Summary
Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.
Abstract
Çift iplikçikli tatili (DSBs) DNA tamiri oluşumu ve kararlılık-in çok protein onarım kompleksleri gerektiren son derece koordineli bir süreçtir. Bu işlem sayısız Dernek teşvik protein ve protein bu lezyonlar için ayırma tarafından düzenlenmiştir. Büyük ölçüde geniş bir kütüphane proteinlerin fonksiyonel ekranları gerçekleştirme olanağı sayesinde, iki iplikçikli DNA sonu tamiri için gerekli genler daha büyük bir takdir. İnhibitörü kez nakavt veya kimyasal ekranlarında proteinlerin tamir süreçlerinde yer alan kalem DSB onarım için gerekli olan bir protein için artan toksisite kullanarak tanımlayın. Tanımlayıcı roman hücresel proteinler genom sadakat korunmasında yer için yararlı olmasına rağmen fonksiyonel analiz olup faiz protein yerelleştirme, oluşumu veya onarım kompleksleri çözünürlüğü teşvik belirlenmesi gerekir.
Onarım proteinleri birikimi kolayca farklı nükleer foci ayirt mikroskobu tarafından tespit edilebilir. Böylece, dernek ve bu proteinler DNA hasarı sitelerdeki ayırma bu nükleer foci temsilcisi aralıklarla çift iplikli kırılmalara DNA indüksiyon sonra gözlemci tarafından erişilebilir. Onarım hataları tamir eksik gecikmeler ile aynı anda gerçekleşmez ise bu yaklaşım de yanlış yerelleştirilmiş onarım faktör proteinler, tanımlayabilir. Bu senaryoda, uzun süreli iki iplikçikli DNA kırılmalar nadir kesme endonükleaz (Örneğin, SCEI) ifade ederek nerede tanıma site dedi enzim için hücresel genom entegre edilmiştir hücrelerdeki mühendislik. Elde edilen bu lezyon özellikle sadık onarım enzim tanıma sitesi, dekolte bir tur isteyen reintroduce çözmek zordur. Sonuç olarak, onarım kinetik farklılıkları ortadan kalkar. Onarım kompleksleri oluşur değil ise, yerelleştirme engelledi. Bu iletişim kuralı onarım kinetik hem de onarım protein yerelleştirme değişiklikleri tanımlamak gerekli yöntemleri açıklar.
Introduction
Her gün, insan vücudundaki her hücre bir tahmini 10.000 ile alı DNA lezyonlar1. Bu tehdit bize mutasyonlar, oncogenesis gibi hücre riski koyar ölüm. Genom sadakat korumak için memeli hücreleri DNA hasarı protein dernekler ve değişiklikler karmaşık bir dizi ile yanıtlamak için evrim geçirmiş. Bu yanıtı birden çok yolları, topluca bilinen DNA hasarı yanıt (DDR)2,3düzenlenmiştir. DDR DNA onarım proteinler, DNA lezyonlar, geçici ve dağınık şekilde koordine birikimi oluşur. DDR sık yayma veya hasarlı DNA2,4,5çoğaltma işlemi sırasında oluşabilecek hasar yoğunlaştırılması önlemek için hücre döngüsü tutuklama neden olmaktadır. Buna karşılık, aynı zamanda hücre döngüsü tutuklama onarım tamamlandıktan sonra onarım kompleksleri kesilmesi açmak hücresel canlılık için gereklidir.
Çeşitli DNA hasarı arasında DSBs en zararlı türleridir. DSBs onarmak için hata kromozom düzenlemeler veya kaybı gibi büyük ölçekli silme tüm kromozom silah neden olabilir. DSBs tamiri iki yolları6,7,8ayrılmıştır. Homolog rekombinasyon (HR) gerektirir bir kardeş kromozom DNA şablon olarak kullanmak ve böylece geç S ve G2/M hücre döngüsü9,10için aşama sınırlıdır. Sigara homolog sonunda (NHEJ) katılmadan bu kısıtlamalar yoktur ancak küçük silme DSBs11,12tamirinde neden olabilir.
DSB onarım özellikle ve DDR genel olarak soruşturma etkin alanı vardır. Elverişli bir konuma sahip ayrılmış yollar organize rağmen büyük bir fazlalık var. Gerçekten de, birçok protein (BRCA1, BRCA2 ve örneğin karmaşık RPA) birden çok yolları13,14,15,16' söz konusu. Tarafından bir yolu, bir lezyonu tamiri için başka bir yolu14tarafından onarılması bir hasar ara yol açabilir. Zaman gerekli, kesin miktar için doğru yere doğru protein alımı onların karmaşık bir görev ile birlikte bu yollar intertwining çok katmanlı bir yasal işlem gerektirir.
Bir rapora DDR inceliklerini onarım karmaşık oluşumu, çözünürlük ve yerelleştirme her ayrı olarak Engelli17olabilir göstererek vurgulamaktadır. Aşağıdaki protokol genel yetenek hücre DSB onarmak için kesin olarak incelemek için hedeftir. Ayirt mikroskobu kullanılarak, sitelerde hasar onarım proteinlerin birikimi DSBs indüksiyon takip temsilcisi zaman noktalarda görüntülenmeyecektir.
Bu teknik yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar için birçok avantajı vardır. Sık sık, onarım incelenen tek zaman noktalarda ve derleme dinamik bir süreç ve onarım kompleksleri ayrışma temsil eden aciz. İlk harekete geçirmek gelen onarım dolu kararlılık için tam kapsamlı gözlem onarım gecikmeden tam inhibisyon tanımlanmış değil sağlar. Diğer taraftan, dedi yanıt devre dışı bırakma için bir onarım yanıt indüksiyon normal ya da aşırı harekete geçirmek tanımlanmış değil garanti eder.
Gecikmeli protein kompleksi oluşumu ve onarım proteinlerin mis yerelleştirme ancak, belirsizliğe yer bırakmadan bu yaklaşım ile ayırt edilebilir değil. Onların yerelleştirme gecikmeli onarım proteinler karşı yanlış lokalize olup olmadığını belirlemek için hücresel DNA enzimatik bölünme bir "uzun ömürlü" DSB tanıttı olabilir. Elde edilen bu lezyon, farklı büyük nükleer onarım odakta kaynaklanan ve zamansal kısıtlama işe kaldırma onarılana her zaman yüreği. Bu uzun ömürlü DSB ikna etmek için bir nadir kesme endonükleaz (Örneğin, SCEI) kullanımı ile mevcut yaklaşım değiştirerek elde edilebilir. DSBs uzun ömürlü ayirt mikroskobu tarafından zor tamir proteinlerin görselleştirme sağlar. Gelişmiş bereket da algılama sınırlama antikor kalitesinde az çalışılmış proteinler DNA tamiri üzerinde bir etkiye sahip olarak tanımlanan zaman yararlı olabilir bir özelliği tarafından engel görselleştirme artırmak.
Özellikle, bir ücretsiz görüntü işleme ve analiz yazılımı (Örneğin, ImageJ) için açık yönergeler sağlar. Bu DNA hasar tamiri daha geniş bir kitleye sorgulama açılış görüntü analizinde büyük bir finansal engelini ortadan kaldırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lütfen dikkat, bu iletişim kuralı bir ben-SCEI tanıma sitesi18içeren U2OS hücreler için bulunmakta. Hücreleri U2OS olması gerekmez ama ben-SCEI sitenin içermesi gerekir. Protokol ayarlanmış (Örneğin, numaralı seribaşı hücreleri ve kuluçka süreleri sayısı) olması gerekebilir kullanılan hücre türüne bağlı olarak.
1. kinetik DSB onarım karmaşık oluşumu tanımlama
- U20-DRGFP hücreleri 10 cm doku kültürü tabakta 85-%90 kadar konfluent büyümek.
- Medyayı çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) EDTA 3 ml 2 min için kuluçkaya.
- Tripsin ile 1 mL EDTA değiştirin ve 5 dk. hücreleri mikroskop altında görüntüleyerek plaka yüzeyinden ayrılır sağlamak için 37 ° C'de kuluçkaya. Tripsin 5 mL, Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM) ile nötralize.
- Bir hemasitometre ve trypan mavi dışlama yöntemi kullanarak bu süspansiyon hücre konsantrasyonu belirlemek.
- 6 x 103 hücreleri/iyi bir cam alt 96-şey plaka 200 µL'tohum. Alternatif olarak, tohum 4 x 10 8 mL 12 mm coverslips üzerinde6 hücrelerde bir 10 cm tabak içinde yerleştirilir.
Not: Her şey veya coverslip denetimi de dahil olmak üzere bir seferinde noktasını temsil eder. - Gece saat 37 ° C ve % 5 CO2hücrelerin büyümesine.
- DSBs inducing
- H2O2 DMEM + % 10 ile 25 µM bir konsantrasyon için seyreltilmiş 96-şey plaka/10 cm çanak medyadan yerine FBS ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
- 3 x 1 x PBS ile ve eski yerine koymak ile taze DMEM % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş hücreleri yıkayın. Kuluçkaya hücreleri 37 ° C için 0, 1, 4, 8, 24 ve 48 h. H2O2 taze dilutions her deneme için kullanılan emin olun.
Not: burada kullanılan H2O2 konsantrasyon hücreleri öldürmek önlemek için öyle ki yeterince hücreleri toplu apoptozis ve yaşlanma önlemek olacaktır hasar doz düşük olduğundan emin olun. Kurtarma işleminin gözlemlemek için önemlidir. Bu en iyi duyarlılık doz aralığına ölçerek elde edilir. Bir ÇMT tahlil veya diğer hücre canlılığı tahlil kullanılabilir hidrojen peroksit en az konsantrasyonu belirlemek için gerçekleştirin.
- Sabitleme ve hücre permeabilizing
- Hücreleri 3 kez 1 x PBS ile yıkayın. 10 cm plaka her zaman için bir coverslip kaldırmak ve tamir için bir 24-şey plaka tek bir kuyu yerleştirebilirsiniz. İğne ve forseps dikkatle coverslip ve hücreleri coverslip yüzey dışına kaşıma kaçınarak kaldırmak için kullanın.
- Düzeltme kere 1 h H2O2 pozlama ve taze DMEM yerine (0, 1, 4, 8, 24 ve 48 s) sonra hücrelerin % 4 paraformaldehyde (PFA) ile 15 dakika, kuluçka tarafından belirlenmiş.
- Sabit coverslips 3 kez PBS ile yıkayın. 1 x PBS içinde seyreltilmiş %0,5 non-iyonik deterjan ile hücreleri permeabilize. 15 dakika, RT, 3 x PBS ile yıkama önce kuluçkaya.
Not: permeabilization sonra coverslips en az bir hafta için 4 ° C'de PBS içinde olası saklanmasıdır.
- Karmaşık görsel öğeyi onar
- 96-şey plaka/coverslips %3 Sığır serum albumin (BSA) ve %0,1 non-iyonik deterjan 1 x PBS içinde seyreltilmiş bir çözümde engellemek (% 3 BSA çözüm) RT. 1 h için
- Onarım protein % 3 BSA çözüm RT, 1 h için üreticinin belirtimlerine göre daha önce 3 kez 1 x PBS ile yıkama seyreltilmiş ilgi hedef birincil antikorlar ile kuluçkaya.
- 96-şey plaka/coverslips %3 BSA çözüm üreticinin protokolüne göre seyreltilmiş ikincil antikor ile kuluçkaya. İkincil fluorophores örtüşen uyarma veya emisyon spectra var mı onaylayın.
- PBS 3 kez hücrelerle yıkadıktan sonra DAPI, 1 x PBS üreticinin belirtimlerine göre seyreltilmiş ekleyin ve 5 min için RT kuluçkaya.
- Coverslips montaj Ajan, hücre-yan yüzleri aşağı emin bir damla ile slaytlar üzerine monte. Coverslips dikkatle basın ve herhangi bir aşırı montaj Ajan bir bezle ıslatın.
- Hızlı kuruyan şeffaf oje ile coverslips mühür ve coverslip slayt ile tam bir mühür emin olun.
- Confocal mikroskop görüntüler önyargı deney tanıtımı önlemek için diğer kanallar (ile DNA onarım gen ilgi sinyalleri) önce DAPI kanal üzerinde odaklanarak tutar.
- Alternatif olarak, görüntüleri Z-istenen bölge bölümlerini alarak ve tüm tespit foci görselleştirmek için tek bir uçağı görüntü yoğuşmalı elde edilebilir.
Not: DSB çözünürlük veya protein ilgi seçilen zaman noktalarda görülmektedir değil, ne zaman DSBs zaman puan geniş bir başlangıçta seçerek çözmek belirleyin (0 – 48 h DSB indüksiyon sonrası). Zaman ilgi DSB indüksiyon yöntemi ve onarım protein ilgi tarafından değişir.
- Ücretsiz ImageJ yazılım çekirdeklerin ayirt mikroskobu Albümdeki tanımlamak için kullanın.
Not: mikroskop görüntüleri açmak için Bio-biçimleri eklenti ImageJ içinde yüklü olmalıdır.- Resim dosyasının ImageJ penceresine sürükleyerek veya "Biyo-biçimleri ithalatçı" seçerek ImageJ "Eklenti" araç çubuğundan açmak confocal görüntüleri (.czi veya .tif).
Not: "Biyo-formatları içe aktarma seçeneği" pencere-ecek gözükmek. - "Bölünmüş görüntü bünye DAPI ve floresan görüntüleri"Biyo-formatları içe aktarma seçeneği"penceresi içinde içine bölmek için kanallar" seçin.
- "Colorized" "Renk seçenekleri" açılır menüsünden seçin. Seçin "Tamam" DAPI açıp histon H2AX (H2AX) görüntüler olarak ayrı windows ve DAPI resim seçin.
- Çekirdeklerin seçmek için "Eşik ayarlamak" seçeneği ve "Görüntü" araç çubuğunu seçin.
Not: "Eşik" pencere-ecek gözükmek. - Görüntü eşik "Eşik" penceresinin alt bar tamamen sağa doğru kaydırarak ayarlayın. Çekirdeklerin tamamen farklı özetliyor ve arka plan siyah ile kırmızı görününceye kadar üst çubuğunda ayarlayın. Seçmeyin uygulamak. "Eşik ayarlamak" penceresini kapatın.
- "Analiz" araç çubuğu ve "Parçacıklar analiz" seçeneğini seçin. Ekranda görünen bir "Parçacıklar analiz" penceresini görebilirsiniz.
- Bir çekirdek en küçük boyutunu girin.
Not: Parçacıklar sunucularımıza boyutu aşağıda çekirdek sayılmayacaktır. - "Göster" açılan menüsünden "Ana hatlarıyla" seçin. "Yöneticisi Ekle" seçeneğini seçin. Bir "ROI Yöneticisi" penceresini açmak için "Tamam" düğmesini tıklatın.
Not: Ana hatlarını çekirdekleri ve ayrı bir pencerede görünür. - "ROI Yöneticisi" penceresinden seçilebilir çekirdeklerin numaraları atamak.
- Resim dosyasının ImageJ penceresine sürükleyerek veya "Biyo-biçimleri ithalatçı" seçerek ImageJ "Eklenti" araç çubuğundan açmak confocal görüntüleri (.czi veya .tif).
- ImageJ H2AX foci ayirt mikroskobu görüntülerde ölçmek için kullanın.
- (Fluorescently konjuge ikincil antikor ile lekeli) "H2AX" foci pencereyi seçin. Ardından "Süreci" araç çubuğunu seçin ve "Maxima çekirdeklerin içindeki resimde bulmak için bul" seçin.
Not: "Maxima bulmak" penceresi açılacaktır. - "Çıktı türü" açılan menüsünden "Tek nokta" seçeneğini seçip "Önizleme noktası seçimini" seçin maxima/foci görselleştirmek için. Resim (resim 1) Floresan yoğunluğuna bağlı olarak bir "Gürültü hoşgörü" değeri girin. Küçük siyah noktalar ile beyaz pencerenin görünümünü denetlemek.
Not: Bu noktalar H2AX foci/maxima algılanmış temsil ediyor. Gürültü tolerans değeri analiz ediliyor tüm resimler için sürekli muhafaza edilmelidir. Düşük/yüksek gürültü hoşgörü çok çok/az maxima (resimde) çekirdek içinde tasvir ve çekirdek içinde foci bir doğru bir şekilde temsil olmayacaktır. - Kendisi için H2AX foci için "ROI Yöneticisi" penceresinden sayısal gerekir çekirdeği seçin. Tüm çekirdeği "tümünü göster" seçeneğini işaretleyerek seçin.
- "Maxima/foci seçili hücre çekirdeği içinde sayısını ölçmek için ölçü birimi" seçin.
Not: Maxima/foci sayısı 255, yanikatları görünür, bir en fazla 255 bir "RawIntDen" (entegre yoğunluk) okuma vardır. - "RawIntDen" değerlerini kopyalayın ve veri analizi için yazılım içine yapıştırın.
- (Fluorescently konjuge ikincil antikor ile lekeli) "H2AX" foci pencereyi seçin. Ardından "Süreci" araç çubuğunu seçin ve "Maxima çekirdeklerin içindeki resimde bulmak için bul" seçin.
2. uzun süreli iki iplikçikli DNA mola için yerelleştirme analiz
- Tohum hücreleri 96-şey plakaları/coverslips açıklandığı gibi bölümlerde 1.1 ve 1.2 üzerinde.
-
Çift iplikli kırılmalara DNA indüksiyon
- Üreticinin belirtimlerine göre lipid tabanlı transfection reaktif kullanarak-SCEI ifade vektör ile hücreleri transfect. 24-72 h transfection sonra endonükleaz ifade en üst düzeye çıkarmak için bekleyin. Transfection tekil büyük nükleer γ-H2AX odak içeren hücreleri bularak başarılı olup olmadığını belirlemek.
-
Görüntüleri edinimi
- Tamir, permeabilize, engellemek ve 96-şey plaka/coverslips 1.8 bölümünde açıklandığı gibi yıkayın.
- Bir antikor γ-H2AX ve onarım protein ilgi karşı hücrelerle birlikte kuluçkaya (burada, birincil bir antikor RAD51 karşı % 3 BSA çözüm üreticinin belirtimlerine göre seyreltilmiş kullanılmıştır).
- 96-şey plaka/coverslips 3 kez 1 x PBS ile yıkayın. 96-şey plaka/coverslips %3 BSA çözüm üreticinin protokolüne göre seyreltilmiş ikincil antikor ile kuluçkaya. İkincil fluorophores örtüşen uyarma veya emisyon spectra var mı onaylayın.
- Bir büyük nükleer γ-H2AX odak içeren hücreleri tanımlamak. Sadece önyargı önlemek için bu hücreleri resimlerini çekmek.
-
Uzun süreli ben-SCEI analizini foci indüklenen
- Uzun süreli foci el ile her iki büyük γ-H2AX foci ve ortak yerelleştirilmiş foci ilgi onarım proteinin hücre sayısını sayarak analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 ImageJ kullanarak maxima/foci miktar için doğru gürültü ayrımcılığı yelpazesi gösteriyor. Sol panelde DAPI birleştirilmiş görüntüleri ve faiz onarım protein vardır. Şekil 1A gürültü ayrımcılığı 90 gösterir ve foci doğru sayıda işaretler. Çekirdek (pembe bir okla tasvir) kenar ve foci (sarı bir ok ile tasvir) çekirdeği dışında sırasında miktar sayılmaz. Şekil 1B 50 düşük gürültü hoşgörü gösteriyor. Çok sayıda maxima dışında çekirdek ve çekirdek içinde tanımlanır. Şekil 1 c 220 yüksek gürültü hoşgörü gösterir. Sadece tek bir odak (beyaz ok) tespit edilmiştir. Okuyucu "olumlu" ve "negatif" sonuçları sunmak, biz de Şekil 2' deki temsilcisi sonuçları derledik. Özellikle, Şekil 2A Co yerelleştirme γ-H2AX odak (yeşil) ve onarım protein (kırmızı) ilgi gösteriyor. Benzer şekilde, bir untransfected hücre bu panelin sol üst gösterilir ve bir hücre bir nükleer olmayan (yanlış) γ-H2AX odaklı üst doğru gösterilir. Lütfen Not micronuclei DNA hasarı makine ile ilişkilendirmek Bu nükleer olmayan foci19olası bir kaynak vardır. Şekil 2B bir daha yüksek büyütme iki en sağdaki hücreye Şekil 2A nasıl iç ve dış çekirdek için sırasıyla olduğu belirlenmiştir içinde konusunu açıklığa kavuşturmak amacıyla sağlar. Bir nükleer γ-H2AX odak olmadan eş yerelleştirme onarım protein örneği Şekil 2Ciçinde gösterilir. Bu protokol bir şematik karakterize bu yaklaşım özetleyen Şekil 3 ' te DNA onarım sağlar.
Resim 1 : İki iplikçikli DNA sonu onarım kinetik temsilcisi analizi. ImageJ (Bio-biçimleri eklentisi ile) yazılım kullanarak γ-H2AX foci miktar temsilcisi görüntüler. Sol kapı aynası DAPI ve γ-H2AX için yeşil mavi lekeli çekirdeği (40 X büyütme), bileşik görüntülerdir. Merkezi panelleri başvuru γ-H2AX foci/maxima ile un analiz çekirdek göster. (A)doğru kapı aynası maxima/foci algılama ile 90 gürültü hoşgörü gösterir ve gerçek tahmini foci çekirdek içinde dizi temsilcisidir. (B) sağ paneli maxima miktar düşük gürültü toleransı (50) ile gösterir. Maxima/foci çekirdeği (sarı ok) dışında algılanabilir, maxima'nın içinde bulunan çekirdek belirsiz arka plan sinyalleri. (C) sağ paneli maxima miktar ile yüksek gürültü toleransını (220) gösterir. Sadece bir tek maksimum/odak (beyaz ok) içinde çekirdek algılanır ve çekirdek içinde foci temsilcisi değil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Temsilcisi ben-SCEI indüklenen çift iplikli kırılmalara DNA'sı. Çekirdeği coverslips (40 X büyütme) yetiştirilen hücrelerden temsilcisi görüntüler. Çekirdek mavi lekeli. Bir onarım protein (RAD51) kırmızı lekeli ve γ-H2AX yeşil lekeli. (A) üç kapı aynası göstermek aynı üç hücreleri. Sol köşede çoğu paneli, çekirdekleri görülebilir. Orta panelinde RAD51 için boyama gösterilir. Sağ panelde, γ-H2AX boyama gösterilir. SCEI iz DSBs indüklenen sağ üst köşesinde çekirdeğinde göstermez. Bir büyük γ-H2AX nükleer odak ve bir ortak yerelleştirilmiş RAD51 nükleer odak olduğu gibi Merkezi (pembe ok) çekirdeğinde bir gerçek pozitif olayını temsil eder. Extranuclear olduğu gibi çekirdek sağ tarafında bir yanlış büyük γ-H2AX odak vardır. Foci çekirdeği dışında ortak yerelleştirme analiz için kullanılmamalıdır. (B) Bu Bölüm A birleştirilmiş resmin bir daha yüksek büyütme (merkezi ve doğru en hücreleri) olduğunu. Örtüşme RAD51 ve H2AX sinyal gösteren büyük nükleer sarı odak pembe okla gösterilir. (C) A ortak ilgi DNA onarım protein boyama olmadan bir nükleer γ-H2AX odak temsilcisi görüntüsü. Onarım proteinleri hasar sitelere yerelleştirme engellenir odağı farklı olarak beyaz bir ok (A) ve (B) ile gösterilen sarı ok tipik sonuçları gösterilmektedir. Ölçek çubuğu 15 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Görsel analiz iki iplikçikli DNA sonu tamiri için protokol tasviri. (1) protokolü gösterimi adımları 1.1 hücreleri coverslips/cam üzerine tohum plakaları alt. (2) iki iplikçikli indüksiyon resmi tatili (sağda) hidrojen peroksit ile tedavi veya uzun süreli iki iplikçikli kırılmalar ben-SCEI transfecting 3 µg tarafından inducing. (3) iki iplikçikli kırılmalar görselleştirme için protokol adımları 1.4-1.5.3 gösterimi. (4a) hücre confocal mikroskobu temsil eden görüntü DAPI (mavi) ve γ-H2AX foci (yeşil) ile lekeli. (4b) tekil büyük γ-H2AX foci (yeşil) tekrar görüntüsünü çekirdeği DAPI (mavi) leke. (5a) ImageJ (iletişim kuralı adımları 1.10.1–1.11.5) kullanarak γ-H2AX foci analizini tasviri. (5b) el ile büyük uzun ömürlü γ-H2AX foci (iletişim kuralı adım 2.4) sayısı tasviri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA analizi zarar onarım genel ve temel biyoloji6,20tumorigenesis sonuçları span çünkü çift iplikçikli DNA sonları tamiri özellikle etkin araştırma alanıdır. Bu el yazması Ayrıntılar doğru RAD51 ve γ-H2AX proteinleri DSBs saatlik seyir ileri, bu yöntemi yoluyla çözümlenmesi için katkısını dissects bir yaklaşım DSBs14onarım proteinlerin ek işlevler aydınlatmak için kullanılabilir. Onarım kinetik karşılaştırılması ve onarım makineleri kontrol hücreleri ve hücreler arasındaki ben-indüklenen SCEI DSBs için işe alım protein elendikçe, ilgi ile istihdamı için yerelleştirme, protein katkısını tanımlamak ve DSBs tamir faktörler çözünürlüğü.
Onarım kinetik görselleştirmenin sık kullanılan yaklaşımlar birçok avantajı vardır. Sık sık, onarım derleme dinamik bir süreç ve onarım kompleksleri ayrışma temsil eden aciz olduğu tek zaman noktalarda, incelemeye gittim. İlk harekete geçirmek gelen onarım dolu kararlılık için tam kapsamlı gözlem onarım gecikmeden tam inhibisyon tanımlanmış değil sağlar. Bunun tersi olarak, bir onarım yanıt yanıt normal veya aşırı harekete geçirmek tanımlanmış değildir devre dışı bırakma yeteneği olmadan bu indüksiyon sağlar. Bu büyük ölçüde kurulan bir yaklaşım uygulama değişiklikleri, ancak uzun süreli DSB ikna etmek için nadir kesme endonükleaz bir roman araç kullanmaktır. Bu belirsizliğe yer bırakmadan bir deney sonucu ötesinde kısa süre gecikmiş onun işe alım yerine bir onarım protein lokalizasyonu inhibe Eğer belirlemek için Dedektif sağlar. SCEI indüklenen DSB can son gün ve teorik olarak enzim ifade edilir sürece (hücrenin geçerli kalmalıdır). DSB onarım kinetik da canlı hücre görüntüleme yoluyla görülebilir. Ancak, her ne kadar canlı hücre görüntüleme sağlar algılama onarım olayların gerçek zamanlı olarak, uygulama proteinler GFP gibi bir fluorophore ile etiketlenmesi gereksinimi tarafından engellemiştir. Bu tür genetik manipülasyon protein işlevini değiştirme potansiyeline sahiptir ve bir ek teknik engel temsil eder.
Görüntü analizi ImageJ yazılımı ile master için hantal olabilir. Onarım odak tanıma ve bu yazılımı kullanarak miktar için adım adım yönerge için diğer grupları bu engel kaldırma umuduyla sağlanır. Bu güçlü yazılım artan kullanımı için yol ve daha pahalı programlar maliyetini federal hibe desteği takımlık daralma teker teker ortadan kaldırmak.
Prensip olarak, bu DSBs süresi ayirt mikroskobu tarafından zor tamir proteinlerin görselleştirme etkinleştirmeniz gerekir. Bu yüksek bir birikir değil çünkü algılanması için yeterli konsantrasyon, Örneğin, ben-indüklenen SCEI DSB sonuçlarında daha büyük bir sürekliliği görüntülemek zor olan proteinler için durum olabilir onarım proteinlerin tipik birikimi daha Bu lezyon. Gelişmiş bereket de algılama antikor kalitesinde bir sınırlama tarafından engel görselleştirme artırmak; ne zaman daha az çalışılmış proteinler DNA üzerinde bir etkiye sahip olarak tanımlanan özellikle yararlı olabilir bir özellik onarın. Bugüne kadar bu yaklaşım için 4 DNA onarım proteinler, yani RAD51, RPA70, BRCA1 ve BRCA2 doğrulandı (veri gösterilmez, Şekil 2ve başvuru17)
Son olarak, bu iletişim kuralı hem de hücresel ortamlar sorguya DNA hasar türlerini genişletmek için yapılmış olabilir değişiklikler vardır. En belirgin değişiklik kaynak veya indüklenen DNA hasar türünü değiştirmek. UVB, iyonizan radyasyon veya radiomimetics (phleomycin, bleomycin ve etoposide) DNA tamiri kinetik çalışma kullanmak için ilke kanıtı zaten yayımlanmış18,19,23,24 oldu , 25. hafif değişiklik ile bu yaklaşım aynı zamanda tamir protein cevabıyla NHEJ için DSBs. alternatif olarak, aydınlatmak Britton vd. kullanılan26olabilir bir ön ayıklama tekniğini tanımlamak. Ayrıca, orada geniş tanıma siteleri, ben-SCEI27ile benzer olan endonucleases (ben-HmuI veya ben-BasI) nicking homing vardır. Onları-SCEI ayırt etme, bu enzimler tek iplikçikli DNA kırılmalar (SSBs) neden. Bu enzimler hücre kültürünü içine sorguya uzun ömürlü DSBs. özellikle, bu el yazması açıklanan protokol paralellikler SSB onarım Analizi sağlayacak için tanıma site tanıtımı-SCEI tanıma entegre işlemi Site ve site giriş doğrulama zahmetli olabilir. Neyse ki teknoloji (keskin/Cas9 sistemleri gibi) düzenleme genom gelişmeler bu yükü28hafifletti. Ayrıca bir alan içinde belgili tanımlık gelecek öneriyor, bir istenilen genomik yerde, mühendislik bu gelişmeler kesmek için mühendislik izleme endonucleases başarılı oldu etkin araştırma ve CRISPR/Cas9 kullanımı için klonlama bu adımı neden olabilir gereksiz28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Joel Sanneman ve Dr Philine Wangemann tarafından Kansas State Üniversitesi Veteriner Tıp Fakültesi, çabaları bu tekniği geliştirmek için destek için finanse Confocal mikroskobu çekirdek, teşekkür ederim. pCBASceI Maria Jasin (Addgene plazmid # 26477) bir hediye oldu 30. U2OS DR-GFP hücreleri Maria Jasin18tür bir hediyeydi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
