Caracterización de biopelículas acuáticas con citometría de flujo
Summary
Citometría de flujo en combinación con agrupamiento visual ofrece un método rápido y fácil de usar para el estudio de biopelículas acuáticas. Puede ser utilizado para la caracterización de biopelículas, detección de cambios en la estructura de la comunidad de biofilm y la detección de partículas abióticas en el biofilm.
Abstract
Los biofilms son dinámicos consorcios de microorganismos que desempeñan un papel clave en los ecosistemas de agua dulce. Cambiando su estructura de la comunidad, biofilms responder rápidamente a cambios ambientales y puede ser utilizados así como indicadores de calidad del agua. En la actualidad, evaluación de biofilm sobre todo se basa en extremos funcionales e integrativa como actividad respiratoria o fotosintética, que no proporcionan información sobre la estructura de la comunidad de biofilm. Citometría de flujo y visualización computacional ofrecen un método alternativo, sensible y fácil de usar para la evaluación de la composición de la comunidad, particularmente de la parte Chlorobiaceae de biofilms de agua dulce. Requiere sólo la preparación de muestras básicas, después de lo cual toda la muestra se desarrolla a través de la citometría de flujo. La información sola célula óptica y fluorescente se utiliza para la visualización computacional e interpretación biológica. Sus principales ventajas sobre otros métodos son la velocidad de análisis y de la naturaleza de alto contenido de información. Citometría de flujo proporciona información sobre diversas características celulares y biofilm en una sola medición: tamaño de partícula, densidad, contenido de pigmento, contenido abiótico en el biofilm y grueso información taxonómica. Sin embargo, no proporciona información sobre la composición de la biopelícula en el nivel de especies. Vemos gran potencial en el uso del método de monitoreo ambiental de los ecosistemas acuáticos y como una evaluación inicial de la biopelícula paso que informa más abajo detalladas investigaciones por métodos complementarios y más detallados.
Introduction
Los biofilms son dinámicos consorcios de microorganismos que desempeñan un papel clave en los ecosistemas de agua dulce, que van desde la producción primaria, el ciclo de nutrientes y la purificación del agua a influir en la distribución de los microorganismos y su biodiversidad en el ecosistema 1. cuando biofilms están expuestos a condiciones ambientales cambiantes o a factores de estrés, tales como productos químicos, su estructura de la comunidad se traslada rápidamente hacia más tolerantes las especies2,3. Su alta sensibilidad convierte biofilms en sistemas de atractivo modelo para el monitoreo ambiental4, sin embargo ninguno de los métodos actuales se adapta perfectamente a la realidad trazar la dinámica de una comunidad de biofilm de manera rápida y fácil.
El sistema utilizado de métodos para caracterizar los biofilms consiste en la medición de variables de evaluación funcionales y estructurales. A nivel de toda la comunidad, actividad fotosintética y respiratoria, así como la actividad de enzimas extracelulares proporciona información sobre el estado funcional de la biopelícula5,6,7,8 ,9. Acumulación de biomasa se utiliza como un indicador de crecimiento general de la biopelícula. Cambios estructurales en la actualidad se miden ya sea mediante la identificación de las especies tradicionales con microscopía de luz o con técnicas basadas en nucleótidos (p. ej., desnaturalizando electroforesis del gel del gradiente (DGGE), espaciador intergénico ribosomal automatizado Análisis (ARISA), metagenómica)10,11,12. Estos métodos proporcionan información pero lleva mucho tiempo realizar, o requiere de conocimientos específicos o están todavía en desarrollo. Por último, nuevos métodos para la evaluación de las sustancias poliméricas extracelulares (EPS)13,14 y el biofilm arquitectura1, al tiempo que sensibles, son de bajo rendimiento y no se han desarrollado hacia con fines de monitoreo.
Es evidente que para una completa caracterización de biopelículas de agua dulce, es necesario combinar varios métodos diferentes, que proporcionan la penetración en la función de biofilm, composición y arquitectura. Para monitoreo del medio ambiente, por el contrario, un método rápido y sensible que es capaz de detectar cambios en el biofilm y la interpretación biológica básica de los cambios a nivel funcional y estructural se requiere.
Hemos desarrollado un nuevo método para la caracterización de la comunidad microbiana del componente phototrophic de los biofilms fluviales (perifiton), que es lo suficientemente rápido como para fines de vigilancia y al mismo tiempo proporciona información suficiente en la comunidad del biofilm estructura para permitir la interpretación biológica15. Se basa solo de células por citometría de flujo (FC) de las muestras de la biopelícula y junto con la visualización computacional y proporciona información sobre las propiedades ópticas y fluorescentes de la biopelícula en el nivel unicelular.
El flujo de trabajo después del muestreo de biofilm consiste en preparación de la muestra en forma de sonicación, fijación y filtrado basado en el tamaño de las muestras, seguidas por la evaluación de la muestra mediante citometría de flujo. Los datos adquiridos proporcionan información sobre rasgos celulares varios en una sola medición: tamaño de partícula, densidad, contenido de pigmento, contenido abiótico (por ejemplo microplastics) en el biofilm. Este conjunto de datos es analizada mediante visualización computacional utilizando a visual vecino estocástico incrustación (viSNE)16, que permite la fácil y rápida interpretación de los datos. Aunque un par de semanas se requiere para configurar y optimizar el método, una vez configurado, tarda sólo unas pocas horas de que recoge las muestras de la biopelícula a interpretar los resultados.
Las principales ventajas del método presentado sobre otros son la velocidad de análisis y alto contenido de información. Por otra parte, las muestras pueden conservarse durante varias semanas después de la recolección sin pérdida de su óptica y propiedades de fluorescencia. Esto puede ser muy útil cuando la caracterización de un gran número de muestras es necesaria, como estudios de grandes muestras o programas de control biológico, pero también puede proporcionar una cantidad sustancial de información en pequeños estudios exploratorios.
El protocolo presentado se basa en análisis de citometría de flujo de biopelículas fototróficas (perifiton) recogido de diferentes lugares de un arroyo. Muchos pasos del Protocolo, por ejemplo, la selección de sitios adecuados para la supervisión, dependen de los objetivos de la investigación y por lo tanto no pueden prescribirse. Otros permiten menos libertad y exigen que el protocolo es seguido muy de cerca, esto se hace claro en el protocolo detallado a continuación.
El protocolo comienza con la selección de sitios para el monitoreo ambiental basada en el biofilm. El siguiente paso es configurar el citómetro de flujo (FC) para que sus medidas permiten la discriminación entre diferentes organismos phototrophic viven en biofilms en el ambiente monitoreado. Esto se realiza por la recogida de muestras de la biopelícula de los sitios, identificando las propiedades fluorescentes de diferentes especies presentes en el biofilm y setting-up el citómetro de flujo con láser y filtros que permiten la medición en el óptico longitudes de onda. Una vez que el FC ha sido puesta en marcha, los biofilms pueden ser obtenidos de los sitios periódicamente, las propiedades ópticas y fluorescentes de las solas partículas presentes en el biofilm medido por citometría de flujo y los datos analizados por agrupamiento visual. Para mejor interpretación de los resultados, es posible construir una base de datos de referencia FC de especies locales de biofilm-vida y sus fenotipos y utilizar la base de datos para identificar distintas taxonomías en los datos FC. Validación es posible a través de la clasificación basada en la fluorescencia de los clusters identificados de las células utilizando FACS y basado en la microscopía de la identificación taxonómica de las especies presentes. Un esquema del Protocolo se da en la figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito anteriormente es relativamente sencillo de implementar. Sin embargo, mientras que las programaciones presentadas han demostrado ser aptos para todo fototrófica biofilm probado hasta el momento, optimización (como se describe en el protocolo) es necesario para maximizar la información obtenida por el método. De hecho, las propiedades ópticas y fluorescentes de biofilms pueden variar, dependiendo de las condiciones ambientales (época, temperatura, composición química del agua)<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo presentado fue apoyado por una beca de Ambizione SNF (PZ00P2_142533) y una beca de investigación de Velux (Amplebig). Nos gustaría agradecer a Bettina Wagner por ayuda con el trabajo experimental.
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
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