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Environment

प्रवाह Cytometry के साथ जलीय फिल्म के लक्षण वर्णन

doi: 10.3791/57655 Published: June 6, 2018

Summary

दृश्य clustering के साथ संयोजन में प्रवाह cytometry एक आसान करने के लिए उपयोग और तेजी से जलीय फिल्म अध्ययन के लिए विधि प्रदान करता है । यह फिल्म लक्षण वर्णन, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में परिवर्तन का पता लगाने के फिल्मी समुदाय संरचना, और अजैव का पता लगाने के कणों में एंबेडेड फिल्म ।

Abstract

consortia सूक्ष्मजीवों के गतिशील है कि मीठे पानी के पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । उनके समुदाय संरचना बदलकर, पर्यावरण परिवर्तन के लिए जल्दी से प्रतिक्रिया और इस तरह पानी की गुणवत्ता के संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । वर्तमान में, फिल्म मूल्यांकन ज्यादातर एकीकृत और कार्यात्मक समापन पर आधारित है, जैसे कि संश्लेषक या श्वसन गतिविधि, जो कि फिल्मी समुदाय की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं । फ्लो cytometry और गणनात्मक दृश्य एक वैकल्पिक, संवेदनशील, और समुदाय संरचना के आकलन के लिए आसान करने के लिए उपयोग करने के लिए विधि, विशेष रूप से मीठे पानी के photoautotrophic के भाग की पेशकश । यह केवल मूल नमूना तैयारी की आवश्यकता है, जिसके बाद पूरे नमूने प्रवाह cytometer के माध्यम से चलाया जाता है । एकल सेल ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट जानकारी गणनात्मक दृश्य और जैविक व्याख्या के लिए प्रयोग किया जाता है । इसके अंय तरीकों पर मुख्य लाभ विश्लेषण की गति और उच्च जानकारी सामग्री प्रकृति हैं । फ्लो cytometry कई सेलुलर और एक ही माप में फिल्म लक्षण के बारे में जानकारी प्रदान करता है: कण आकार, घनत्व, वर्णक सामग्री, अजैव में सामग्री, और मोटे वर्गीकरण जानकारी । हालांकि, यह प्रजातियों के स्तर पर फिल्म रचना पर जानकारी प्रदान नहीं करता है । हम जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों के पर्यावरण की निगरानी के लिए विधि के उपयोग में उच्च क्षमता देखते है और एक प्रारंभिक के रूप में फिल्म मूल्यांकन कदम है कि पूरक और अधिक विस्तृत तरीके से विस्तृत जांच बहाव बताते हैं ।

Introduction

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जैव फिल्म सूक्ष्म जीवाणुओं की गतिशील consortia है जो मीठे पानी के पारिस्थितिकी प्रणालियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, प्राथमिक उत्पादन से लेकर, पोषक साइकिल चालन, और सूक्ष्मजीवों के वितरण को प्रभावित करने के लिए जल शोधन और पारिस्थितिकी तंत्र में उनकी जैव विविधता 1. जब इस तरह के रसायनों के रूप में पर्यावरण की स्थिति या तनाव को बदलने के लिए उजागर कर रहे हैं, उनके समुदाय संरचना जल्दी से अधिक सहिष्णु प्रजातियों में बदलाव2,3. उनके उच्च संवेदनशीलता पर्यावरण निगरानी4के लिए आकर्षक मॉडल सिस्टम में बदल जाता है, लेकिन मौजूदा तरीकों में से कोई भी पूरी तरह से वास्तव में एक तेज और आसान तरीका में एक फिल्म समुदाय के गतिशील का पता लगाने के लिए अनुकूल है ।

आम तौर पर इस्तेमाल किया तरीकों का सेट करने के लिए, फिल्म विशेषताएं कार्यात्मक और संरचनात्मक समापन की माप के होते हैं । पूरे समुदाय के स्तर पर, संश्लेषक और श्वसन गतिविधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से extracellular एंजाइमों की गतिविधि के कार्यात्मक राज्य के बारे में जानकारी प्रदान करता है5,6,7,8 ,9. बायोमास प्रारम् भ किया जाता है जो समग्र रूप से फिल्म विकास के लिए एक संकेतक है । संरचनात्मक परिवर्तन वर्तमान में या तो प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ या न्यूक्लियोटाइड आधारित तकनीक के साथ पारंपरिक प्रजातियों की पहचान का उपयोग करके मापा जाता है (उदा., denaturing ढाल जेल ट्रो (DGGE), स्वचालित राइबोसोमल intergenic स्पेसर विश्लेषण (ARISA), metagenomics)10,11,12. इन तरीकों की जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन समय लेने वाले हैं, या विशिष्ट ज्ञान की आवश्यकता है, या विकास के तहत अभी भी कर रहे हैं । अंत में, extracellular पॉलिमर पदार्थों के मूल्यांकन के लिए नए तरीकों (ईपीएस)13,14 और इस फिल्म वास्तुकला1, जबकि संवेदनशील, कम प्रवाह कर रहे हैं और अभी तक की दिशा में विकसित नहीं किया गया है निगरानी प्रयोजनों ।

यह स्पष्ट है कि मीठे पानी के लिए एक पूर्ण विशेषताओं के लिए, यह आवश्यक है के लिए कई विभिंन तरीकों, गठबंधन है, जो फिल्म समारोह, संरचना और वास्तुकला में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । पर्यावरण की निगरानी के लिए, दूसरी ओर, एक तेजी से और संवेदनशील तरीका है कि जैव फिल्म में परिवर्तन का पता लगाने और कार्यात्मक और संरचनात्मक स्तर पर बदलाव की बुनियादी जैविक व्याख्या सक्षम है की आवश्यकता है ।

हम धारा के phototrophic घटक के माइक्रोबियल समुदाय लक्षण वर्णन के लिए एक नई विधि विकसित की है फिल्म (periphyton), जो काफी तेजी से निगरानी के प्रयोजनों के लिए है, और एक ही समय में जैविक फिल्म समुदाय पर पर्याप्त जानकारी प्रदान करता है संरचना जैविक व्याख्या15की अनुमति के लिए । यह एकल सेल फ्लो cytometry (एफसी) पर आधारित है फिल्म के नमूनों की और अभिकलनी दृश्य के साथ युग्मित और एकल कोशिका स्तर पर फिल्म के ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट संपत्तियों पर जानकारी प्रदान करता है ।

इस कार्यप्रवाह के बाद फिल्म नमूना sonication के रूप में नमूना तैयारी के होते हैं, निर्धारण और आकार-आधारित छानने के नमूनों के प्रवाह cytometry द्वारा नमूने का आकलन द्वारा पीछा किया । प्राप्त डेटा एक ही माप में कई सेलुलर लक्षण के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं: कण आकार, घनत्व, वर्णक सामग्री, अजैव सामग्री (जैसे microplastics) में फिल्म । डेटा का यह सेट गणना दृश्य stochastic पड़ोसी embedding (वइसने)16, जो डेटा की तेजी से और आसान व्याख्या सक्षम बनाता है का उपयोग कर के माध्यम से विश्लेषण किया है । हालांकि कुछ हफ्तों के लिए स्थापित करने और विधि का अनुकूलन, एक बार की स्थापना की आवश्यकता है, यह केवल कुछ ही घंटे के परिणाम की व्याख्या करने के लिए इस फिल्म के नमूने इकट्ठा करने से लेता है ।

दूसरों पर प्रस्तुत विधि का मुख्य लाभ विश्लेषण और उच्च जानकारी सामग्री की गति कर रहे हैं । इसके अलावा, नमूने उनके ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति संपत्तियों की हानि के बिना संग्रह के बाद कई हफ्तों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । यह बहुत उपयोगी हो सकता है जब नमूनों की एक बड़ी संख्या का लक्षण वर्णन, जैसे बड़े नमूने अध्ययन या कार्यक्रमों की निगरानी के रूप में आवश्यक है, लेकिन यह भी छोटे खोजपूर्ण अध्ययन में जानकारी का एक पर्याप्त राशि प्रदान कर सकते हैं ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक धारा के विभिंन स्थानों से एकत्र phototrophic (periphyton) के प्रवाह-cytometric विश्लेषण पर आधारित है । प्रोटोकॉल के कई कदम, प्रयोजनों की निगरानी के लिए उपयुक्त साइटों के चयन उदा , अनुसंधान के लक्ष्यों पर निर्भर करता है और इसलिए निर्धारित नहीं किया जा सकता है । दूसरों को कम स्वतंत्रता की अनुमति है और आवश्यकता है कि प्रोटोकॉल बारीकी से पीछा किया जाता है, यह नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल में स्पष्ट कर दिया है ।

प्रोटोकॉल के साथ शुरू होता है के लिए साइटों के चयन के लिए फिल्म आधारित पर्यावरण की निगरानी । अगले कदम के लिए सेट अप प्रवाह है-cytometer (एफसी) इतना है कि इसके मापन के लिए निगरानी वातावरण में फिल्म में रहने वाले विभिंन phototrophic जीवों के बीच भेदभाव सक्षम है । यह साइटों से फिल्म के नमूनों का संग्रह द्वारा किया जाता है, विभिंन प्रजातियों में मौजूद फ्लोरोसेंट गुणों की पहचान करने के लिए और लेजर और फिल्टर है कि उपयुक्त ऑप्टिकल पर माप सक्षम के साथ प्रवाह-cytometer की स्थापना । तरंगदैर्य. एक बार जब एफसी की स्थापना की गई है, एक समय में फिल्म साइटों से एकत्र किया जा सकता है, ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट गुणों के प्रवाह-cytometry द्वारा मापा में मौजूद एकल कणों के, और डेटा दृश्य clustering द्वारा विश्लेषण । परिणामों की बेहतर व्याख्या के लिए, यह स्थानीय के एक एफसी संदर्भ डेटाबेस का निर्माण करने के लिए संभव है फिल्म प्रजाति के रहने वाले और उनके phenotypes और डेटाबेस का उपयोग करने के लिए एफसी डेटा में विभिंन वर्गीकरण की पहचान । सत्यापन के माध्यम से संभव है प्रतिदीप्ति-आधारित एकल कोशिकाओं की पहचान की छंटाई समूहों का उपयोग FACS और सूक्ष्म आधारित वर्गीकरण पहचान वर्तमान प्रजातियों में से एक है । प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रा 1में दिया जाता है.

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Protocol

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1. पारिस्थितिकी तंत्र चयन और फिल्म नमूना

  1. ब्याज की एक जलीय पारिस्थितिकी तंत्र का चयन करें और नमूना साइटों जहां फिल्म बढ़ने लगता है । मध्यम जल प्रवाह के लिए धीमी गति के साथ एक धारा के उथले भागों और फिल्मी लगाव के लिए एक पथरीले streambed उपयुक्त है17,18
  2. वैकल्पिक: यदि साइट में बहुत अधिक नहीं है, तो फिल्मी लगाव के लिए, या किसी साइट के भीतर होने वाली फिल्मी परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, कृत्रिम सब्सट्रेट को साइट में (उदा. ग्लास स्लाइड, सिरेमिक टाइल्स) के लिए रखें, जबकि यह सुनिश्चित कर लें कि वे पानी के प्रवाह के संबंध में एक ही दिशा में और समान गहराई और प्रकाश की तीव्रता19में रखा जाता है ।
  3. नमूना साइट पर पर्यावरण की स्थिति का निर्धारण करने के लिए, प्रकाश की तीव्रता, पानी के तापमान, चालकता, ऑक्सीजन और सतह के ऊपर सही पीएच को मापने के लिए पोर्टेबल उपकरणों का उपयोग करें से नमूना लिया जाना है । नमूना के पाठ्यक्रम पर, मतलब मूल्यों की गणना करने के लिए दोहराया उपाय (3-5) ले.
  4. वैकल्पिक: प्रासंगिक जल रसायन पैरामीटर (भंग कार्बनिक कार्बन (डॉक्टर) का निर्धारण करने के क्रम में पानी के नमूने ले लो, K+, Na+, Ca2 +, एमजी2 +, सीएल-, एफ-, तो42-, पीओ42- , कोई32-, सिइओ44-) ।
  5. सुरक्षात्मक दस्ताने का उपयोग करना, प्रत्येक साइट (या कृत्रिम सब्सट्रेट) से (आकार, आकार, और प्रकार में) तुलनीय पत्थरों को इकट्ठा । पत्थर समान प्रवाह और प्रकाश की स्थिति को उजागर किया जाना चाहिए18
  6. ०.२२ माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से साइट से पर्याप्त स्ट्रीम पानी फ़िल्टर, इतना है कि यह सभी एकत्र नमूनों के लिए तैयार है (उदा, नमूना प्रति 15 मिलीलीटर).
  7. एक नरम टूथब्रश का प्रयोग करें सब्सट्रेट से एक कुप्पी में फिल्म को दूर करने के लिए (ब्रश सभी जब तक) फ़िल्टर धारा पानी की 15 मिलीलीटर के साथ हटा दिया जाता है20
  8. नमूनों को ०.०१% paraformaldehyde में ठीक करें और ०.१% glutaraldehyde21

2. इष्टतम प्रवाह-cytometric (एफसी) मापदंडों का निर्धारण

  1. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए उपनमूना स्थानांतरण (एक 40X/0.75 उद्देश्य का उपयोग कर; यदि आवश्यक एक १०० × १.३ तेल उद्देश्य का उपयोग करें) और नमूनों में मौजूद प्रजातियों की पहचान22,23.
  2. आदेश उचित संस्कृति संग्रह से एकल प्रजातियों की पहचान (जैसे Goettingen विश्वविद्यालय में शैवाल के प्रायोगिक Phycology और संस्कृति संग्रह [EPSAG] या कोलोन के विश्वविद्यालय में शैवाल के संस्कृति संग्रह [CCAC] अगर निगरानी मध्य यूरोपीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में किया जाता है) ।
  3. इसी तरह पर्यावरण की स्थिति में लगातार एक प्रजाति के बढ़ने (जैसे, प्रकाश, तापमान, पीएच) पर्यावरण के लिए इस फिल्म के नमूने से लिए गए थे । 1 डिग्री सेल्सियस और पर्यावरण के नमूनों से ०.५ पीएच बिंदु के भीतर रहने की सिफारिश की है ।
  4. को अलग/फैलाने के लिए कोशिकाओं, केंद्रापसारक ट्यूबों में एकल प्रजातियों के नमूनों की 15 मिलीलीटर डाल और एक पानी के स्नान और जलमग्न के केंद्र में ट्यूबों डाल दिया, ताकि नमूने के तरल सतह स्नान की सतह के रूप में एक ही स्तर पर है । ४५ kHz24,25पर 1 मिनट के लिए नमूनों Sonicate.
  5. एक प्लेट रीडर का उपयोग कर एकल प्रजातियों के अवशोषक और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड. कृपया निर्देशों के लिए पसंद की थाली रीडर को देखें । इस उदाहरण में, ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे पारदर्शी polystyrol प्लेटें २०० µ l नमूना मात्रा और अवशोषक के साथ लोड किए गए थे मापा गया था । (सेटिंग्स का इस्तेमाल किया: (क) प्रतिदीप्ति स्कैन मोड; उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य कदम आकार 10 एनएम, उत्सर्जन स्कैन संख्या 30, बैंडविड्थ 20 एनएम, लाभ १००, 25 चमक, 20 अमेरिकी एकीकरण समय या (ख) अवशोषित स्कैन मोड; 25 चमक, बैंडविड्थ 9 एनएम) ।
  6. लेजर, dichroic बंटवारे और फिल्टर है कि संयोजन में उन सभी फ्लोरोसेंट पर्वतमाला जिसमें विभिन्न प्रजातियों विशिष्ट गुण है को कवर के साथ प्रवाह cytometer सेट करें । मध्य यूरोपीय धाराओं के लिए, एक ४०५ एनएम, ४८८ एनएम और ६३८ एनएम लेजर उपयोगी परिणाम का उत्पादन ।
  7. photomultipliers की वोल्टेज सेटिंग समायोजित करें (सभी प्रवाह cytometers के लिए लागू नहीं) और मापा fluorescences की रेंज नमूनों की सभी घटनाओं के कम से ९९% शामिल करने के लिए.
  8. वैकल्पिक रूप से, अगर प्रजातियों पर ज्ञान में मौजूद है, तो उपलब्ध है, २.२ कदम के साथ शुरू करते हैं । फ्लोरोसेंट गुण ज्ञात हैं, तो चरण २.६ के साथ प्रारंभ करें ।

3. वैकल्पिक: एक प्रवाह-cytometric संदर्भ डेटाबेस की तैयारी

नोट: एफसी को इस फिल्म में मौजूद कोशिकाओं के वर्गीकरण की पहचान की अनुमति नहीं है । एकल प्रजाति के एफसी माप के एक संदर्भ डेटाबेस के लिए, के रूप में इस तरह की स्थितियों में उगाया जाता है, के रूप में इस प्रकार की शर्तों में हो सकता है कि फिल्म के रूप में, डेटा की व्याख्या ।

  1. संदर्भ: एकल प्रजातियां
    1. अनुकूलित एफसी 2.5-7 में स्थापित मापदंडों का प्रयोग, एकल प्रजातियों के ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट गुण मापने (paraformaldehyde और glutaraldehyde में तय की और प्रवाह cytometer के लिए उपयुक्त आकार के फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर) ।
    2. एक ही तरह से एक ही प्रजाति के डेटा को सामान्य रूप से (स्टेप 6.1.2 देखें) के रूप में ।
  2. संदर्भ: क्षतिग्रस्त और क्षय कोशिकाओं
    फिल्मी स्वास्थ्य के सबसे महत्वपूर्ण संकेतकों में से एक है, जो इस फिल्म में मौजूद क्षतिग्रस्त/ इन कोशिकाओं को बढ़ाता है, क्षय कोशिकाओं का एक संदर्भ तैयार किया जा सकता है ।
    1. पतला फिल्म के 1 मिलीलीटर उपनमूना ले लो और उंहें कमरे के तापमान पर ८,००० x g में 10 मिनट के लिए एक तालिका के ऊपर केंद्रापसारक में केंद्रापसारक । 1 मिलीलीटर ९०% इथेनॉल में जिसके परिणामस्वरूप गोली निलंबित और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर निलंबन की दुकान । अगले दिन पर दोहराएं ।
    2. अनुकूलित एफसी सेटिंग्स का उपयोग करना, क्षतिग्रस्त और क्षय कोशिकाओं के ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट गुणों को मापने (फिक्स्ड और फ़िल्टर्ड) ।
  3. संदर्भ: microplastics
    नोट: यदि आप microplastic कणों की निगरानी में है, तो जांच करें कि क्या वे पहचान के लिए ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति गुणों में बायोटिक कणों से पर्याप्त अलग हैं ।
    1. microplastics निर्माता के निर्देशों के अनुसार microplastic कणों को निलंबित और उनके ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट संपत्तियों को मापने (२.७ से एफसी मापदंडों का उपयोग) ।
    2. microplastic कणों को फिल्म के नमूने में जोड़ें और रात को 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें ।
    3. ऊपर के रूप में एक ही एफसी मापदंडों के साथ निलंबन और माप फ़िल्टर.

4. नमूना तैयारी और भंडारण

  1. एक बार एफसी स्थापित किया गया है और एफसी संदर्भ डाटाबेस तैयार है, एक ताजा फिल्म के नमूनों के मूल्यांकन के साथ आगे बढ़ना, 1.1 कदम के अनुसार एकत्र कर सकते है – 7 । को अलग/बिखरने के लिए, बोतल से नमूनों की 15 मिलीलीटर स्थानांतरण (१.७ कदम देखें) केंद्रापसारक ट्यूबों में ।
  2. एक पानी के स्नान के केंद्र में एक ट्यूब रखो और इतना है कि नमूने के तरल सतह स्नान की सतह के रूप में एक ही स्तर पर है जलमग्न । ४५ kHz पर 1 मिनट के लिए नमूनों Sonicate.
  3. नमूनों को ०.०१% paraformaldehyde में फिक्स करें और ०.१% glutaraldehyde (nanopure पानी में स्टॉक) । विश्लेषण के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  4. महत्वपूर्ण: फ्लो-cytometry विश्लेषण के लिए नमूनों का आधे का उपयोग करें और सुरक्षा के लिए भंडारण में आधा रखने के लिए और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई और/या प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ वैकल्पिक सत्यापन के लिए (अनुभाग 6 देखें) ।
    नोट: फ्रिज में संग्रहित, फिक्स्ड फिल्म के नमूनों को तीन सप्ताह तक अपने ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट संपत्तियों को रखना चाहिए ।

5. एफसी के माध्यम से नमूना रनिंग

  1. यदि नमूने फ्रिज में जमा हो गए तो उन्हें जल्दी से sonicate या पिपेट को अलग करने के लिए कई बार कणों से. ५० माइक्रोन फिल्टर के साथ उपनमूना फ़िल्टर (फिल्टर आकार एफसी केशिका की चौड़ाई पर निर्भर करता है) को मापने से पहले ।
  2. व्यक्तिगत नमूनों (1 – 2 मिलीलीटर लोड, यह प्रवाह cytometer में इस्तेमाल किया cytometer पर निर्भर करता है) और प्रत्येक कण के ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट गुणों को मापने । प्रत्येक जैविक प्रतिकृति (तीन तकनीकी प्रतिकृति) प्रति माप तीन बार दोहराएँ ।
  3. . csv स्वरूप में FC से डेटा निर्यात करें ।

6. डेटा तैयारी और सहसंबंध विश्लेषण

एफसी कई मापदंडों का विश्लेषण कर सकते हैं (उदा., सिग्नल क्षेत्र, ऊंचाई, चौड़ाई) प्रत्येक मापा ऑप्टिकल संपत्ति और प्रतिदीप्ति रेंज के लिए । मापा चर पर एक सहसंबंध विश्लेषण चलाएं और केवल उन माप है कि उच्च संबंधित नहीं है रखना । यह आमतौर पर सभी लेकिन एक एफसी पैरामीटर को हटा (उदा., संकेत क्षेत्र) और भी अत्यधिक फ्लोरोसेंट माप (आमतौर पर एक ही लेजर और पड़ोसी फिल्टर से उपजी) को दूर कर सकते हैं ।

  1. Matlab में एक उपकरण बॉक्स के रूप में CYT भागो:
    1. सभी नमूनों कि सभी तकनीकी और जैविक प्रतिकृति सहित CYT सॉफ्टवेयर16में विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं से. csv प्रारूप में कम एफसी डेटा आयात. (क्लिक करें +, फ़ाइल फ़िल्टर *. csv, आयात के लिए फ़ाइलों का चयन करें) ।
    2. अतिशयोक्तिपूर्ण चापज्या परिवर्तन का उपयोग कर सभी नमूनों की फ्लोरोसेंट चैनल बदलना । cofactor के मूल्य का चयन किया जाना चाहिए; १५० सबसे phototrophic और प्रवाह cytometers के लिए काम करता है, लेकिन अनुकूलन विशेष प्रयोगात्मक setups और heterotrophic के लिए आवश्यक हो सकता है फिल्म । (राइट-क्लिक करें/ट्रांस्फ़ॉर्म/Cofactor १५०)
    3. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, नेत्रहीन की तुलना (CYT में) व्यक्तिगत नमूनों और व्यक्तिगत ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट चैनलों के हिस्टोग्राम यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रतिकृति के तकनीकी और जैविक स्तर पर कोई outliers नहीं हैं । Outliers काफी दोहराने के बीच फ्लोरोसेंट/ऑप्टिकल वितरण में परिवर्तन प्रकट होगा । (चुनें डेटा, चैनल का चयन करें, भूखंड)
      1. वैकल्पिक: फ्लोरोसेंट वितरण के औसत मूल्यों पर एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) भागो और सुनिश्चित करें कि तकनीकी और जैविक प्रतिकृति क्लस्टर एक साथ ।
    4. प्रत्येक जैविक दोहराने में तकनीकी प्रतिकृति मर्ज, और जैविक प्रतिकृति का नमूना है, ताकि प्रत्येक कणों की एक ही संख्या के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है (कोशिकाओं, सेल टुकड़ा और अजैव कणों) और इतना है कि कणों की कुल संख्या द्वारा विश्लेषण बार्ंस-हट stochastic पड़ोसी embedding (bh-SNE) १५०,००० के आसपास है (सबसे अच्छा दृश्य26परिणाम के लिए) । (का चयन करें डेटा, राइट-क्लिक करें, मर्ज/
    5. नमूनों के बीच तुलना के लिए, यह केवल उन नमूनों की तुलना में किया जा करने के लिए चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । नमूनों का चयन करें और भागो बिहार-SNE27। एक बार एल्गोरिथ्म समाप्त हो गया है, नए चैनल, नाम bh-SNE1 और bh-SNE2 दिखाई देते हैं । ये सभी विश्लेषित कणों के SNE निर्देशांक हैं, जिनका उपयोग एक कैटरिंग प्लाट (वइसने map) में डेटा की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है. (डेटा का चयन करें, चैनलों का चयन करें, राइट-क्लिक, bh-SNE, हां सामान्यीकृत डेटा)
    6. वइसने नक्शे में, कणों समानता के अनुसार तैनात है और नेत्रहीन अविभाज्य समूहों में वर्गीकृत किया । क्लस्टर्स और मार्क और नाम उन है कि अच्छी तरह से अलग है और CYT में उपलब्ध ड्राइंग उपकरण का उपयोग करके अलग ऑप्टिकल/प्रतिदीप्ति गुण है के ऑप्टिकल/ (चैनल का चयन करें bh-SNE1, bh-SNE2)
    7. वैकल्पिक: यदि एकल माइक्रोबियल प्रजातियों के एक संदर्भ डेटाबेस (एक ही प्रवाह-cytometry सेटिंग के साथ मापा और इसी तरह की शर्तों के तहत हो!) उपलब्ध है, Matlab में वइसने नक्शे निर्यात और परियोजना के नक्शे पर संदर्भ डाटाबेस । इस तरह, विशेष समूहों विशेष प्रजातियों/वर्गीकरण समूहों (https://github.com/anzezupanic/FC_analysis पर डाउनलोड के लिए उपलब्ध लिपियों) से जोड़ा जा सकता है । (सत्र सहेजें/
    8. समस्या निवारण: यदि बिहार-SNE विश्लेषण नेत्रहीन अविभाज्य समूहों वापस नहीं करता है, लेकिन एक भी बड़े एक, बहुत सारे कण बिहार-SNE में इस्तेमाल किया गया । नमूना प्रति कम कणों के साथ फिर से प्रयास करें । यदि कोई क्लस्टर नहीं हैं, बल्कि विरल व्यक्तिगत अंक, इस्तेमाल किया कणों की संख्या में वृद्धि.
  2. वैकल्पिक: के बजाय बिहार-SNE पर निर्भर करने के लिए क्लस्टरिंग, अन्य क्लस्टरिंग विधि (जैसे, पदानुक्रमित, केन्द्रक-आधारित या घनत्व आधारित clustering) सामान्यीकृत डेटा पर उपयोग किया जा सकता और फिर वइसने मैप पर आरोपित (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis) ।
  3. एक बार क्लस्टर्स की पहचान की गई है, प्रत्येक क्लस्टर में कणों की संख्या की गणना प्रत्येक नमूने में प्रत्येक जैविक दोहराने के लिए संबंधित । नमूनों के बीच अंतर का आकलन करें, ANOVA और Tukey के परीक्षण का उपयोग कर के साथ उपयुक्त (उदा., होंस) एकाधिक तुलना के लिए सुधार ।

7. वैकल्पिक: प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग का उपयोग कर क्लस्टर व्याख्या की मांयता

  1. क्लस्टर्स की पहचान की गई है, तो प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) उन्हें नमूनों से बाहर सॉर्ट करने के लिए यदि वांछित, का उपयोग करें बशर्ते कि FACS पराबैंगनीकिरण और फ्लोरोसेंट फिल्टर के एक समान (या समान) विन्यास है.
  2. प्रत्येक क्लस्टर की पहचान के लिए, CYT ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट फाटकों कि क्लस्टर परिभाषित प्रदान करता है । FACS के साथ प्रत्येक क्लस्टर में कणों को बाहर तरह और फिर प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इन फाटकों का उपयोग करें ।

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Representative Results

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यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना (चित्रा 1), स्विट्जरलैंड में एक स्थानीय स्ट्रीम के कई साइटों से लिया नमूनों का विश्लेषण किया गया । प्रत्येक साइट पर, तीन समान आकार के पत्थर (10-12 सेमी) ले जाया गया था, और फिल्म पत्थर से ब्रश किया गया । नमूने तो sonicated, फिक्स्ड, फ़िल्टर और बाद में प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । प्रवाह cytometer का सेटअप और संदर्भ डेटाबेस का उपयोग एक पिछले पेपर15में वर्णित के रूप में ही थे: तीन पराबैंगनीकिरण इस्तेमाल किया गया था (४०५, ४८८ और ६३८ एनएम), सात dichroic बंटवारे और दस फिल्टर है कि प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को कवर ४२५ से > 755 एनएम , और > 30 सहित संदर्भ डाटाबेस cyanobacteria, हरी शैवाल, diatoms और लाल शैवाल है कि स्विस स्ट्रीम में फिल्म में पाए गए थे कवर प्रजातियों । वइसने नक्शे के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया कणों की कुल संख्या लगभग १५०,००० (चित्रा 2a) था. वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग करना, यह विभिंन साइटों के बीच अंतर करने के लिए संभव है (चित्रा 2 बी), मोटे वर्गीकरण जानकारी (चित्रा 3) के साथ कोशिकाओं की उपजनसंख्या में वइसने नक्शे के विभिंन भागों वर्गीकृत और स्थापित जो उपजनसंख्या नमूनों (चित्रा 4) के बीच अलग थे ।

एक समान दृष्टिकोण एक फिल्म में microplastic कणों का अंदाजा लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । मीठे पानी में कोशिकाओं को समान आकार के microplastic कणों के शुद्ध नमूने (सीए .10 µm), फिल्म की उपस्थिति या microplastic कणों की अनुपस्थिति में प्रयोगशाला में उगाया नमूनों (Tlili एट अल में वर्णित के लिए फिल्म विकास प्रोटोकॉल का उपयोग कर. २०११5) मापा और तुलना (चित्रा 5) थे । यह निर्धारित किया गया है कि ज्ञात ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट संपत्तियों के साथ microplastic कणों मजबूती से १,००० पीपीएम से ऊपर सांद्रता में पाया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक प्रोटोकॉल का स्कीमा. पर्यावरण की फिल्म के नमूनों का संग्रह, उनके ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट संपत्तियों के निर्धारण और उपयुक्त पराबैंगनीकिरण और फिल्टर के साथ प्रवाह फिटिंग-cytometer के लिए इन मापने के लिए इस प्रजाति की पहचान के द्वारा पीछा किया जाता है गुण. प्रवाह-cytometric माप के लिए, नमूने sonicated, फिक्स और संग्रहीत हैं । जब पर्याप्त नमूने इकट्ठा किया गया है वे प्रवाह cytometry द्वारा मापा जाता है, जहां प्रत्येक मापा सेल के लिए, ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति गुणों की एक संख्या प्राप्त कर रहे है और दृश्य clustering का उपयोग कर विश्लेषण । वैकल्पिक रूप से (बिंदीदार तीर), यह संभव है की एक एफसी डेटाबेस का निर्माण करने के लिए निगरानी में मौजूद प्रजातियों में से वर्तमान में फिल्म और परिणामों की व्याख्या के लिए डाटाबेस का उपयोग करें । यह भी आगे सत्यापन विधियों का उपयोग करने के लिए संभव है, उदा प्रतिदीप्ति-आधारित सेल छँटाई और वर्गीकरण विश्लेषण प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वइसने नक्शे का उपयोग कर पर्यावरणीय फिल्मों की तुलना. (a) बहुत अधिक कक्षों (३००,०००) से प्राप्त वइसने मानचित्रों में एक एकल बड़े क्लस्टर (ऊपर) है, बहुत कम (१०,०००) कक्ष क्लस्टर्स प्रपत्र (ca. १५०,०००) की एक इष्टतम संख्या के रूप में नहीं करते हैं, जबकि कक्ष (सीए. (ख) छह अलग नमूनों से संबंधित वइसने नक्शे के सबसेट वइसने नक्शे के विभिन्न भाग में विभिन्न घनत्व सुविधा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: उपफिल्मों में कणों की उपआबादी की clustering । (क) वइसने नक्शे के विभिंन भागों अलग ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति गुण है कि कणों के बायोटिक/अजैव मूल के लिए सुराग दे और जो वर्गीकरण समूह बायोटिक कणों (कोशिकाओं) के लिए कर रहे है के साथ कणों से आबाद है (तरंग दैर्ध्य ऊपर से नीचे तक: ५२५ एनएम, ६९५ एनएम, ६६० एनएम) । प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए, रंग स्केल उच्चतम मापा प्रतिदीप्ति (लाल) से निम्नतम मापा (नीला) करने के लिए सामान्यीकृत है । (ख) वइसने मानचित्र पर संदर्भ डेटाबेस (लाल डॉट्स) के प्रक्षेपण से यह समझने में मदद मिल सकती है कि मानचित्र के कौन-से भागों की आबादी है जिसके द्वारा taxa और/या अजैव कण: क्षय कोशिकाएं (ऊपर), diatoms (मध्य), cyanobacteria (नीचे) । (C) में जानकारी के आधार पर (A) और (B) और वइसने मानचित्र के नेत्रहीन अविभाज्य क्लस्टर, यह संभव है वइसने मैप के विभिंन भागों को विभिंन समूहों (SP1-11) को असाइन करें और तदनुसार समूहों को श्रेणीबद्ध करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: इस फिल्म के नमूनों का सांख्यिकीय विश्लेषण । (A) ठहराव प्रत्येक उपजनसंख्या के कणों की संख्या अलग जैविक प्रतिकृति से संबंधित की गिनती द्वारा किया जाता है । एक-एफ एक स्थानीय स्ट्रीम के साथ छह अलग स्थानों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें से फिल्म के नमूने लिए गए थे । (B) ANOVA का उपयोग नमूनों के बीच अंतर का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें उपयुक्त एकाधिक तुलना सुधार (p < 0.05, pairwise Tukey एचएसडी सभी साइट्स बनाम साइट A) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: वइसने के साथ microplastic कणों ट्रैकिंग । (क) Microplastic कणों, (ख) मीठे पानी में, (ग) मीठे पानी में Microplastic कणों के साथ मिश्रित फिल्म, (घ) ६९५ एनएम पर एफसी द्वारा मापा कणों की प्रतिदीप्ति । रंग स्केल से सामान्यीकृत है उच्चतम मापा प्रतिदीप्ति (लाल) करने के लिए सबसे कम मापा प्रतिदीप्ति (नीला) पर ६९५ एनएम. microplastic कणों और फिल्म कणों के बीच अनुपात लगभग 1:1 है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित अपेक्षाकृत को लागू करने के लिए आसान है । हालांकि, जबकि प्रस्तुत डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स सभी phototrophic के लिए उपयुक्त होना दिखाया गया है इस प्रकार अब तक परीक्षण, अनुकूलन (जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है) के लिए विधि से प्राप्त जानकारी को अधिकतम आवश्यक है । दरअसल, जैव फिल्म के ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट गुण, पर्यावरण की स्थिति (मौसम, तापमान, पानी की रासायनिक संरचना) के आधार पर भिन्न हो सकते हैं1. इसलिए, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है जब एफसी विश्लेषण की स्थापना इस परिवर्तनशीलता । एक तरीका यह करने के लिए नमूना साइटों से और/या एकल प्रजातियों लेने और उंहें विभिंन स्थितियों में बढ़ रही है और उंहें विभिंन setups का उपयोग करने के उपाय से है । बढ़ती एकल प्रजातियों भी फ्लोरोसेंट संपत्तियों कि एफसी परिणामों की व्याख्या करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक डाटाबेस का निर्माण करने के लिए उपयोगी है । हालांकि, ऐसा करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि एकल प्रजातियों के उन लोगों के लिए समान परिस्थितियों में मापा गया है जिसके तहत इस तरह के नमूने लिए जा रहे हैं । उदाहरण के लिए, 25 डिग्री सेल्सियस से बढ़ रही एकल प्रजातियों के एफसी माप का एक डेटाबेस 15 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ रही एक फिल्म की संरचना के बारे में बहुत कम बता देगा । हालांकि, यह प्रभावी रूप से इस विधि का उपयोग करने के लिए एक संदर्भ डेटाबेस बनाने के लिए बिल्कुल आवश्यक नहीं है । पहले से ही बुनियादी एफसी प्रोटोकॉल का उपयोग कर के साथ, यह आकार, दानेदार और फिल्म में मौजूद कोशिकाओं में अलग वर्णक की उपस्थिति के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए संभव है । दृश्य clustering में कक्षों का वर्गीकरण की अनुमति देता है जो मापा गुण में समान है और जो गुण के नमूने के बीच सबसे बदल गया है निर्धारण क्लस्टर में । संदर्भ डेटाबेस, हालांकि, भिन्न क्लस्टर्स के लिए वर्गीकरण पहचान असाइन करते समय महत्वपूर्ण हो जाता है । एक बार जैव फिल्म के गुणों में परिवर्तन का पता लगाया गया है, यह उंहें नमूना साइटों पर पानी की शारीरिक और रासायनिक माप के साथ सहसंबंधी बनाना संभव है । यह निर्धारित करने की अनुमति देता है जो पर्यावरणीय कारक निगरानी पारिस्थितिकी तंत्र में फिल्म के समुदाय पर सबसे मजबूत प्रभाव है ।

विधि को लेकर भी कुछ सीमाएं हैं । मसलन, एफसी प्रजातियों के स्तर पर होने वाली फिल्मी बंदिशों की पहचान की इजाजत नहीं देता । इसके अलावा, जब फिल्म के गुणों में परिवर्तन का पता लगाया जाता है, एफसी जिंमेदार कारणों परमशॆवर नहीं कर सकते हैं: अधिक सहिष्णु प्रजातियों की ओर या अधिक सहिष्णु phenotypes (एक ही शेष प्रजातियों) की दिशा में एक बदलाव । अंय, पूरक विधियों, जैसे metagenomics, इस प्रश्न का समाधान करने के लिए आवश्यक हैं । विधि की एक और सीमा है कि केवल phototrophic घटक, विभिंन फ्लोरोसेंट संपत्तियों के साथ pigments के साथ अमीर, विश्लेषण किया है । हालांकि यह निश्चित रूप से heterotrophic फिल्म लक्षण वर्णन के लिए विधि का उपयोग संभव है, यह स्पष्ट नहीं है कि पर्याप्त जानकारी दाग मुक्त विश्लेषण के साथ प्राप्त किया जा सकता है । बैक्टीरिया और कवक के कम प्राकृतिक प्रतिदीप्ति के कारण, विभिन्न सेटिंग्स का इस्तेमाल किया जा करने के लिए है, और यह इसलिए एक एकल एफसी चलाने में एक साथ फिल्म के phototrophic और heterotrophic घटकों का मूल्यांकन करने के लिए संभव नहीं है. बल्कि, नमूना अलग और phototrophic के साथ एक भाग का मूल्यांकन और heterotrophic सेटिंग के साथ एक हिस्सा आवश्यक होगा । अंत में, वहां के लिए वइसने का उपयोग कर के साथ एक सीमा है फिल्म दृश्य । सबसे अच्छा परिणाम सीए के साथ प्राप्त कर रहे हैं. १५०,००० कक्षों की छवि एक साथ है । यह नमूनों की संख्या के लिए एक सीमा है कि विश्लेषण किया जा सकता है और गणना के बिना विधि के साथ तुलना में बहुत अधिक नमूने कमजोर सेट करता है । उदाहरण के लिए, यदि कोई १५० नमूनों की तुलना करना चाहता था, तो प्रत्येक नमूना केवल ca. १,००० कक्षों द्वारा प्रस्तुत किया जाएगा. इस सीमा के आसपास एक तरह से एक "चलती खिड़की" दृष्टिकोण है जिसमें नमूनों के अतिव्यापी समूहों अलग वइसने का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है और फिर एक साथ परित परिणाम, इस तरह के एक समाधान का उपयोग कर नमूनों का विश्लेषण है, तथापि, अभी तक लागू नहीं किया गया है ।

हमारा मानना है कि जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों की निगरानी के लिए प्रवाह-cytometry आधारित मूल्यांकन को कुशलता से लागू किया जा सकता है । यह समय श्रृंखला के नमूनों या विभिन्न स्थानों पर लिया नमूनों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और, नमूना ही के अपवाद के साथ, पूर्ण स्वचालन के लिए क्षमता है. विधि एक प्रारंभिक फिल्म मूल्यांकन कदम है कि पूरक और अधिक विस्तृत तरीकों के साथ बहाव विस्तृत जांच के लिए जानकारी प्रदान करता है के रूप में माना जा सकता है । अंत में, यह और अधिक विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए बढ़ाया जा सकता है, जैसे कि अजैव संदूषण का पता लगाने के रूप में हम microplastic के मामले के लिए दिखाया गया है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

प्रस्तुत कार्य को एक SNF Ambizione फेलोशिप (PZ00P2_142533) और एक Velux रिसर्च ग्रांट (Amplebig) ने समर्थन दिया था । हम प्रयोगात्मक कार्य के साथ मदद के लिए Bettina Wagner शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multimeter WTW MultiLine 3620 IDS For measuring temperature, pH, dissolved oxygen
Ultrasonic cleaner VWR International 97043-986 Tank dimesions: 15*14*10 cm
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. 
Plate reader Tecan Infinite M200 used for selecting appropriate setting of the FC
Cell sorter Beckman Coulter MoFlo Astrios Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. 
Fluorescence microscope Zeiss Axiovert 135 Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective
SOFTWARE
Matlab MathWorks R2013a software for numerical computing
CYT Dana Pe'er Lab Version 1.1 free interactive visualization tool for analysis of cytometry data

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References

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प्रवाह Cytometry के साथ जलीय फिल्म के लक्षण वर्णन
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Sgier, L., Merbt, S. N., Tlili, A., Kroll, A., Zupanic, A. Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (136), e57655, doi:10.3791/57655 (2018).More

Sgier, L., Merbt, S. N., Tlili, A., Kroll, A., Zupanic, A. Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (136), e57655, doi:10.3791/57655 (2018).

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