Manager" ausgewählt werden können.
- Öffnen Sie die konfokale Bilder (.czi oder .tif) indem Sie die Image-Datei in das ImageJ-Fenster ziehen oder durch Auswahl von "Bio-Formate Importeur" aus der Symbolleiste "Plugin" von ImageJ.
- Verwenden Sie ImageJ, um H2AX Brennpunkte in Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Bildern zu quantifizieren.
- Wählen Sie das "H2AX" Brennpunkte Fenster (gefärbt mit Gewebekulturen konjugierten Sekundärantikörper). Dann wählen Sie die Symbolleiste "Prozess" und "Maxima finden", die Herde in den Kernen zu finden.
Hinweis: Ein "Maxima finden" Fenster wird geöffnet. - Wählen Sie die Option "Einzelne Punkte" aus dem Dropdown-Menü "Ausgabetyp" und wählen Sie "Vorschau Messfeldwahl" Maxima/Brennpunkte zu visualisieren. Geben Sie einen "Lärm" Toleranzwert abhängig von der Fluoreszenzintensität des Bildes (Abbildung 1). Überprüfen Sie für das Erscheinungsbild der ein weißes Fenster mit kleinen schwarzen Punkten.
Hinweis: Diese Punkte stehen für die H2AX Brennpunkte/Maxima, die entdeckt wurden. Der Toleranzwert Lärm muss für alle Bilder, die analysiert wird konstant gehalten werden. Eine niedrige/hohe Lärm-Toleranz wird zeigen zu viele/wenige Maxima (Herde) im Zellkern und werden keine genaue Darstellung der Schwerpunkte innerhalb des Zellkerns. - Wählen Sie die Kerne für die H2AX Brennpunkte vom Fenster "ROI-Manager" quantifiziert werden müssen. Wählen Sie die Kerne durch Aktivieren der Option "alle anzeigen".
- Wählen Sie "Measure", die Anzahl der Maxima/Schwerpunkte innerhalb der ausgewählten Kernen zu messen.
Hinweis: Die Anzahl der Maxima/Brennpunkte erscheinen als ein Vielfaches von 255, d. h., eine maximale hat eine "RawIntDen" (integrierte Dichte) Lesung von 255. - Kopieren Sie die "RawIntDen" Werte und fügen Sie sie in Software für die Datenanalyse.
- Wählen Sie das "H2AX" Brennpunkte Fenster (gefärbt mit Gewebekulturen konjugierten Sekundärantikörper). Dann wählen Sie die Symbolleiste "Prozess" und "Maxima finden", die Herde in den Kernen zu finden.
2. Analyse der Lokalisierung in eine lang anhaltende Doppel-Strang DNA-Pause
- Samenzellen auf 96-Well-Platten/Deckgläsern wie beschrieben in Abschnitt 1.1 und 1.2.
-
Induktion von Doppel-Strang DNA-Brüchen
- Transfizieren Sie Zellen mit dem-SceI Expressionsvektor mit Lipid-basierte Transfection Reagens gemäß den Spezifikationen des Herstellers. Warten Sie 24-72 h nach Transfektion den Endonuklease Ausdruck zu maximieren. Bestimmen Sie, ob die Transfektion von Zellen mit einem einzigartigen großen nuklearen γ-H2AX Fokus Ortung erfolgreich war.
-
Aufnahme von Bildern
- Fix, permeabilize, blockieren und 96-Well-Platte/Deckgläsern zu waschen, wie in Abschnitt 1.8 beschrieben.
- Co inkubieren Sie Zellen mit einem Antikörper gegen γ-H2AX und Reparatur Proteins des Interesses (hier, ein primärer Antikörper gegen RAD51 eingesetzt wurde) nach den Angaben des Herstellers in 3 % BSA Lösung verdünnt.
- Waschen Sie die 96-Well-Platte/Deckgläsern 3 Mal mit 1 X PBS. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte/Deckgläsern, mit Sekundärantikörper laut Protokoll des Herstellers in 3 % BSA Lösung verdünnt. Bestätigen Sie, dass die sekundäre Fluorophore nicht überlappende Erregung oder Emissionsspektren verfügen.
- Zellen, die einen großen nuklearen γ-H2AX Fokus zu identifizieren. Fotografieren Sie nur diese Zellen, um Verzerrungen zu vermeiden.
-
Analyse der lang andauernde-SceI induzierte Brennpunkte
- Analysieren Sie lang anhaltende Brennpunkte manuell, durch zählen sowohl die Anzahl der Zellen, die die großen γ-H2AX Brennpunkte und Co lokalisierte Herde Reparatur-Proteins des Interesses zu haben.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die Auswahl der richtigen Lärm Diskriminierung für Maxima/Brennpunkte Quantifizierung mit ImageJ. Die zusammengeführten Bilder von DAPI und Reparatur Proteins des Interesses sind auf der linken Seite. Abbildung 1A zeigt eine Lärm Diskriminierung von 90 und markiert die korrekte Anzahl der Herde. Kerne auf der Kante (dargestellt mit einem rosa Pfeil) und Herde außerhalb der Kerne (dargestellt mit einem gelben Pfeil) zählen nicht bei der Quantifizierung. Abbildung 1 b zeigt eine geringe Geräuschentwicklung Toleranz von 50. Zahlreichen Maxima sind außerhalb des Zellkerns und innerhalb des Zellkerns identifiziert. Abbildung 1 zeigt eine hohe Toleranz von 220. Nur ein einzigen Fokus (weißer Pfeil) wurde erkannt. Um dem Leser ein Gefühl von "positiv" und "negativen" Ergebnisse bieten, haben wir auch repräsentative Ergebnisse in Abbildung 2zusammengestellt. Insbesondere zeigt Abbildung 2A Co Lokalisierung zwischen einem γ-H2AX Fokus (grün) und ein Reparatur-Protein des Interesses (rot). Ebenso eine untransfected Zelle wird im linken oberen Bereich dieses Fensters angezeigt und eine Zelle mit einem nicht-nuklearen (falsche) γ-H2AX Fokus ist in der oberen rechten gezeigt. Bitte beachten Sie assoziieren die Mikrokernen mit DNA-Schäden-Maschinen sind eine wahrscheinliche Quelle von diesen nicht-nuklearen Brennpunkte19. Abbildung 2 b bietet eine höhere Vergrößerung der beiden am weitesten rechts befindlichen Zellen aus Abbildung 2A zu schaffen Klarheit in wie sie ermittelt wurden, innen und außen in den Zellkern, bzw. sein. Abbildung 2zeigt ein Beispiel für eine nukleare γ-H2AX Fokus ohne Co Lokalisierung eines Reparatur-Proteins. Eine schematische Darstellung des Protokolls finden Sie in Abbildung 3 die Zusammenfassung dieser Ansatz zur Charakterisierung von DNA zu reparieren.
Abbildung 1 : Repräsentative Analyse der Doppel-Strang DNA Bruch Reparatur Kinetik. Repräsentative Bilder von γ-H2AX Brennpunkte Quantifizierung mit ImageJ (mit Bio-Formate Plugin) Software. Die linken Panels sind zusammengesetzte Bilder der Kerne (40 X Vergrößerung), für DAPI und grün für γ-H2AX blau gefärbt. Zentrum-Tafeln zeigen Referenz UN analysierten Kerne mit γ-H2AX Brennpunkte/Maxima. (A) im Rechte Bereich zeigt Maxima/Brennpunkte Erkennung mit einer Toleranz von Lärm von 90 und ist repräsentativ für die tatsächliche Schätzung der Anzahl der Herde innerhalb des Zellkerns. (B) das Recht Panel zeigt Maxima Quantifizierung mit einer geräuscharmen Toleranz (50). Maxima/Herde erkannt werden, außerhalb des Zellkerns (gelber Pfeil), während Mehrheit der Maxima befindet sich innerhalb des Kerns unspezifischen Hintergrund Signale. (C) das Recht Panel zeigt Maxima Quantifizierung mit hohen Geräuschpegel Toleranz (220). Nur ein einziges Maximum/Schwerpunkt (weißer Pfeil) ist innerhalb des Zellkerns erkannt und ist nicht repräsentativ für die Schwerpunkte innerhalb des Zellkerns. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative I-SceI induzierten Doppel-DNA-Strangbrüche. Repräsentative Bilder von Kernen von Zellen auf Deckgläsern (40 X Vergrößerung) angebaut. Kerne sind blau gefärbt. Ein Reparatur-Protein (RAD51) ist rot gefärbt und γ-H2AX ist grün gefärbt. (A) die drei Tafeln zeigen die gleichen drei Zellen. In der linken Seite sind die meisten Panel Kerne sichtbar. In der mittleren Spalte wird die Färbung für RAD51 angezeigt. Auf der rechten Seite wird γ-H2AX Färbung angezeigt. Der Kern in der rechten oberen Ecke zeigt nicht, jedes mögliches Zeichen des SceI DSB induziert. Der Kern in der Mitte (Rosa Pfeil) stellt ein wahres positives Ereignis, da es sowohl eine große γ-H2AX nuklearen und eine Co lokalisierte RAD51 nuklearen Fokus hat. Der Kern auf der rechten Seite hat einen falschen großen γ-H2AX Fokus wie es extranuclear ist. Brennpunkte außerhalb der Kern sollte nicht für Co Lokalisierung Analyse verwendet werden. (B) Dies ist eine höhere Vergrößerung des fusionierten Bildes in Teil A (Mitte und rechts die meisten Zellen). Die große nuklearen gelbe Fokus Überschneidungen von RAD51 und H2AX Signal anzeigt wird durch die rosa Pfeil gekennzeichnet. (C) eine repräsentative Bild eines nuklearen γ-H2AX Fokus ohne Co Färbung der DNA-Reparatur-Proteins des Interesses. Im Gegensatz zu den Fokus mit einem weißen Pfeil in (A) und (B) bezeichnet zeigt der gelbe Pfeil typische Ergebnisse Reparatur-Proteine von der Lokalisierung zu Stätten der Schaden abgehalten. Maßstabsleiste = 15 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Grafische Darstellung des Protokolls für die Analyse von Doppel-Strang DNA Bruch Reparatur. (1) Darstellung des Protokolls Schritte 1.1 für die Aussaat Zellen auf Deckgläsern/Glas unten Platten. (2) Abbildung der Induktion Doppel-Litze Pausen durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid (rechts) oder langlebige Doppel-Strangbrüche durch transfecting 3 µg von SceI induzieren. (3) Darstellung der Protokoll Schritte 1.4 zu 1.5.3 zur Visualisierung der Doppel-strangbrüchen. (4a) gebeizt mit DAPI (blau) und γ-H2AX Herde (grün) Bild, konfokale Mikroskopie der Zelle darstellt. (4 b) Bild der einzigartigen großen γ-H2AX Brennpunkte (grün) wieder Kerne färben DAPI (blau). (5a) Darstellung der Analyse der γ-H2AX Brennpunkte mit ImageJ (Protokoll Schritte 1.10.1–1.11.5). (5 b) Darstellung der manuellen Zählung der große langlebige γ-H2AX Brennpunkte (Protokoll Schritt 2.4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Analyse von DNA-Schäden reparieren im allgemeinen und die Reparatur von doppelsträngigen DNA-Brüchen ist speziell ein aktives Gebiet der Forschung, da deren Folgen Tumorgenese Grundlagenbiologie6,20 umfassen. Dieses Manuskript-Details, die ein Konzept, das genau den Beitrag von RAD51 und γ-H2AX Proteinen an die Auflösung des DSB durch HR. Ich freue mich, diese Methode seziert verwendet werden, um zusätzliche Funktionen des Reparatur-Proteine bei DSB14aufzuklären. Der Vergleich der Reparatur Kinetik und die Rekrutierung von Reparatur-Mechanismus zu I-SceI induzierte DSB zwischen Kontrolle und Zellen mit dem Protein des Interesses ausgeschlagen, würde den Beitrag der dieses Protein für die Rekrutierung, Lokalisierung, definieren und Auflösung von Reparatur Faktoren, DSB.
Reparatur-Kinetik zu visualisieren, hat mehrere Vorteile gegenüber gängigen Ansätze. Häufig, ist Reparatur zu einzelnen Zeitpunkten untersucht die ist nicht in der Lage, den dynamischen Prozess der Versammlung und Dissoziation der Reparatur komplexe vertreten. Beobachten das gesamte Spektrum der Reparatur von Erstaktivierung in voller Auflösung sorgt dafür, dass eine Verzögerung bei der Reparatur ist nicht als vollständige Hemmung misidentified. Umgekehrt, sichert es die Induktion einer Reparatur Antwort ohne die Fähigkeit, zu inaktivieren, dass die Antwort nicht als normal oder übermäßige Aktivierung identifiziert ist. Dies sind vor allem Änderungen in der Anwendung eines etablierten Ansatz, aber die Verwendung von einer seltenen schneiden Endonuklease induzieren eine lang anhaltende DSB ist ein neuartiges Werkzeug. Es ermöglicht die Ermittler um eindeutig festzustellen, ob die Lokalisierung eines Reparatur-Proteins statt seiner Rekrutierung verzögert eine kurze Frist über den Abschluss des Experiments gehemmt wird. SceI induzierte DSB kann Tage und theoretisch so lange, wie das Enzym zum Ausdruck kommt (sollte die Zelle lebensfähig bleiben). Die Kinetik der DSB-Reparatur kann auch mittels live Cell Imaging beobachtet werden. Jedoch obwohl live Cell Imaging ermöglicht die Erkennung von Reparatur Ereignisse in Echtzeit, seine Anwendung wird durch die Anforderung, dass Proteine mit einem Fluorophore wie GFP markiert werden behindert. Derartige genetische Manipulation hat das Potenzial, Proteinfunktion zu ändern und stellt eine zusätzliche technische Barriere.
Bildanalyse über ImageJ-Software kann umständlich zu meistern sein. Die Schritt für Schritt Anleitung für Reparatur Fokus Erkennung und Quantifizierung mit dieser Software steht zur Verfügung in der Hoffnung, dieses Hindernis für andere Gruppen zu entfernen. Dies könnte führen zu einer erhöhten Auslastung der leistungsfähigen Software und beseitigen die Kosten der teureren Programmen gleichzeitig schrumpfenden Pools von Bundes-Zuschuss unterstützt.
Im Prinzip sollte die Dauer der diese DSB die Visualisierung der schwer fassbaren Reparatur-Proteine durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ermöglichen. Dies wäre der Fall für Proteine, die sind schwer zu sehen, da sie nicht in einem hohen sammeln, genug Konzentration erkannt werden, z. B., das Fortbestehen der I-SceI induzierte DSB Ergebnisse in einer größeren als typische Anhäufung von Reparatur-Proteine an die Läsion. Die verbesserte Fülle könnte auch die Visualisierung verbessern, bei der Erkennung durch eine Einschränkung in Antikörper-Qualität behindert wird; ein Feature, das besonders nützlich sein könnte, wenn wenig untersuchten Proteine identifiziert werden, als mit Auswirkungen auf die DNA zu reparieren. Bis heute, dieser Ansatz überprüft wurde für 4 DNA-Reparatur Proteine, RAD51, RPA70, BRCA1 und BRCA2 (Daten nicht gezeigt, Abbildung 2und Referenz-17)
Schließlich gibt es Änderungen, die dieses Protokoll vorgenommen werden könnte, um die Arten von DNA-Schäden zu erweitern, die als auch die zelluläre Umgebung abgefragt werden können. Die offensichtlichste Änderung würde die Quelle oder die Art der induzierten DNA-Schäden verändern. Der Nachweis der Grundsatz für die Verwendung von UVB, ionisierende Strahlung oder Radiomimetics (Phleomycin, Bleomycin und Etoposid) die Kinetik der DNA-Reparatur zu studieren wurde bereits veröffentlichten18,19,23,24 , 25. mit leichten Modifikation dieser Ansatz kann auch aufzuklären Reparatur Protein Reaktion NHEJ auf DSB. Alternativ Britton Et Al. beschreiben Sie eine Pre-Extraktion-Technik, die verwendeten26sein könnte. Darüber hinaus gibt es homing nicking Endonucleases (-HmuI oder BasI), die umfassende Anerkennung Sites, ähnlich wie-SceI27haben. Von SceI unterscheiden, dazu führen, dass diese Enzyme Single-DNA-Strangbrüche (SSBs). Einführung der Website Anerkennung für diese Enzyme in einer Zelllinie die Analyse der SSB Reparatur, die das Protokoll in diesem Manuskript erlauben würde für Verhören langlebige DSB. insbesondere, beschrieben von parallels den Prozess der Integration-SceI-Anerkennung Website und die Einführung der Website überprüfen können mühsam sein. Glücklicherweise haben die Fortschritte im Genom Bearbeitung Technologie (z. B. GEMÜSEFACH/Cas9-Systeme) dieser Belastung28abgenommen. Es gibt auch aktives Forschungsgebiet, das engineering homing Endonucleases Schneiden an einem gewünschten genomische Standort, das das in Zukunft vorschlägt, diese technischen Fortschritte gelungen ist und die Verwendung von CRISPR/Cas9 führen diesen Klonen Schritt für entbehrlich28,29.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Joel Sanneman und Dr. Philine Wangemann der konfokalen Mikroskopie Kern, finanziert von der Kansas State University College of Veterinary Medicine, für ihre Unterstützung der Bemühungen, diese Technik zu entwickeln. pCBASceI war ein Geschenk von Maria Jasin (Addgene Plasmid # 26477) 30. U2OS DR-GFP Zellen waren eine Art Geschenk von Maria Jasin18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
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- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
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