Summary
Среди наиболее распространенных инфекций в человека является инфекционной пневмонии. Соответствующие в vivo модель имеет решающее значение для понимания патогенеза заболевания и тестирования эффективности Роман терапии. С этой моделью мышиных аспирации орофарингеального пневмонии можно рассмотреть патогенеза и новых методов лечения против этих смертоносных инфекций.
Abstract
Мышиных инфекции модели важны для понимания патогенеза заболевания и тестирования эффективности роман терапевтических средств, предназначенных для борьбы с причинных патогенов. Инфекционной пневмонии среди наиболее распространенных инфекций, представленный пациентов в клинике и таким образом гарантирует соответствующий в vivo модель. Типичные пневмонии модели используют интраназальной прививки, сдавшего чрезмерного организмов за пределами легких, вызывая осложнений пробить и симптомов, таких как синусит, гастрит, энтерит, физические травмы или микрочастица запотевание имитировать аэрозоля распространение более типично туберкулезного, вирусной или грибковой пневмонии. Эти модели не отражают точно патогенеза типичных или здравоохранение внебольничная бактериальная пневмония. Напротив эта мышиных модель ротоглотки аспирационной пневмонии имитирует капелька маршрут в здравоохранение приобрел пневмонией. Прививки 50 мкл бактерий подвеска в ротоглотки наркотизированных мышей вызывает рефлекторный стремление, которое приводит к пневмонии. С этой моделью можно рассмотреть патогенеза причинение пневмонии патогенов и новых методов лечения для борьбы с этими заболеваниями.
Introduction
Нижних дыхательных инфекции является смертоносных инфекционных болезней в мире и наиболее распространенной причиной смерти в развивающихся странах1. Во всем мире эти инфекции приходится более 3,2 миллиона смертей1. Кроме того нозокомиальная пневмония является одними из наиболее распространенных и смертоносных форм здравоохранения инфекций и это вызвано наиболее устойчивых к антибиотикам возбудителей2,3. Типичный маршрут приобретения для обоих внебольничная бактериальная пневмония и нозокомиальная пневмония является аспирации орофарингеального содержимого в альвеолы. Мышиных моделях, используемых для изучения эти заболевания часто используют интраназальной прививки4, сдачи много бактерий за пределами легких, вызывая осложнений пробить и симптомы, как синусит и физические травмы, которые несовместимы с болезнью прогрессии в человека, что модели были разработаны для эмуляции. Другие модели могут использовать ингаляции камер и устройств micromisting, которые более точно имитировать туберкулезного, вирусные и грибковые пневмоний, но не точно охарактеризовать нормальный маршрут приобретения для типичных бактериальных пневмоний.
Мышиных аспирации орофарингеального пневмонии модели могут быть использованы для имитации природных маршрутов и патогенез бактериальной пневмонии. По пересевать 50 мкл бактериальной подвеска в ротоглотки наркотизированных мышей с помощью пипетки рефлекторный стремление вытекает, что приводит к инфекционной пневмонии. С помощью этой модели, можно изучить патогенез причинение пневмонии патогенов и новых методов лечения для борьбы с этими заболеваниями с моделью выше верности, более аналогично стремление пневмонии инфекции наблюдаются в человека. Кроме того в отличие от аналогичных моделей, которые заражают через полости5,6, эта модель гарантирует, что полная посевным материалом достигает легких вместо кишечник, где он может вызвать внеофисной воспаления и инфекции, такие как гастрит и энтерита. Наконец в отличие от другой опубликованной модели, которая требует ларингоскоп и прививает через трахею7, эта модель не препятствовать дыхательных путей с иголка калийную и не требуют инъекции для доставки посевным материалом. Вместо этого прививка опирается на естественное стремление рефлекс мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных должны быть одобрены исследователь институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC).
1. Подготовка бактериальных посевным материалом
- Изолируйте бактериальных колоний.
- Полоска бактериальный штамм (например, A. baumannii «HUMC1») на соответствующую стерильную агар носителе (например, Tryptic соевый агар), стараясь создавать изолированные колонии.
- Инкубируйте на соответствующих условиях (например, на ночь при 37 ° C).
- Растут на ночь культуры.
- Выберите представителя, изолированные колонии от агар пластины с помощью стерильного пересевать цикла и использовать его для инокуляции 10 мл среды надлежащие стерильные бульон (например, Tryptic соевый бульон).
- Разрешить образец достичь стационарной фазы в надлежащих условиях (например, 37 ° C с встряхивания на 200 об/мин на ночь в вентилируемые Кап, 50 мл конические флаконе).
- Растут субкультуры.
- Передачи 100 мкл ночь культуры до 10 мл свежего стерильные бульон с помощью пипетки.
- Позволяют достичь фазы экспоненциального/журнал в надлежащих условиях (например, 37 ° C с встряхивания на 200 rpm для 3 h в вентилируемые Кап, 50 мл конические флаконе).
- Вымойте субкультуры.
- Удалите из своей среды инкубирования субкультура.
- Центрифуга на 4000 × g за 5 мин до Пелле бактерий.
- Аспирационная и удалить супернатант.
- Добавьте 10 мл стерильной фосфат амортизированное saline (PBS) в вихрь энергично до тех пор, пока полностью высокомобильна и пеллет.
- Повторите шаги 1.4.2 - 1.4.4 дважды, в общей сложности 3 стирок.
- Регулировка концентрации бактериальных подвеска.
- С помощью спектрофотометра, что меры, оптическая плотность 600 Нм (OD600), измерения оптической плотности бактериальных подвеска.
- Добавить стерильные PBS бактериальных подвеска пока оптической плотности посевным материалом падает ОД600 0.5, используя уравнения Cя× Vя = Cf× Vf, где сосредоточено «C», «V» – объем, «я» Это первоначальный, и «f» является окончательным. * Cf всегда должна быть 0,5; Vf переменная решить.
- Если бактериальная подвеска опускается ниже ОД600 0.5, центрифуга его на 4000 × g 5 мин Пелле бактерии и удалить соответствующее количество супернатант достичь ОД600 0.5.
- Выполнение серийных разведений в стерильных PBS (например, три разведения 1: 100 для достижения 1 × 10-6) и пластины на стерильную агар для определения коэффициента корреляции, который показывает бактериальных концентратов в формировании колонии единиц (CFUs/мл) в ОД600 0.5.
Примечание: Значение этого коэффициента корреляции будет отличаться для каждого штамма каждого вида и должен быть определен до подготовки посевным материалом для инфекции. - После определения коэффициента корреляции, используйте его для создания посевные желаемой концентрации (например, 2 × 108- 1 × 10-9 CFUs/мл); Если желаемый посевным материалом больше чем ОД600 0.5, центрифуга бактериальных подвеска на 4000 × g 5 мин Пелле бактерии и удалить соответствующее количество супернатант достичь желаемой концентрации.
- Выполните в естественных условиях экспериментальных исследований для определения вирулентности каждого бактериальной изоляции в каждом штамм мыши, как эти значения будут различаться между бактериальных изолятов того же вида и мышей различных генетических особенностей. Различных видов грамотрицательных LD100 мышей составляет 1-5 × 108 CFUs/мыши, хотя некоторые штаммы смертоносных в нижнем инокуляты.
- Заморозить идентичные аликвоты для будущего использования как по требованию, точной инокуляты, как ранее опубликованные8 (необязательно).
- Подготовка 1 Л бактериальной посевным материалом как описано выше, передачу двух конических флакон 500 мл и центрифуги на 4000 × g за 5 мин.
- Отменить 450 мл супернатант от каждого конические флакона и Ресуспензируйте гранулы бактерий в оставшихся супернатант.
- Передать стакан 250 мл, содержащие бар магнитные перемешать сосредоточены посевные бактериальных и непрерывно Смешайте над плитой перемешать в 300 об/мин.
- Тщательно передачи ровно 600 мкл концентрированного бактериальных посевным материалом (например, 1 × 10-10 CFUs/мл) с помощью пипетки 1.6-мл флаконе криогенные, содержащие ровно 300 мкл стерильных H2O и 300 мкл стерильных глицерина; перемешать и хранить при температуре-80 ° C.
Примечание: Глицерин, необходимых для хранения может посрамить экспериментальные результаты и вызвать избыточную смертность, поэтому надо промыть его. - Когда все будет готово для использования, оттепель образца для 10 мин при комнатной температуре.
- Передача 1 мл в 50-мл флаконе конические, добавить 9 мл стерильного PBS и центрифуги в 4000 × g за 5 мин до Пелле бактерий. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте предопределенное количество CFUs (1 мл × замороженные запасов концентрация в CFUs/мл) в соответствующий объем PBS для достижения желаемой концентрации для инфекционных посевным материалом.
2. обезболивающим мышей
- Кетамин/Ксилазина
Примечание: Анестезия с кетамином/Ксилазина имеет длительность, который предлагает достаточно времени для исследователя, который является новым на эту технику, чтобы завершить процедуру прививка, прежде чем мыши пробуждает.- Подготовка 10 мл инъекционного раствора путем объединения 8,5 мл pharmaceutifcal класса PBS, 1 мл 100 мг/мл кетамина раствор (конечная концентрация 10 мг/мл) и 0,5 мл, 20 мг/мл Ксилазина Стоковый раствор (конечная концентрация 10 мг/мл).
- Управлять 10 мкл/g внутрибрюшинной инъекции (IP) (например, 250 мкл для мыши 25-g).
- Применить глазная мазь в глазах мышей, под наркозом с кетамином/Ксилазина потому, что их глаза подвержены повреждениям во время продолжительных периодов анестезии.
- Поместите указатель мыши в клетке и контролировать до тех пор, пока он просыпается от анестезии.
Примечание: Животное не следует оставлять без присмотра до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.
- Изофлюрановая
Примечание: Мышь быстро проснуться от изофлюрановая индуцированной анестезии после удаления из камеры индукции, поэтому этот метод анестезии должны использоваться только после стать владеют на процедуре прививка.- Место наивно мышей в камеру соответствующего размера индукции с проточной кислорода.
- После того, как палата является запечатанный закрыты, анестезировать мышей, используя точность испаритель для добавления изофлюрановая на 4% (v/v) по крайней мере 5 минут; подтвердить анестезии, удалив мыши из камеры для индукции и измерения, как долго он принимает просыпаться от анестезии (~ 60 s).
Примечание: Учтите, что обезболивание, что время может меняться на основе институциональных руководящих принципов и некоторые животные могут потребовать более 5 мин, чтобы стать полностью под наркозом. - Поддержание анестезии для до 10 мин, регулируя изофлюрановая концентрации до 2-3%; Если общая продолжительность анестезии составляет > 15 мин, применять глазной мази в глаза наркотизированных мышей.
- Поместите указатель мыши в клетке и контролировать до тех пор, пока он просыпается от наркоза, как шаг 2.1.
3. прививки/заражение мышей
- Приостановить наркотизированных мыши, висит на его верхней резцов на сильный, тонкие строки (например, зубной нитью) закреплен на неподвижный объект на высоте примерно в два раза мышью длина тела (например, 20 см) над поверхностью эксплуатации (например лабораторном столе).
- Осторожно потяните мыши язык изо рта с помощью стерильных, туп законченному щипцами. Передать язык стерильные, перчатках пальцем для предотвращения случайного дробления языка мыши. Держите язык за пределами рот, позволяя доступ к ротоглотки и предупреждения проглатывания посевным материалом в сторону.
- Удерживая язык мыши, место 50 мкл посевным материалом (бактериальная суспензия) в ротоглотки с помощью микропипеткой; ротоглотки расположен на стыке ротовой полости и глотки к задней части рта.
Примечание: Очень важно поставить только жидкость, дозирование до первой остановки на микропипеткой. Мышь будет остановить дыхание на несколько секунд, когда посевные помещается в ротоглотки; в конце концов рефлекторный стремление приведет к мыши вдыхать бактериальных подвеска, обозначается характерный треск жидкости, введя легких, что приводит к пневмонии инфекции. - Если посевные далеко не помещается обратно достаточно, чтобы блокировать нормальное дыхание, щепотка ноздри с щипцами заставить рефлексивный стремление через рот и последующие ингаляции посевным материалом.
- После прививки отпустите язык, удалить мыши из строки подвеска, поместите его в клетке и контролировать до тех пор, пока он просыпается от наркоза, как шаг 2.1.
4. Мониторинг прогрессирования заболевания
Примечание: Из-за страданий животных, различные показатели должны использоваться для обозначения когда мышей стали умирающий; эвтаназия должна выполняться после этого определения, в соответствии с утвержденной ранее протокол IACUC; включают различные маркеры moribundity температуры тела, потеря веса, внешний вид, походка и другие биомаркеров, которые могут быть получены из крови (например, через ИСТАТ)9,10,11,12, 13,14,,1516.
- Усыпить мышей согласно ранее утвержденный протокол IACUC (например, CO2 следуют шейки матки дислокации).
- Удаление легких от Усыпленных мыши путем разрезания трахеи, легочной артерии и легочной вены недалеко от легких.
- Микроскопия
- Место в образец формы легких (или части).
- Заполните формы образца с оптимальной температуры резки (O.C.T.) соединение, полностью погружаясь в ткани.
- Заморозить образца при температуре-80 ° C.
- Отправьте образец патологоанатомическую лабораторию раздел и смонтировать на слайдах для микроскопии.
- Бактериальные бремя
- Весят легочной ткани на аналитический баланс.
- Передача легочной ткани в 50-мл конические флакон, содержащий 2-5 мл стерильной PBS (в зависимости от размера ткани).
- Однородный легочной ткани с гомогенизатор ткани.
- Выполните серийных разведений огневки в стерильных PBS для достижения примерно 1000 CFUs/мл, основанные на ожидаемых бактериальной нагрузки в легких.
- Например, если ожидается 1 × 10-9 CFUs/мг, выполняют три разведения 1: 100: передачи 100 мкл огневки до 9,9 мл PBS и вихревые; Это первый разбавления 1: 100. Передачи 100 мкл первого разбавления 1: 100 до 9,9 мл PBS и вихревые; Это второй разбавления 1: 100. Передачи 100 мкл второй разбавления 1: 100 до 9,9 мл PBS и вихревые; Это третий и последний 1: 100 разрежения.
- Если бактериальная бремя в легких неизвестен, выполняют широкий спектр разведений захватить ожидаемый диапазон.
- Плита dilution(s) на стерильную агар.
- Подготовить стерильные бульон Tryptic сои (БСЭ) с плиты агара (TSA): комбинат 30 g TSB, 15 г агара, 1 Л воды, смешать с магнитной мешалкой и тепла до кипения на ~ 100 ° C за 5 мин разрешить, чтобы остыть и затем автоклава на жидком цикла на 15 мин разрешить охладить до ~ 55 ° C, передача 10 мл свежего газобетона TSA для стерильных Петри и дайте ему остыть до комнатной температуры. Пусть сухой на benchtop для 2-5 d или открытые под биобезопасности, кабинет на 10 мин.
- Перенести чашку Петри, содержащие стерильные TSA 100 мкл разбавления и распределены по ВСТ с использованием разбрасывателя или стеклянные бусины.
- Храните Петри на ночь при 37 ° C в увлажненные инкубатора (т.е., 37 ° C инкубатор, содержащие открытые 1-Л стакан с водой)
- Определить CFUs/мл легких огневки, основанный на агаре покрытие (например, 100 CFUs на плите TSA с 100 мкл третьего и окончательного растворения, описанных выше, будет иметь 100 CFUs/100 мкл × 100Дил #1 × 100Дил #2 × 100Дил #3 = 1 × 10-9 CFUs/mL).
- Рассчитать CFUs/mg легочной ткани на основе путем деления огневки легких CFUs/мл, мг легких тканей/мл огневки (например, если используется образец описанных выше 100 мг легочной ткани, гомогенизации в 5 мл PBS, затем 1 × 10-9 CFUs/мл ÷ 100 мг / 5 мл = 5 × 107 CFUs/mg).
- Микроскопия
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тщательно следуя протокол, можно легко получить воспроизводимые и надежных данных. Очень важно строго придерживаться один настроенный посевным материалом подготовки протокола для экспериментов, чтобы сравнить один друг к другу. Также важно правильно обрабатывать мышей во время процедуры заражения. Не забудьте поставить мышей в анестезии камеру лишена изофлюрановая. Мыши будут паниковать, если они помещены в камеру, что предварительно заполнены изофлюрановая и могут испытывать лишний стресс, который может нарушить экспериментальные результаты. После обеспечения крышку контейнера, медленно ввести изофлюрановая, постепенно увеличивая его концентрацию от 0% до 4% (v/v); поспешно управляющей изофлюрановая может также вызвать мышей впадать в панику. Как только мышей становятся бессознательное, снижают концентрацию изофлюрановая 2-3% (v/v) и позволяют им оставаться в камере еще несколько минут. На данный момент мыши готовы быть инфицированы (рис. 1).
Удаление мыши из камеры для анестезии и приостановить его на его верхней резцов, чтобы разрешить доступ к языку (рис. 2). Использование туп законченному щипцами осторожно вытащить язык (рис. 3) затем передать стерильные, перчатках пальцы (рис. 4), чтобы предотвратить травмы мыши язык щипцы провел языком. С язык по-прежнему вне полости рта передача 50 мкл посевным материалом на ротоглотки (рис. 5). Здесь очень важно поставить только жидкость, дозирование до первой остановки на микропипеткой. Продолжая до второй остановки может привнести в большой пузырь посевным материалом, который сталкивается с инфекцией.
После завершения этой инфекции существует множество вариантов для тестирования мышей. Для исследования патогенеза, одно может сравнить неинфицированных инфицированные ткани (рис. 6). Если анализ эффективности Роман терапии, можно удалить легких и их секционного и витражи. Это может быть сделано в один момент времени или в нескольких точках времени, чтобы показать прогрессирования заболевания (рис. 7).
Другой вариант заключается в том, чтобы оценить бактериальной нагрузки в легких зараженных мышей. Это делается путем удаления легких, передачи на флакон, содержащий известный объем стерильных PBS, затем гомогенизации с ткани гомогенизатора (полоскание между выборками для предотвращения перекрестного загрязнения). Обшивка серийных разведений легких огневки на агаре питательн-богатые люди позволяет для расчета CFUs/мл для каждого легкого огневки и впоследствии CFUs/mg легочной ткани (рис. 8). Это тоже можно сделать в один момент времени или в нескольких точках времени, чтобы показать прогрессирования заболевания.
Есть бесчисленное множество других анализов, которые могут быть выполнены, включая анализ цитокинов (рис. 9), биомаркеров сепсиса, ИСТАТ (рис. 10), проточной цитометрии для изучения поверхностных маркеров ячейки, сотовых профилирование, RNAseq и т.д.
Рисунок 1 : Определение LD100. Это необходимо заразить мышей с различными инокуляты концентрации для определения LD100. Здесь посевным материалом 2 × 108 CFUs/мыши слишком высока, 5 × 10-7 и 2 × 10-7 являются слишком низкими, и 1 × 108 является только право.
Рисунок 2 : Подвесить мышей Топ резцов. После наркоза мышей, удалить одну мышь из камеры индукции, (A) использовать щипцами вытащить петлю строки, обеспеченных 20-30 см над поверхностью работы (B) переместить строку за мыши Топ резцов, (C) обеспечить строки закреплен за Топ резцов, и (D) пусть мыши повесить его верхней резцов на контуре строки.
Рисунок 3 : Вытащить язык из уст с щипцами и передачи сцепление пальцев перчатке. После висит мыши по верхней резцов, (A) использовать щипцы для нежно обхвати мыши язык, (B) аккуратно вытащить язык, (C) тщательно передать язык от щипцы перчатках пальцы, чтобы предотвратить травмы с мышью язык, и (D) держать язык в месте перчатке пальцами. Будьте уверены применить достаточное давление, чтобы предотвратить соскальзывание обратно в рот язык, но не так много давление что травма вытекает. Язык должен проводиться вне моли и в сторону, чтобы позволить микропипеткой доступа на следующем шаге. На данный момент мышь готова к инфекции.
Рисунок 4 : Заразить мыши. Поддержание язык вне полости рта, используйте микропипеткой передать ротоглотки 50 мкл посевным материалом. Поместите наконечник пипетки в рот на задней части языка и отказаться от бактериальных подвеска, только собирается в первый верхней на микропипеткой; не идти на второй остановке, как это может ввести большой пузырь в посевным материалом, который может мешать полной аспирации.
Рисунок 5 : Микрофотография здоровых (неинфицированных) против инфицированные ткани легкя. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание участков легких до и после ротоглотки стремление A. baumannii, который повторяет маршрут вентилятора ассоциированной пневмонии (VAP), что приводит к смерти обычно в течение 1-3 дней и значительное альвеолярного воспаления, как показано здесь.
Рисунок 6 : Оценить бактериальных бремя; переиздана и изменен с разрешения14 . После заражение мышей, удалите легких, рассечение после успешного эвтаназии соблюдает применимые протокол IACUC. Собирать массы ткани легких, передать флакон с известным тома (2-5 мл) из стерильных PBS, затем гомогенизировать с гомогенизатор ткани. Не забудьте промыть гомогенизатор с этанолом и стерильные PBS для предотвращения перекрестного загрязнения между выборками. Выполните серийных разведений легких огневки и плиты различных разведениях на агаре питательн-богатые люди и инкубировать и надлежащим образом для выбранной возбудителя. Рассчитать CFUs/мл для каждого легкого огневки, основанный на CFUs/плита × разрежения, а затем разделить мг легких тканей/мл легких огневки. Это может быть сделано в один момент времени или в нескольких точках времени, чтобы показать прогрессирования заболевания. Медиан, отображаются с погрешностей, представляющие межквартильный диапазон. p < 0,05 относятся против необработанных группы.
Рисунок 7 : Микрофотография зараженных легочной ткани, лечить против лечение; переиздана и изменен с разрешения14 . После заражение мышей, удалите легких, рассечение после успешного эвтаназии соблюдает применимые протокол IACUC. Надлежащим образом сохранить ткани (например, погруженный в оптимальной температуры вырезывания гель и замороженные при температуре-80 ° C) затем отправить в лаборатории патологии или другой опытный человек для разрезания и пятнать. Это может быть сделано в один момент времени или в нескольких точках времени, чтобы показать прогрессирования заболевания.
Рисунок 8 : Анализ цитокинов; переиздана и изменен с разрешения14 . Для анализа оборотных цитокинов, закупать достаточно крови (например, 50 мкл через хвост уменьшение поперечного сечения), позволяют свертывается на 30 минут при комнатной температуре, центрифуги на 1000 g × 10 мин при температуре 4 ° C и собирать сыворотки супернатант. Сыворотке крови затем могут быть проанализированы на Luminex мультиплекс для цитокинов. Это может быть сделано в один момент времени или в нескольких точках времени, чтобы показать прогрессирования заболевания. Медиан, отображаются с погрешностей, представляющие межквартильный диапазон. p < 0,05 лечение против необработанных группа в то же время момент.
Рисунок 9 : Биомаркеров сепсиса; переиздание и модифицированных с разрешения14 . Анализ биомаркеров сепсиса, закупать 75 мкл крови (например, через хвост уменьшение поперечного сечения) и быстро передавать ИСТАТ картридж, который проверяет для желаемого аналитов. Это может быть сделано в один момент времени или в нескольких точках времени, чтобы показать прогрессирования заболевания. Медиан, отображаются с погрешностей, представляющие межквартильный диапазон. p < 0,05 лечение против необработанных группа в то же время момент.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы быть уверенным мышей не являются миниатюрные люди. Результаты, полученные из модели мыши необходимо рассматривать в контексте и впоследствии толковать применимость к людям, основанный на различия и сходства между двумя видами6. Важно также выбрать соответствующий мыши штамм как некоторые более подвержены некоторые инфекции, чем другие; то же самое относится к штамм возбудителя выбора16.
Важно выполнять инфекции требовательная и высокую воспроизводимость способом. Инокуляты может быть смертельным для мыши на одно значение пока безвреден даже 90% от этого значения. Таким образом важно, что все условия, перечисленные в настоящем Протоколе, воспроизводятся в точно так же, особенно при подготовке посевным материалом и при заражении. Кроме того каждый возбудитель приведет к болезни на уникальный посевным материалом. Таким образом это необходимо для выполнения экспериментальных экспериментов для определения соответствующей посевным материалом для каждого штамма возбудителя и в каждый штамм мыши.
Грамотрицательные бактерии посевным материалом ≤5 × 108 CFUs/мыши достаточно, чтобы вызвать смерть вирулентных штаммов. Рекомендуется не использовать штаммов, которые нелетального ≤1 × 109 CFUs/мыши, потому что они предлагают сомнительное отношение к патогенеза, основанный на огромное количество материала, помещены в легких16.
По сравнению с другими, есть очень мало технических осложнений для аспирации орофарингеального пневмонии модели и воспроизводимость гораздо больше. Только один незначительные осложнения результатов модели, помещенный в ротоглотки поверхностное натяжение вокруг 50 мкл посевным материалом позволяет носового дыхания, исключающие стремление причиной инфекции. В этом случае просто щипать ноздри с щипцами вынуждает рефлексивный стремление побудить инфекционной пневмонии через рот и последующие ингаляции посевным материалом. Однако, это техническая ошибка техник, который можно легко избежать с минимальными практикой.
С точки зрения ее актуальности для болезней человека одно ограничение этой модели, как и другие модели грамотрицательных бактериальных инфекций, является быстрота прогрессирование болезни. Люди редко заражены большой болюс бактериальной подвески, именно поэтому мышей так быстро прогрессировать к болезни. Тем не менее все утвержденные FDA лечения проходят показы таких трансляционного исследования на животных моделях для оценки их терапевтический потенциал перед переходом к клинических испытаний на людях. По иронии судьбы быстрота модели также является привлекательной особенностью, так как она может обеспечить ясность на терапевтическую эффективность в течение короткого периода времени.
Мышиных модели не является совершенным, но это модель с возможностью добросовестно повторить маршрут инфекции и патогенезе заболеваний человека и оценку эффективности потенциальных терапевтических средств, тем самым позволяя для быстрого перевода Роман терапии которые отчаянно необходимы в клинике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национального института аллергии и инфекционных заболеваний в национальных институтов здравоохранения [Грант чисел R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 и AI106375 R42 к BS] и нас продовольственной и лекарствами [контракт HHSF223201710199C для BML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
- Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
- Spellberg, B., Talbot, G. H. Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia. Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).
- Kalil, A. C., et al. Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).
- Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods in Molecular Biology. , 405-410 (2010).
- Azoulay-Dupuis, E., et al. In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiology. 15, 252 (2015).
- Trammell, R. A., Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research. Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).
- Bast, D. J., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Hankenson, F. C., et al. Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).
- Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model. Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).
- Nielsen, T. B., et al. Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE. mBio. 8 (4), (2017).
- Nielsen, T. B., et al. Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis. Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).
- Cheng, B. L., et al. Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection. Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).
- Wong, D., et al. Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
