Summary
إصلاح فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي عملية دينامية، تتطلب ليس فقط تشكيل مجمعات إصلاح فواصل، ولكن أيضا على القرار بعد معالجة الآفة. هنا، نستخدم مجهرية الفلورة لفواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل عابرة وطويلة الأمد كأداة لتشريح هذه الآلية صيانة الجينوم.
Abstract
إصلاح فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل (دسبس) في الحمض النووي عملية درجة عالية من تنسيق، مما يستلزم تشكيل والقرار من مجمعات إصلاح البروتين المتعددة. وينظم هذه العملية عدد ضخم بروتينات التي تروج للرابطة وعدم اقتران من البروتينات لهذه الآفات. ويرجع الفضل في جزء كبير منه إلى القدرة على أداء شاشات الوظيفية من مكتبة واسعة من البروتينات، وهناك تقدير أكبر للجينات اللازمة لتصليح كسر مزدوج-حبلا الحمض النووي. شاشات المانع غالباً الضربة القاضية أو الكيميائية تحديد البروتينات المشاركة في عمليات إصلاح باستخدام زيادة السمية كعلامة لبروتين اللازم لإصلاح جهاز تسوية المنازعات. على الرغم من أن مفيدة لتحديد البروتينات الخلوية رواية المشاركة في الحفاظ على الإخلاص الجينوم، التحليل الوظيفي يتطلب البت في ما إذا كان يعزز البروتين لمصلحة التعريب أو تشكيل أو قرار إصلاح المجمعات.
يمكن اكتشاف تراكم البروتينات إصلاح سهولة كبؤر النووية متميزة مجهر الفلورة. وهكذا، يمكن الوصول الرابطة وعدم اقتران هذه البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي عن طريق مراقبة هذه البؤر النووية فترات الممثل بعد إدخال مزدوج-حبلا الحمض النووي فواصل. هذا النهج يمكن أيضا تحديد البروتينات عامل إصلاح سوء المترجمة، إذا كان إصلاح العيوب لا تحدث في وقت واحد مع التأخير غير مكتملة في إصلاح. في هذا السيناريو، فواصل الحمض النووي المزدوج-حبلا طويلة الأمد يمكن أن يكون إجراء هندسة عكسية لها بالإعراب عن اندونوكليسي قطع نادرة (مثلاً، SceI) الخلايا حيث تم إدماج الموقع الاعتراف للانزيم المذكور في الجينوم الخلوي. الآفة الناتجة من الصعب بشكل خاص حل كما سيتم إعادة إصلاح المؤمنين الاعتراف بالموقع الإنزيم، مما دفع جولة أخرى من الانقسام. نتيجة لذلك هي القضاء على الاختلافات في حركية الإصلاح. إذا لم يتم تشكيل مجمعات إصلاح، قد أعاق التعريب. ويصف هذا البروتوكول المنهجية اللازمة للتعرف على التغيرات في حركية الإصلاح، فضلا عن إصلاح البروتين التعريب.
Introduction
كل يوم، هو قصف كل خلية في جسم الإنسان مع ما يقدر 10، 000 الحمض النووي آفات1. هذا التهديد الوجودي يضعنا في خطر للطفرات، أونكوجينيسيس، فضلا عن خلية الموت. حماية الجينوم الإخلاص، تطورت خلايا الثدييات التصدي للضرر الحمض النووي مع سلسلة معقدة من البروتين الجمعيات والتعديلات. يتم تنظيم هذه الاستجابة إلى مسارات متعددة، المعروفة ب2،استجابة (DDR) تلف الحمض النووي3. التسريح وإعادة الإدماج يتألف من تراكم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الآفات الحمض النووي، تنسيقها زمنياً ومكانيا على حد سواء. وكثيراً ما يدفع التسريح وإعادة الإدماج دورة الخلية اعتقال تجنبا لنشر أو تكثيف للأضرار التي يمكن أن تحدث أثناء النسخ المتماثل من تلف الحمض النووي2،،من45. وفي المقابل، كما أنها ضرورية لبقاء الخلوية لإيقاف دورة الخلية اعتقال قبل إلغاء اقتران إصلاح المجمعات بعد الانتهاء من إصلاح.
بين أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي، هي دسبس ضار آخر. يمكن أن يؤدي الفشل في إصلاح دسبس كروموسوم ترتيبات جديدة أو عمليات الحذف الواسعة النطاق مثل فقدان كروموسوم كامل الأسلحة. إصلاح دسبس ينقسم إلى اثنين مسارات6،،من78. يتطلب جزئ المتجانسة (HR) أخت كروموسوم استخدامه كقالب الحمض النووي وبالتالي تنحصر في أواخر مراحل دورة الخلية9،10S و G2/M. نهاية مثلى عدم الالتحاق بالعمل (نج) ليس لديه هذه القيود، لكن يمكن أن يسبب الحذف الصغيرة عند إصلاح دسبس11،12.
إصلاح جهاز تسوية المنازعات على وجه التحديد، والتسريح وإعادة الإدماج بشكل عام هي المناطق النشطة للتحقيق. وعلى الرغم من يجري تنظيمها في مسارات منفصلة مريح، هناك قدرا كبيرا من التكرار. وفي الواقع، العديد من البروتينات (BRCA1، BRCA2، والجيش الوطني الرواندي المعقدة على سبيل المثال) تشارك في عدة مسارات13،،،من1415،16. إصلاح الآفة بمسار واحد، يمكن أن يؤدي إلى تلف وسيطة التي يجب إصلاحها ب مسار آخر14. متشابكة من هذه المسارات، جنبا إلى جنب مع هذه المهمة المعقدة المتمثلة في تجنيد البروتينات الصحيحة إلى المكان الصحيح لكمية محددة من الوقت اللازم، تتطلب عملية تنظيمية متعددة المستويات.
ويبرز تقرير صدر مؤخرا تعقيدات للتسريح وإعادة الإدماج بإثبات أن إصلاح تشكيل معقدة وحلها والتعريب كل على حدة يمكن البصر17. والهدف العام للبروتوكول التالي تشريح شكل نهائي قدرة الخلايا على إصلاح جهاز تسوية المنازعات. باستخدام مجهر الفلورة، يمكن تصور تراكم البروتينات إصلاح في مواقع الضرر في نقاط الوقت الممثل بعد تنصيب دسبس.
هذا الأسلوب له العديد من المزايا للنهج الشائع استخدامها. وكثيراً ما إصلاح التحقيق في نقاط زمنية واحدة وغير قادرة على تمثيل عملية دينامية للجمعية والانفصال من مجمعات لإصلاح. ويضمن مراعاة النطاق الكامل لإصلاح من التنشيط الأولى إلى الدقة الكاملة أن تأخير في إصلاح ضريبي هو ليس تثبيط كاملة. وعلى العكس، فإنه يؤكد أن استحثاث استجابة إصلاح غير قادر على إلغاء تنشيط استجابة المذكور هو ضريبي لا كالمعتاد أو التنشيط المفرط.
البروتين تأخر تشكيل معقدة وسوء الترجمة لإصلاح البروتينات، ومع ذلك، لا يمكن لا لبس فيه تمييز مع هذا النهج. لتحديد ما إذا البروتينات إصلاح سوء المترجمة مقابل تأخر في تلك الترجمة، يمكن إدخال جهاز تسوية المنازعات "طويل الأمد" من خلال انشقاق الانزيمية من الحمض الخلوي. هو recut الآفة الناتجة عن ذلك في كل مرة يتم إصلاحه، أسفر تركيز إصلاح نووية كبيرة متميزة، وإزالة القيد الزمني من التجنيد. يمكن تحقيق هذا عن طريق تعديل النهج المتبع حاليا باستخدام اندونوكليسي قطع نادرة (مثلاً، SceI) للحث جهاز تسوية المنازعات طويلة الأمد. طول عمر دسبس يمكن تصور البروتينات الإصلاح بعيد المنال مجهر الفلورة. يمكن أيضا تحسين وفرة تعزيز التصور عند الكشف عن يعوقها القيد في نوعية الأجسام المضادة، وميزة التي يمكن أن تكون مفيدة عندما تعتبر البروتينات درس أقل أثرا على إصلاح الحمض النووي.
جدير بالذكر أن نقدم تعليمات صريحة لصورة مجانية تجهيز وتحليل برامج (مثلاً، إيماجيج). يؤدي هذا إلى إزالة عقبة مالية رئيسية في تحليل الصور، فتح استجواب إصلاح أضرار الحمض النووي لجمهور أوسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يرجى ملاحظة أن هذا البروتوكول هو مكتوب لخلايا U2OS التي تحتوي على موقع اعتراف-اسوسﺗﻴﻚ18. الخلايا لا يلزم أن يكون U2OS ولكن يجب أن يحتوي على الموقع اسوسﺗﻴﻚ. قد يحتاج البروتوكول إلى المعدل (مثلاً، عدد من الخلايا في المصنف وأوقات الاحتضان) تبعاً لنوع الخلايا المستخدمة.
1. تحديد حركية تكوين مجمع إصلاح جهاز تسوية المنازعات
- تنمو خلايا U20S-درجفب على طبق استنبات الأنسجة 10 سم حتى 85 – 90% المتلاقية.
- قم بإزالة الوسائط واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) في 3 مل يدتا لمدة 2 دقيقة.
- استبدال يدتا مع 1 مل التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 ضمان أن يتم فصل الخلايا من سطح اللوحة بالعرض تحت مجهر. تحييد التربسين مع 5 مل من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1%.
- تحديد تركيز الخلايا في هذا التعليق باستخدام هيموسيتوميتير وأسلوب الاستبعاد الأزرق تريبان.
- بذور 6 × 103 خلايا/جيدا في 200 ميليلتر من صفيحة 96-جيدا أسفل الزجاج. وبدلاً من ذلك، وضع البذور 4 × 106 خلايا في 8 مل على كوفيرسليبس 12 مم في صفيحة 10 سم.
ملاحظة: كل بئر أو ساترة يمثل نقطة مرة واحدة، بما في ذلك عنصر التحكم. - تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- حمل دسبس
- استبدال وسائط الإعلام من الطبق جيدا 96 لوحة/10 سم ح2س2 المخفف بتركيز 25 ميكرومتر مع دميم + 10% FBS واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
- تغسل الخلايا 3 x 1 x برنامج تلفزيوني واستبدال مع دميم جديدة تستكمل مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ل 0، 1، 4، 8، 24، وحاء 48 ضمان أن تخفيف الطازجة من ح2س2 تستخدم لكل تجربة.
ملاحظة: لتجنب قتل الخلايا بتركيز2 2س ح المستخدمة هنا، ضمان أن جرعة أضرار منخفضة ما يكفي أن تتجنب الجزء الأكبر الخلايا المبرمج والشيخوخة. من المهم مراقبة عملية الاسترداد. وهذا يتحقق على أفضل وجه عن طريق قياس حساسية لمجموعة من الجرعات. القيام فحص MTT أو المقايسة صلاحية خلية أخرى لتحديد تركيز الحد الأدنى من بيروكسيد الهيدروجين التي يمكن استخدامها.
- تحديد وبيرميبيليزينج الخلايا
- تغسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x. إزالة ساترة من اللوحة 10 سم لكل نقطة الوقت ووضعه في بئر واحدة للوحة 24-جيدا لتحديد. استخدام إبرة والملقط لإزالة بعناية ساترة وتجنب خدش الخلايا خارج سطح ساترة.
- إصلاح الخلايا بحضانة لمدة 15 دقيقة مع بارافورمالدهيد 4% (PFA) في مكان مخصص لأوقات بعد ح 1 ح2س2 التعرض واستبدال دميم الطازجة (0، 1، 4، 8 و 24 و 48 ساعة).
- أغسل كوفيرسليبس الثابتة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. بيرميبيليزي الخلايا مع المنظفات غير الأيونية 0.5% المخفف في برنامج تلفزيوني x 1. احتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت، قبل الغسيل x 3 مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: بعد بيرميبيليزيشن، تخزين كوفيرسليبس الممكن في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع على الأقل.
- إصلاح التصور المعقدة
- كتلة اللوحة/كوفيرسليبس 96-جيدا في حل 3% ألبومين المصل البقري (BSA) والمنظفات غير الأيونية 0.1% المخفف في برنامج تلفزيوني 1 x (3% حل جيش صرب البوسنة) ح 1 في الرايت
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف إصلاح البروتين من الفائدة، المخفف وفقا لمواصفات الشركة المصنعة في حل جيش صرب البوسنة 3% ح 1 في الرايت، قبل الغسيل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x.
- احتضان 96-جيدا اللوحة/كوفيرسليبس مع الجسم المضاد الثانوي المخفف وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة في حل جيش صرب البوسنة 3%. وتؤكد أن fluorophores ثانوية لا تملك الإثارة متداخلة أو أطياف الانبعاث.
- بعد الغسيل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 3 مرات إضافة DAPI، المخفف وفقا لمواصفات الشركة المصنعة في برنامج تلفزيوني x 1 واحتضان في RT لمدة 5 دقائق.
- جبل كوفيرسليبس على الشرائح مع انخفاض عامل تصاعد، مع التأكد من وجوه جانب الخلية أسفل. اضغط كوفيرسليبس بعناية وامتصاص أي عامل تركيب الزائدة مع مسح.
- ختم كوفيرسليبس مع طلاء الأظافر شفافة سريعة الجفاف وضمان ختم كاملة ساترة مع الشريحة.
- التقاط صور المجهر [كنفوكل] بالتركيز على قناة DAPI، قبل القنوات الأخرى (مع إشارات من الجينات إصلاح الحمض النووي للفائدة) لتجنب إدخال التحيز في التجربة.
- بدلاً من ذلك، يمكن الحصول على الصور بأخذ Z-أقسام المنطقة المرغوبة والتكثيف الصورة إلى طائرة واحدة لتصور جميع البؤر القابلة للاكتشاف.
ملاحظة: إذا كان لا يحترم قرار جهاز تسوية المنازعات أو البروتين من الفائدة في النقاط الزمنية المختارة، تحديد متى حل دسبس عن طريق تحديد مجموعة واسعة من النقاط الزمنية في البداية (ح 0 – 48 وظيفة الاستقراء جهاز تسوية المنازعات). سوف تختلف نقاط الوقت الاهتمام بطريقة الاستقراء جهاز تسوية المنازعات وإصلاح البروتين من الفائدة.
- استخدام البرمجيات الحرة إيماجيج لتعريف الأنوية في صور المجهر الفلورة.
ملاحظة: لفتح صور المجهر، يجب تثبيت البرنامج المساعد بيو-الأشكال في إيماجيج.- افتح الصور [كنفوكل] (.czi أو.tif) عن طريق سحب ملف الصورة في نافذة إيماجيج، أو عن طريق تحديد "بيو-صيغ المستورد" من شريط الأدوات "المساعد" في إيماجيج.
ملاحظة: سوف تظهر نافذة "خيار استيراد تنسيقات الحيوية". - حدد "تقسيم القنوات" لتقسيم الصورة إلى DAPI التأسيسي وصور مضيئة ضمن إطار "خيار استيراد تنسيقات بيو".
- حدد "كولوريزيد" في "خيارات اللون" من القائمة المنسدلة. حدد "موافق" لفتح DAPI وهيستون H2AX الصور (H2AX) كفصل windows واختر الصورة DAPI.
- حدد شريط أدوات "الصور" والخيار "ضبط عتبة" لتحديد الأنوية.
ملاحظة: سوف تظهر نافذة "عتبة". - ضبط عتبة الصورة بانزلاق الشريط السفلي من الإطار "عتبة" تماما بالحق. ضبط الشريط العلوي حتى الأنوية تظهر باللون الأحمر تماما مع الخطوط العريضة متميزة، وخلفية سوداء. لا تقم بتحديد تطبيق. قم بإغلاق إطار "ضبط عتبة".
- حدد شريط الأدوات "تحليل"، "تحليل الجزيئات" الخيار. انظر نافذة "تحليل الجزيئات" التي تظهر على الشاشة.
- إدخال الحد الأدنى لحجم نواة.
ملاحظة: لن تحسب جسيمات تحت حجم إدخال كنواة. - من القائمة المنسدلة "عرض"، حدد "الخطوط العريضة". حدد الخيار "إضافة إلى إدارة". انقر فوق "موافق" لفتح إطار "إدارة العائد على الاستثمار".
ملاحظة: سوف تظهر الخطوط العريضة للنوى في نافذة منفصلة. - تعيين أرقام لنواة يمكن تحديدها من الإطار "إدارة العائد على الاستثمار".
- افتح الصور [كنفوكل] (.czi أو.tif) عن طريق سحب ملف الصورة في نافذة إيماجيج، أو عن طريق تحديد "بيو-صيغ المستورد" من شريط الأدوات "المساعد" في إيماجيج.
- استخدام إيماجيج لتحديد البؤر H2AX في صور المجهر الفلورة.
- حدد الإطار البؤر "H2AX" (ملطخة بجسم الثانوي مترافق فلوريسسينتلي). ثم، حدد شريط الأدوات "العملية" واختر "البحث عن ماكسيما" للعثور البؤر داخل النواة.
ملاحظة: سيتم فتح نافذة "البحث عن ماكسيما". - اختر الخيار "نقطة واحدة" من القائمة المنسدلة "نوع الإخراج" وحدد "معاينة التحديد نقطة" لتصور ماكسيما/البؤر. إدخال قيمة "التسامح الضوضاء" اعتماداً على كثافة الأسفار من الصورة (الشكل 1). تحقق من ظهور نافذة بيضاء مع نقاط سوداء صغيرة.
ملاحظة: تمثل هذه النقاط H2AX البؤر/ماكسيما التي تم الكشف عنها. يجب الاحتفاظ بقيمة التسامح الضجيج المستمر لكافة الصور التي يتم تحليلها. سوف تصور ماكسيما كثير/قليل جداً (البؤر) داخل النواة تسامح ضوضاء منخفضة/مرتفعة ولن يكون تمثيل دقيق للبؤر داخل النواة. - حدد الأنوية التي يجب أن يكون كمياً البؤر H2AX لمن الإطار "إدارة العائد على الاستثمار". حدد جميع الأنوية بالتحقق من الخيار "إظهار الكل".
- حدد "إجراء" لقياس عدد ماكسيما/البؤر داخل الأنوية المحدد.
ملاحظة: عدد البؤر ماكسيما/تظهر كمضاعفات 255، أي، واحد كحد أقصى من 255 قراءة "راوينتدين" (كثافة المتكاملة). - نسخ القيم "راوينتدين" ولصقها في برنامج لتحليل البيانات.
- حدد الإطار البؤر "H2AX" (ملطخة بجسم الثانوي مترافق فلوريسسينتلي). ثم، حدد شريط الأدوات "العملية" واختر "البحث عن ماكسيما" للعثور البؤر داخل النواة.
2-تحليل الترجمة إلى استراحة طويلة الأمد مزدوجة-حبلا الحمض النووي
- خلايا البذور على لوحات جيدا 96/كوفيرسليبس كما هو موضح في المقاطع 1.1 و 1.2.
-
فواصل التعريفي للحمض النووي المزدوج-ستراند
- ترانسفيكت الخلايا مع ناقل التعبير-اسوسﺗﻴﻚ استخدام كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. انتظر 24 – 72 ح بعد تعداء إلى أقصى حد تعبير اندونوكلياسي. تحديد ما إذا كان تعداء نجاح عن طريق تحديد موقع الخلايا مع تركيز المفرد γ نووية كبيرة-H2AX.
-
الحصول على الصور
- إصلاح، بيرميبيليزي، وكتلة، وتغسل جيدا 96 اللوحة/كوفيرسليبس كما هو موضح في القسم 1.8.
- شارك احتضان الخلايا بجسم مضاد ضد γ-H2AX والبروتين تصليح للفائدة (هنا، جسم الأولية ضد RAD51 واستخدمت) المخفف وفقا لمواصفات الشركة المصنعة في حل جيش صرب البوسنة 3%.
- أغسل جيدا 96 اللوحة/كوفيرسليبس 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x. احتضان 96-جيدا اللوحة/كوفيرسليبس مع الجسم المضاد الثانوي المخفف وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة في حل جيش صرب البوسنة 3%. وتؤكد أن fluorophores ثانوية لا تملك الإثارة متداخلة أو أطياف الانبعاث.
- تحديد الخلايا التي تحتوي على تركيز كبير نووية γ-H2AX. فقط التقاط صور لهذه الخلايا تجنب التحيز.
-
تحليل طويلة الأمد وأنا-اسوسﺗﻴﻚ الناجمين عن البؤر
- تحليل بؤر دائمة يدوياً، بحساب عدد الخلايا التي تحتوي على البؤر الكبيرة γ-H2AX والبؤر المشترك المترجمة من البروتين تصليح للفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويصور الشكل 1 التحديد التمييز الضوضاء الصحيحة للقياس الكمي ماكسيما/البؤر باستخدام إيماجيج. الصور المدمجة من DAPI والبروتين تصليح للاهتمام في اللوحة اليسرى. الشكل 1A يظهر لتمييز ضوضاء من 90 ويمثل العدد الصحيح من البؤر. لا يتم حساب الأنوية على حافة (صورت مع سهم وردي) وبؤر خارج الأنوية (صورت مع سهم أصفر) أثناء التحديد الكمي. ويصور الشكل 1B تسامح منخفضة ضوضاء من 50. يتم تعريف ماكسيما عديدة خارج النواة وداخل النواة. ويبين الشكل 1 تسامح ضوضاء عالية من 220. تم الكشف عن تركيز واحد فقط (سهم أبيض). لنقدم للقارئ إحساسا "إيجابية" ونتائج "سلبية"، قمنا أيضا بتجميع النتائج الممثلة في الشكل 2. على وجه التحديد، يصور الشكل 2A التعريب المشارك بين تركيز γ-H2AX (أخضر) وبروتين إصلاح للفائدة (أحمر). وبالمثل، خلية أونترانسفيكتيد يظهر في الزاوية اليسرى العليا من هذا الفريق وخلية مع تركيز غير نووية γ-H2AX (false) ويرد في الجزء العلوي الصحيح. يرجى ملاحظة نويات المعاون مع الحمض النووي تلف الآلات مصدر المحتمل لهذه البؤر غير النووية19. يوفر الشكل 2B تكبير أعلى من الخليتين أقصى اليمين من الرقم 2A لتوفير الوضوح في كيفية أنهم مصممون على أن تكون داخلية وخارجية للنواة، على التوالي. ويرد مثال للتركيز H2AX γ النووية دون التعريب المشارك بروتين إصلاح في الشكل 2. وتقدم تخطيطي لهذا البروتوكول في الشكل 3 الذي يلخص هذا النهج الذي يتسم به إصلاح الحمض النووي.
الشكل 1 : الممثل تحليل مزدوج-حبلا الحمض النووي كسر إصلاح حركية. صور الممثل الكمي البؤر γ-H2AX باستخدام برنامج إيماجيج (مع بيو-صيغ البرنامج المساعد). لوحات اليسار هي الصور المركبة من نوى (40 X التكبير)، الملون الأزرق DAPI والأخضر ل γ-H2AX. إظهار لوحات مركز إشارة الأمم المتحدة تحليل الأنوية مع البؤر γ-H2AX/ماكسيما. (A) يبين الكشف عن ماكسيما/البؤر مع تسامح ضوضاء من 90 وهو الممثل للتقدير الفعلي لعدد البؤر داخل النواة الفريق الحق. تظهر لوحة (ب) الحق التقدير الكمي ماكسيما مع تسامح منخفضة ضوضاء (50). ويمكن الكشف عن ماكسيما/البؤر خارج النواة (السهم الأصفر)، بينما الغالبية من الحدود القصوى تقع داخل النواة الإشارات الخلفية غير محددة. (ج) الحق في لوحة يظهر الكمي ماكسيما مع التسامح ضوضاء عالية (220). يتم الكشف عن داخل النواة فقط واحدة كحد أقصى/تركيز (السهم الأبيض) وليس ممثلا للبؤر داخل النواة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الممثل أنا اسوسﺗﻴﻚ فعل مزدوج-حبلا الحمض النووي فواصل. صور الممثل من الأنوية من خلايا تزرع في كوفيرسليبس (40 X التكبير). هي الملون الأنوية الأزرق. إصلاح بروتين (RAD51) هو الملون الأحمر وهو الملون γ-H2AX الأخضر. (أ) الثلاثة لوحات إظهار الثلاثة نفس الخلايا. في الجزء الأيمن الفريق معظم الأنوية مرئية. في الفريق الأوسط، يظهر تلطيخ ل RAD51. في اللوحة اليمنى، يتم إظهار تلطيخ γ-H2AX. لا تظهر النواة في الزاوية العلوية اليمنى التي يسببها أي علامة اسوسﺗﻴﻚ دسبس. النواة في المركز (السهم الوردي) يمثل حدثاً إيجابيا صحيحاً كما كان تركيز كبير γ-H2AX نووية وتركيز RAD51 النووي المشترك مترجمة. نواة على الجانب الأيمن تركيزاً كاذبة γ-H2AX كبيرة كما اكسترانوكلير. لا ينبغي أن تستخدم البؤر خارج النواة لتحليل التعريب المشارك. (ب) هذا تكبير أعلى من الصورة المدمجة في الجزء ألف (مركز والحق معظم خلايا). هو إلى التركيز الأصفر النووية الكبيرة التي تشير إلى تداخل الإشارات RAD51 و H2AX بواسطة السهم الوردي. (ج) صورة الممثل من التركيز H2AX γ النووية دون تلطيخ المشترك من البروتين إصلاح الحمض النووي للفائدة. على عكس التركيز تتم الإشارة إليها بشكل سهم أبيض في (أ) و (ب)، يوضح السهم الأصفر النتائج النموذجية عند إصلاح البروتينات يمنعون من إضفاء الطابع المحلي على مواقع الضرر. شريط المقياس = 15 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : التصوير المرئي للبروتوكول لتحليل إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج-حبلا. (1) تمثيل للبروتوكول خطوات 1.1 لبذر الخلايا على كوفيرسليبس/الزجاج أسفل لوحات. (2) رسم توضيحي لاستحثاث مزدوجة-حبلا فواصل قبل التعامل مع بيروكسيد الهيدروجين (يمين) أو حمل فواصل حبلا مزدوجة طويلة الأمد قبل ميكروغرام 3 ترانسفيكتينج من اسوسﺗﻴﻚ. (3) تمثيل خطوات البروتوكول 1.4 إلى 1.5.3 للتصور حبلا مزدوجة فواصل. (4a) صورة تمثل مجهرية [كنفوكل] خلية ملطخة DAPI (الأزرق) والبؤر γ-H2AX (أخضر). نوى (4b) صورة بؤر γ كبير المفرد-H2AX (الأخضر) مرة أخرى وصمة عار DAPI (أزرق). (5a) تصوير لتحليل البؤر γ-H2AX باستخدام إيماجيج (بروتوكول الخطوات 1.10.1–1.11.5). (5b) تصوير للعد اليدوي من بؤر γ-H2AX طويلة الأمد كبيرة (الخطوة 2، 4 من البروتوكول). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل الحمض النووي إصلاح الضرر بشكل عام، وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على وجه التحديد منطقة نشطة للبحث لأن إثارة تمتد توموريجينيسيس للبيولوجيا الأساسية6،20. هذا نهج الذي يشرح بدقة مساهمة البروتينات RAD51 و γ-H2AX لحل دسبس خلال "الساعة التطلع" الأمام، هذا الأسلوب يمكن استخدامها لتوضيح مهام إضافية لإصلاح البروتينات في دسبس14تفاصيل المخطوطة. المقارنة بين حركية الإصلاح وتجنيد إصلاح الآلات إلى دسبس أنا-اسوسﺗﻴﻚ التي يسببها بين مراقبة الخلايا والخلايا مع البروتين لمصلحة خرج، ستحدد مساهمة هذا البروتين لتجنيد المرتزقة والتعريب، و قرار إصلاح العوامل دسبس.
وقد تصور حركية الإصلاح عدة مزايا أكثر الأساليب المستخدمة شيوعاً. وكثيراً ما يجري التحقيق إصلاح في نقاط زمنية واحدة، فيها عاجزاً عن تمثل عملية دينامية للجمعية والانفصال من مجمعات لإصلاح. مراقبة النطاق الكامل لإصلاح من التنشيط الأولى إلى حل كامل يضمن أن تأخير في إصلاح ضريبي هو ليس تثبيط كاملة. وعلى العكس، فإنه يؤكد أن تحريض استجابة إصلاح دون القدرة على إلغاء تنشيط أن الرد هو لا ضريبي التنشيط العادي أو المفرط. هذه هي إلى حد كبير من التغييرات في تطبيق النهج المتبعة، ولكن استخدام endonuclease قطع نادرة للحث جهاز تسوية المنازعات طويلة الأمد أداة مبتكرة. أنه يسمح للمحقق صورة لا لبس فيها تحديد إذا كانت تحول دون إضفاء الطابع المحلي على بروتين إصلاح بدلاً من توظيف ما يجري تأخير فترة قصيرة من الوقت بعد انتهاء التجربة. اسوسﺗﻴﻚ الناجمين عن جهاز تسوية المنازعات يمكن أن تستمر لأيام ونظريا طالما يتم التعبير عن الإنزيم (ينبغي أن الخلية لا تزال قابلة للتطبيق). ويمكن أيضا ملاحظة الحركية لإصلاح جهاز تسوية المنازعات عن طريق تصوير الخلايا الحية. ومع ذلك، على الرغم من أن يعيش تصوير الخلية يتيح الكشف عن إصلاح الأحداث في الوقت الحقيقي، وهو يعرقل تطبيقه بشرط أن تكون المعلمة البروتينات مع فلوروفوري مثل التجارة والنقل. لديه القدرة على تغيير وظيفة البروتين مثل هذا التلاعب بالجينات ويمثل عقبة تقنية إضافية.
تحليل الصور عن طريق برامج إيماجيج يمكن أن تكون مرهقة للأصول الرأسمالية. ويرد على تعليمات خطوة بخطوة لإصلاح التركيز الاعتراف والقياس الكمي باستخدام هذا البرنامج أملا في إزالة هذه العقبة للمجموعات الأخرى. وهذا يمكن أن يؤدي إلى زيادة الانتفاع ببرامج قوية والقضاء على تكلفة البرامج أكثر تكلفة في وقت تتقلص فيه تجمعات لدعم المنح الاتحادية.
من حيث المبدأ، يجب تمكين مدة هذه دسبس تصور البروتينات الإصلاح بعيد المنال مجهر الفلورة. وهذا يمكن أن يكون الحال بالنسبة للبروتينات التي يصعب على عرض نظراً لأنها لا تتراكم في ارتفاع تركيز كافية الكشف عن، مثلاً، واستمرار النتائج أنا-اسوسﺗﻴﻚ الناجمين عن جهاز تسوية المنازعات في أكبر مما تراكم نموذجية لإصلاح البروتينات في الآفة. يمكن أيضا تحسين وفرة تعزيز التصور عند الكشف عن يعوقها قيد في نوعية الأجسام المضادة؛ إصلاح ميزة التي يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص عندما تعتبر أقل درس البروتينات التي تؤثر على الحمض النووي. وحتى الآن، وهذا النهج تم التحقق من 4 إصلاح الحمض النووي والبروتينات، وهي: RAD51، RPA70، BRCA1 و BRCA2 (البيانات لا تظهر، و الشكل 2، والمرجع17)
وأخيراً، هناك التعديلات التي يمكن إجراؤها على هذا البروتوكول لتوسيع نطاق أنواع الأضرار الحمض النووي التي يمكن أن يكون استجواب فضلا عن البيئات الخلوية. أن تغيير هذا التعديل الأكثر وضوحاً على المصدر أو نوع من تلف الحمض النووي المستحث. إثبات مبدأ لاستخدام الأشعة فوق البنفسجية، الإشعاع المؤين أو راديوميميتيكس (فليوميسين، بليوميسين، و etoposide) لدراسة الحركية إصلاح الحمض النووي قد تم بالفعل نشر18،19،،من2324 , 25-مع تعديل طفيف، وهذا النهج يمكن أيضا توضيح إصلاح البروتين استجابة نج دسبس. بدلاً من ذلك، بريتون et al. وصف تقنية استخراج قبل أن يمكن أن تستخدم26. علاوة على ذلك، هناك هي صاروخ موجه نيكينج اندونوكليسيس (-هموي أو باسي) التي لديها مواقع الاعتراف الواسع النطاق، شبيه-اسوسﺗﻴﻚ27. تمييزها من اسوسﺗﻴﻚ، تسبب هذه الإنزيمات وحيدة-حبلا الحمض النووي فواصل (SSBs). إدخال موقع الاعتراف بأن تسمح هذه الإنزيمات في خط خلية تحليل إصلاح تضمين أحادي الجانب الذي يوازي البروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة لاستجواب طويل الأمد دسبس. جدير بالذكر أن عملية إدماج الاعتراف اسوسﺗﻴﻚ الموقع والتحقق من إدخال الموقع يمكن أن تكون شاقة. لحسن الحظ قد خففت من التقدم في مجال الجينوم تحرير التكنولوجيا (مثل نظم أكثر وضوحاً/Cas9) هذا العبء28. وهناك أيضا حقل البحث النشطة التي نجحت في الهندسة اندونوكليسيس صاروخ موجه قطع في الجينوم موقع المطلوب، مما يوحي بأن في المستقبل، هذه التطورات الهندسية وقد يؤدي استخدام كريسبر/Cas9 هذه الخطوة الاستنساخ يمكن الاستغناء عنها28،29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر جويل سانيمان والدكتور فيليني وانجيمان الأساسية مجهرية [كنفوكل]، الممولة من قبل "كانساس الدولة جامعة كلية الطب البيطري"، على دعمهم للجهود الرامية إلى تطوير هذه التقنية. بكباسسي وكان هدية من ماريا Jasin (بلازميد أدجيني # 26477) 30. وكانت الزنزانات الدكتور U2OS-التجارة والنقل هدية نوع من Jasin ماريا18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
