Summary
الالتهاب الرئوي المعدية من بين الأمراض الأكثر شيوعاً في الإنسان. نموذجا مناسباً في فيفو أمر بالغ الأهمية لفهم منشأ المرض واختبار فعالية العلاجات الجديدة. مع هذا الطراز الالتهاب الرئوي تطلع المكنسية مورين، أحد دراسة المرضية وعلاجات جديدة ضد هذه الأمراض القاتلة.
Abstract
نماذج مورين العدوى ذات أهمية حاسمة لفهم منشأ المرض واختبار فعالية المداواة رواية مصممة لمكافحة العوامل الممرضة المسببة. الالتهاب الرئوي المعدية هي من بين الأمراض الأكثر شيوعاً المقدمة من المرضى في العيادة وهكذا أوامر نموذجا مناسباً في فيفو . التهاب رئوي نموذجي نماذج استخدام التلقيح داخل الآنف، الذي بإيداع الكائنات المفرط خارج الرئة، مما تسبب في مضاعفات خارج الهدف والأعراض، مثل التهاب الجيوب الأنفية والتهاب المعدة والأمعاء، الصدمات الجسدية أو يمثل التغشية إلى تقليد الهباء الجوي وانتشرت أكثر نموذجية من الالتهاب الرئوي الفيروسي أو الدخني أو الفطرية. هذه النماذج لا تعكس بدقة الآلية المرضية للالتهاب الرئوي البكتيري نموذجي اكتسب المجتمع أو الرعاية الصحية. وفي المقابل، يحاكي هذا النموذج مورين المكنسية طموح الالتهاب الرئوي الطريق الحبرية في الالتهاب الرئوي الحصول على الرعاية الصحية. تطعيم 50 ميليلتر من البكتيريا يسبب تعليق في بلعوم فموي للفئران تخديره تطلع انعكاسية، مما يؤدي إلى الالتهاب الرئوي. مع هذا النموذج، واحدة دراسة الآلية المرضية للعوامل الممرضة المسببة للالتهاب الرئوي وعلاجات جديدة لمكافحة هذه الأمراض.
Introduction
عدوى الجهاز التنفسي السفلي هي الأمراض المعدية فتكاً في العالم، والسبب الأكثر شيوعاً للوفاة في البلدان النامية1. على الصعيد العالمي، تمثل هذه الإصابات أكثر من 3.2 مليون حالة وفاة1. وباﻹضافة إلى ذلك، المستشفوية الالتهاب الرئوي من بين النماذج الأكثر شيوعاً وفتكا من العدوى المكتسبة بالرعاية الصحية، وهي الناجمة عن العوامل الممرضة أكثر مقاومة للمضادات الحيوية2،3. مسار نموذجي لاقتناء الالتهاب الرئوي البكتيري على حد سواء المكتسبة في المجتمع، والالتهاب الرئوي في المستشفيات هو طموح لمحتويات المكنسية إلى الحويصلات الهوائية. مورين النماذج المستخدمة لدراسة هذه الأمراض في كثير من الأحيان استخدام التلقيح داخل الآنف4، إيداع الكثير من البكتيريا خارج الرئة، مما تسبب في مضاعفات خارج الهدف وأعراض مثل التهاب الجيوب الأنفية والصدمات الجسدية، وتتعارض مع المرض تطور الإنسان التي كانت النماذج المصممة لمحاكاة. قد تستخدم نماذج أخرى غرف استنشاق وأجهزة ميكروميستينج، الذي أكثر دقة تحاكي بنيومونياس الفيروسية والفطرية السلية، ولكن لا الخص دقة المسار العادي للحصول على بنيومونياس البكتيرية النموذجية.
يمكن استخدام نموذج الالتهاب الرئوي مورين المكنسية التطلع إلى محاكاة الطريق الطبيعية والمرضية للالتهاب الرئوي البكتيري. بتطعيم ميليلتر 50 تعليق البكتيرية في البلعوم تخديره من الفئران باستخدام ماصة، تستتبعه تطلع انعكاسية، الذي ينتج الالتهاب الرئوي المعدية. باستخدام هذا النموذج، واحدة دراسة الآلية المرضية للعوامل الممرضة المسببة للالتهاب الرئوي وعلاجات جديدة لمكافحة هذه الأمراض مع نموذج دقة أعلى، أكثر مماثلة لعدوى الالتهاب الرئوي تطلع لاحظت في الإنسان. بالإضافة إلى ذلك، وخلافا لنماذج مماثلة أن تصيب من خلال5،تجويف الفم6، يضمن هذا النموذج أن العدوى كامل يصل إلى الرئتين بدلاً من القناة الهضمية، حيث يمكن أن يسبب التهاب خارج الموقع، والالتهابات، مثل التهاب المعدة والتهاب الأمعاء. أخيرا، خلافا لنموذج آخر المنشورة التي تتطلب المنظار وإينوكولاتيس من خلال القصبة الهوائية7، هذا النموذج لا تعيق مجرى الهواء بإبرة تزقيمية مدتها ولا تتطلب الحقن لإيصال العدوى. بدلاً من ذلك، يعتمد التطعيم على التطلعات الطبيعية المعاكسة للماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب أن يوافق جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات الباحث "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك).
1-إعداد العدوى البكتيرية
- عزل المستعمرات البكتيرية.
- خط سلالة بكتيرية (مثلاً، بوماني) أ ( "HUMC1") في مناسبة أجار العقيمة المتوسطة (مثلفول الصويا تريبتيك أجار)، مع الحرص على إنشاء المستعمرات المعزولة.
- احتضان في الظروف المناسبة (مثلاً، بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية).
- تنمو الثقافة بين عشية وضحاها.
- حدد ممثل، مستعمرة معزولة من لوحة أجار مع حلقة إينوكولاتينج عقيمة واستخدامها لتلقيح 10 مل من مرق معقمة مناسبة المتوسطة (مثلاً، مرق الصويا تريبتيك).
- تسمح العينة للوصول إلى مرحلة ثابتة في الظروف المناسبة (مثل، 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها في قنينة مخروطية كاب تنفيس، 50 مل).
- تنمو ثقافة فرعية.
- نقل 100 ميكروليتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 10 مل مرق العقيمة الطازجة باستخدام ماصة.
- السماح بالوصول إلى المرحلة الأسية/سجل في الظروف المناسبة (مثل، 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة ح 3 في قنينة مخروطية كاب تنفيس، 50 مل).
- أغسل ثقافة فرعية.
- إزالة في ثقافة فرعية من بيئتها تحضين.
- الطرد المركزي في ز × 4,000 لمدة 5 دقائق بيليه البكتيريا.
- نضح وتجاهل المادة طافية.
- أضف 10 مل من المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS) بيليه ودوامه بقوة حتى حراكه تماما.
- كرر الخطوات 1.4.2-1.4.4 مرتين، لما مجموعة 3 يغسل.
- ضبط تركيز تعليق البكتيرية.
- باستخدام جهاز المطياف الضوئي قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600)، قياس الكثافة الضوئية لتعليق البكتيرية.
- إضافة PBS العقيمة إلى تعليق البكتيرية حتى يسقط الكثافة البصرية العدوى إلى OD600 0.5، باستخدام المعادلة جأنا× الخامسأنا = Cو× Vو، حيث يتركز "ج"، "V" هي وحدة التخزين, "أنا" هي الأولى، و "و" النهائي. * جو يجب أن تكون دائماً 0.5؛ Vو هو المتغير إلى حل.
- إذا كان تعليق البكتيرية تنخفض OD600 0.5، الطرد المركزي أنه في 4,000 × ز لمدة 5 دقائق بيليه البكتيريا وإزالة مبلغ مناسب من المادة طافية للوصول إلى التطوير التنظيمي600 من 0.5.
- إجراء تخفيف المسلسل في برنامج تلفزيوني العقيمة (مثلاً، ثلاث تخفيف 1: 100 لتحقيق 1 × 10-6) ولوحة على أجار العقيمة لتحديد معامل الارتباط الذي يكشف عن تركيز البكتيرية في تشكيل مستعمرة وحدات كل مل (كفوس/mL) OD600 من 0.5.
ملاحظة: قيمة معامل الارتباط هذا سوف تختلف عن كل سلالة من كل الأنواع، ويجب أن تحدد قبل إعداد العدوى لعدوى. - وبعد تحديد معامل الارتباط، استخدامه لإنشاء العدوى من التركيز المطلوب (مثلاً، 2 × 108-1 × 109 كفوس مليلتر)؛ إذا كانت العدوى المطلوب أكبر من القطر الخارجي600 0.5، الطرد المركزي بتعليق البكتيرية في ز × 4,000 لمدة 5 دقائق بيليه البكتيريا وإزالة مبلغ مناسب من المادة طافية للوصول إلى التركيز المطلوب.
- أداء في فيفو دراسات تجريبية لتحديد ضراوة كل عزل البكتيريا في كل سلالة من الماوس كما ستختلف هذه القيم بين البكتيرية المعزولة من نفس النوع والفئران من مختلف الخلفيات الوراثية. لمختلف أنواع الغرام، عموما هو100 دينار في الفئران 1-5 × 108 كفوس/الماوس، على الرغم من أن بعض سلالات قاتلة في لقاح أقل.
- تجميد مختبرين مماثل لاستخدامها في المستقبل كلقاح بناء على الطلب، ودقيقة، كما نشرت سابقا8 (اختياري).
- تحضير 1 لتر العدوى البكتيرية كالموصوفة أعلاه، نقل إلى اثنين 500 مل قارورة مخروطية الشكل، وأجهزة الطرد المركزي في 4,000 × ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل 450 مل من المادة طافية من كل قنينة المخروطية وريسوسبيند كريات البكتيريا في المادة طافية المتبقية.
- نقل العدوى البكتيرية يتركز إلى كوب 250 مل يحتوي على حانة إثارة مغناطيسية وتخلط باستمرار على رأس لوحة ضجة 300 لفة في الدقيقة.
- نقل 600 الضبط ميكروليتر من تتركز العدوى البكتيرية (مثلاً، 1 × 1010 كفوس/mL) بعناية باستخدام ماصة لقنينة مبردة 1.6 مل تحتوي على الضبط 300 ميكروليتر معقمة ح2س و 300 ميكروليتر والغليسيرول عقيمة؛ خلط وتخزين في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن الخلط بين النتائج التجريبية والغليسيرول اللازمة للتخزين وتسبب الوفيات الزائدة ولذلك من الضروري أن تغسل بها. - عندما تكون جاهزاً للاستخدام، إذابة العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نقل مل 1 إلى 50 مل قنينة مخروطية، إضافة 9 مل PBS العقيمة، وأجهزة الطرد المركزي في ز × 4,000 لمدة 5 دقائق بيليه البكتيريا. نضح المادة طافية وريسوسبيند كمية محددة سلفا من كفوس (1 مل × تجميد الأسهم التركيز في كفوس/mL) في وحدة تخزين مناسبة لبرنامج تلفزيوني للوصول إلى التركيز المطلوب للعدوى المعدية.
2-أنيسثيتيزينج الفئران
- الكيتامين/إكسيلازيني
ملاحظة: قد التخدير مع الكيتامين/إكسيلازيني مدة طويلة، الأمر الذي يوفر ما يكفي من الوقت للباحث الذي الجديد في هذه التقنية لإكمال عملية التلقيح قبل أن يوقظ الماوس.- إعداد 10 مل من محلول الحقن من خلال الجمع بين 8.5 مل الصف فارماسيوتيفكال برنامج تلفزيوني، 1 مل 100 مغ/مل الحل الأسهم الكيتامين (التركيز النهائي 10 ملغ/مل)، و 0.5 مل من 20 ملغ/مل Xylazine حل الأسهم (تركيز نهائي 10 ملغ/مل).
- إدارة 10 ميكروليتر/غ عن طريق الحقن (الملكية الفكرية) داخل (مثلاً، 250 ميكروليتر ماوس 25-ز).
- تطبيق مرهم العيون لعيون الفئران تخديره مع الكيتامين/إكسيلازيني لأن عيونهم عرضه للتلف أثناء فترات موسعة من التخدير.
- ضع الماوس في قفص ورصد حتى أنه يستيقظ من التخدير.
ملاحظة: هذا الحيوان لا ينبغي أن تترك غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.
- Isoflurane
ملاحظة: الفئران بسرعة يستيقظ من التخدير التي يسببها isoflurane بعد يتم إزالتها من قاعة التوجيهي، حيث يجب استخدام هذا الأسلوب للتخدير فقط بعد أن أصبح بارعا في إجراء التطعيم.- ضع الفئران ساذجة في دائرة لتحريض حجم مناسب مع تدفق الأوكسجين.
- بعد قاعة مغلقة مختومة، تخدير الفئران باستخدام المبخر دقة لإضافة إيسوفلوراني في 4% (v/v) لمدة 5 دقائق على الأقل؛ تأكيد التخدير عن طريق إزالة ماوس من قاعة الاستقراء وقياس الوقت الذي يستغرقه للاستيقاظ من التخدير (~ 60 ثانية).
ملاحظة: أن تدرك أن التخدير في بعض الأحيان قد تختلف استناداً إلى المبادئ التوجيهية المؤسسية وبعض الحيوانات قد تتطلب أكثر من 5 دقائق لتصبح تخديره تماما. - المحافظة على التخدير لمدة تصل إلى 10 دقائق بضبط تركيز isoflurane إلى 2-3 في المائة؛ إذا كانت المدة الإجمالية للتخدير > 15 دقيقة، تطبيق مرهم العيون لعيون تخديره من الفئران.
- ضع الماوس في قفص ورصد حتى أنه يستيقظ من التخدير، كما هو الحال في الخطوة 2، 1.
3-تطعيم/إصابة الفئران
- تعليق ماوس أنيسثيتيزيد، معلقة من قبل القواطع أعلى في سلسلة قوية ورقيقة (مثلاً، خيط تنظيف الأسنان) المضمونة إلى كائن ثابت على ارتفاع حوالي مرتين الماوس طول الجسم (مثلاً، 20 سم) فوق سطح التشغيل (مثل ، مقاعد البدلاء المختبر).
- بلطف سحب اللسان الماوس خارج الفم استخدام الملقط عقيمة، انتهت بلانت. نقل اللسان لاصبع العقيمة، والقفاز لمنع سحق العرضي للسان الماوس. عقد اللسان خارج الفم، والسماح بالوصول إلى البلعوم ومنع البلع من العدوى إلى الجانب.
- حين عقد اللسان للماوس، ضع العدوى 50 ميكروليتر (تعليق البكتيرية) في البلعوم استخدام ميكروبيبيتي؛ البلعوم يقع على مفترق الطرق في تجويف الفم والبلعوم نحو الجزء الخلفي الفم.
ملاحظة: من المهم جداً فقط تقديم السائل من بيبيتينج إلى المحطة الأولى في ميكروبيبيتي. الماوس سوف توقف التنفس لبضع ثوان عندما يوضع العدوى في البلعوم؛ في نهاية المطاف، سوف يسبب تطلع انعكاسي الماوس يستنشق تعليق البكتيرية، يتبين من الضوضاء طقطقة المميزة للسائل يدخل الرئتين، مما يؤدي إلى الإصابة بالالتهاب الرئوي. - إذا لم يتم وضع العدوى الآن مرة أخرى ما يكفي لكتلة التنفس الطبيعي، قرصه ناريس مع الملقط إلى القوة تطلع انعكاسي عن طريق الفم واستنشاق اللاحقة العدوى.
- بعد التلقيح، الإفراج عن اللسان وإزالة الماوس من سلسلة تعليق ووضعه في قفص ورصد حتى أنه يستيقظ من التخدير، كما هو الحال في الخطوة 2، 1.
4-رصد تطور المرض
ملاحظة: سبب معاناة الحيوان، مختلف المؤشرات ينبغي استخدامها للإشارة عند الفئران أصبحت تحتضر؛ يجب أن يتم تنفيذ القتل الرحيم عقب هذا القرار، وفقا لبروتوكول إياكوك التي سبقت الموافقة عليها؛ وتشمل علامات مختلفة من موريبونديتي درجة حرارة الجسم وفقدان الوزن والمظهر، ومشية والمؤشرات الحيوية الأخرى التي يمكن الحصول عليها من الدم (مثلاً، عن طريق المعهد الوطني الإيطالي)9،10،،من1112، 13،14،،من1516.
- Euthanize الفئران وفقا لبروتوكول IACUC الموافق عليه من قبل (مثلاً، CO2 متبوعاً بخلع عنق الرحم).
- إزالة الرئتين من الماوس euthanized بقطع في القصبة الهوائية والشريان الرئوي والاوردة الرئوية القريبة من الرئتين.
- الفحص المجهري
- ضع الرئتين (أو جزء) في قالب نموذج.
- ملء القالب عينة مع مجمع درجة حرارة القطع الأمثل (O.C.T.)، غمر الأنسجة تماما.
- تجميد العينة في-80 درجة مئوية.
- إرسال العينة إلى مختبر علم أمراض الفرع وجبل على الشرائح للفحص المجهري.
- عبء البكتيرية
- وزن أنسجة الرئة على توازن التحليلي.
- نقل أنسجة الرئة إلى 50 مل فيال مخروطية الشكل الذي يحتوي على 2-5 مل PBS العقيمة (تبعاً لحجم الأنسجة).
- مجانسة أنسجة الرئة مع الخالطون أنسجة.
- إجراء تخفيف المسلسل هوموجيناتي في برنامج تلفزيوني العقيمة لتحقيق ما يقارب 1,000 كفوس مليلتر، استناداً إلى عبء البكتيرية المتوقعة في الرئتين.
- على سبيل المثال، إذا كان من المتوقع 1 × 109 مغ/كفوس، إجراء تخفيف 1: 100 ثلاثة: نقل 100 ميكروليتر من هوموجيناتي إلى 9.9 مل برنامج تلفزيوني ودوامه؛ وهذا هو أول تمييع 1: 100. نقل 100 ميكروليتر من تمييع 1: 100 الأولى إلى 9.9 مل برنامج تلفزيوني ودوامه؛ هذا هو تمييع 1: 100 ثانية. نقل 100 ميكروليتر من تمييع 1: 100 ثانية إلى 9.9 مل برنامج تلفزيوني ودوامه؛ هذا هو تمييع الثالثة والنهائية من 1: 100.
- إذا كان عبء بكتيرية في الرئتين غير معروف، تنفيذ مجموعة من تخفيف للقبض على النطاق المتوقع.
- لوحة dilution(s) في أجار العقيمة.
- إعداد العقيمة تريبتيك الصويا مرق (TSB) مع لوحات أجار (TSA): الجمع بين 30 غ TSB، ز 15 من أجار، و 1 لتر من الماء، يخلط محرض مغناطيسية، والحرارة حتى الغليان في ~ 100 درجة مئوية للحد الأدنى 5 السماح لتبرد وثم اﻷوتوكﻻف على دورة السائل للسماح لتبرد إلى 15 دقيقة ~ 55 درجة مئوية، ونقل 10 مل طازجة يعقم حساب السياحة الفرعي إلى أطباق بتري معقمة، والسماح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة. اسمحوا جافة في benchtop لمد 2-5 أو كشف إطار السلامة الأحيائية مجلس الوزراء لمدة 10 دقائق.
- نقل 100 ميكروليتر من التخفيف إلى طبق بتري يحتوي على حساب السياحة الفرعي العقيمة وتنتشر عبر حساب السياحة الفرعي استخدام خرز الناشرة أو الزجاج.
- تخزين طبق بيتري بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد (أي، حاضنة 37 درجة مئوية تتضمن الكأس 1-L كشفت مملوءة بالماء)
- تحديد هوموجيناتي الرئة كفوس مليلتر استناداً إلى تصفيح أجار (مثلاً، كفوس 100 لوحة السياحة مع 100 ميكروليتر من تمييع الثالثة والأخيرة المذكورة أعلاه سيكون 100 كفوس/100 ميكروليتر × 100ديل #1 × 100ديل #2 × 100ديل #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
- حساب أنسجة الرئة كفوس/mg يقوم بتقسيم هوموجيناتي الرئة كفوس مليلتر بملغ الرئة الأنسجة/مل هوموجيناتي (مثلاً، إذا كان استخدام النموذج الوارد وصفها أعلاه 100 مغ أنسجة الرئة تجانس في 5 مل من برنامج تلفزيوني، ثم 1 × 109 كفوس مليلتر ÷ 100 ملغ/5 مل = 5 × 107 CFUs/mg).
- الفحص المجهري
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعناية بعد على البروتوكول، استنساخه وقوية ويمكن بسهولة الحصول على البيانات. من المهم أن تلتزم إعداد بروتوكول لواحدة العدوى مخصصة للتجارب بالمقارنة إلى واحد كل منهما الآخر. كما أن من المهم معالجة الفئران بشكل صحيح أثناء إجراء العدوى. تأكد من وضع الفئران في دائرة لتخدير خالية من إيسوفلوراني. سوف الذعر إذا وضعت في غرفة التي كانت مليئة قبل isoflurane الفئران وقد تعاني من الإجهاد الزائد، الذي ربما يمكن أن تمس النتائج التجريبية. بعد تأمين غطاء حاوية، ببطء إدخال إيسوفلوراني بزيادة تركيزه من 0% إلى 4% (v/v)؛ إدارة عجل isoflurane يمكن أيضا أن يسبب الفئران للذعر. بمجرد الفئران أصبح فاقداً للوعي، خفض تركيز isoflurane إلى 2-3% (v/v) والسماح لهم بالبقاء في الدائرة لبضع دقائق إضافية. عند هذه النقطة، على استعداد لأن الفئران المصابة (الشكل 1).
إزالة ماوس من دائرة التخدير وتعليقه بأن القواطع العليا للسماح بالوصول إلى اللسان (الشكل 2). استخدام الملقط حادة انتهت بلطف سحب اللسان (الشكل 3) ثم نقل اللسان المعقود الملقط لأصابع عقيمة، والقفاز (الشكل 4) لمنع الصدمات للسان الماوس. مع اللسان خارج الفم، نقل العدوى 50 ميليلتر البلعوم (الشكل 5). هنا، من المهم جداً فقط تسليم السائل من بيبيتينج إلى المحطة الأولى في ميكروبيبيتي. الاستمرار في المحطة الثانية يمكن إدخال فقاعة كبيرة في العدوى الذي يتداخل مع العدوى.
بمجرد اكتمال العدوى، وهناك مجموعة متنوعة خيارات للتجارب الفئران. الدراسات المرضية، أحد يمكن أن يقارن وقاية الأنسجة المصابة (الشكل 6). إذا كان تحليل فعالية العلاجات الجديدة، يمكن للمرء إزالة الرئتين ولها مقطوع والملون. يمكن أن يتم ذلك عند نقطة مرة واحدة أو في نقاط زمنية متعددة لإظهار تطور المرض (الشكل 7).
ثمة خيار آخر لتقييم عبء البكتيرية في رئات الفئران المصابة. ويتم ذلك عن طريق إزالة الرئتين، نقل إلى قنينة تحتوي على كمية معروفة من PBS العقيمة، ثم المجانسة مع الخالطون أنسجة (الشطف بين كل عينة لمنع التلوث المتبادل). تصفيح تخفيف المسلسل من هوموجيناتي الرئة على الغنية بالمغذيات أجار يسمح لحساب كفوس مليلتر لكل هوموجيناتي الرئة وأنسجة الرئة كفوس/mg (الشكل 8) في وقت لاحق. وهذا أيضا يمكن أن يتم عند نقطة مرة واحدة أو في نقاط زمنية متعددة لإظهار تطور المرض.
وهناك عدد لا يحصى من الاختبارات الأخرى التي يمكن القيام بها، بما في ذلك التحليلات سيتوكين (الشكل 9)، الانتان المؤشرات الحيوية بالمعهد الوطني الإيطالي (الشكل 10)، التدفق الخلوي للتحقيق في علامات سطح الخلية، الخلوية التنميط، رناسيق، و ما إلى ذلك
الشكل 1 : تحديد LD100- من الضروري أن تصيب الفئران بتركيزات لقاح مختلف لتحديد100دينار. هنا، العدوى 2 × 108 كفوس/الماوس مرتفع جداً، 5 × 107 و 2 × 107 منخفضة جداً، و 1 × 108 مجرد حق.
الشكل 2 : شنق الفئران بالقواطع العليا. بعد أن تم تخديره من الفئران، إزالة ماوس واحدة من قاعة التوجيهي، (A) استخدام الملقط بسحب حلقة سلسلة تأمين 20-30 سم فوق سطح العمل، (ب) نقل السلسلة خلف القواطع الماوس لأعلى، (C) ضمان السلسلة يتم تأمين خلف القواطع العليا، و (د) تدع الماوس تشبث الحلقة السلسلة التي لها القواطع العليا.
الشكل 3 : سحب اللسان خارج الفم مع قبضة الملقط ونقل إلى أصابع القفاز. بعد تعليق الماوس من القواطع في الأعلى، (A) استخدام الملقط بلطف فهم اللسان للماوس، (ب) بلطف سحب اللسان، (ج) بعناية نقل اللسان من الملقط على أصابع القفاز لمنع الصدمات بالماوس اللسان، و (د) تعقد اللسان في مكان مع أصابع القفاز. تأكد من تطبيق ما يكفي من الضغط لمنع اللسان من الانزلاق مرة أخرى في الفم ولكن ليس ذلك الكثير من الضغوط أن الصدمة تستتبعه. ينبغي أن تعقد اللسان خارج العثة وإلى الجانب للسماح بالوصول ميكروبيبيتي في الخطوة التالية. عند هذه النقطة، الماوس على استعداد للعدوى.
الشكل 4 : تصيب الماوس. المحافظة على اللسان خارج الفم، استخدام ميكروبيبيتي لنقل العدوى 50 ميليلتر البلعوم. ضع طرف بيبيت داخل الفم في الجزء الخلفي من اللسان والاستغناء عن تعليق البكتيرية، لن يؤدي إلا إلى الأعلى الأولى في ميكروبيبيتي؛ لا تذهب إلى المحطة الثانية كهذا يمكن إدخال فقاعة كبيرة في العدوى التي يمكن أن تتداخل مع تطلع كاملة.
الشكل 5 : صورة مجهرية صحية مقابل (غير مصاب) إصابة أنسجة الرئة. توضع وتلطيخ ويوزين (H & E) من أقسام الرئة قبل وبعد المكنسية تطلع بوماني ألف، الذي يلخص مسار ذات الرئة المرتبطة بالتنفس الصناعي (برنامج عمل فيينتيان)، أسفر عن وفاة عادة خلال 1-3 أيام و السنخية كبير التهاب كما يتضح هنا.
الرقم 6 : تقييم عبء البكتيرية؛ وطبع وتعديلها مع إذن14 . بعد إصابة الفئران، إزالة الرئتين بتشريح عقب القتل الرحيم الناجح امتثالا للبروتوكول IACUC المنطبقة. جمع كتلة أنسجة الرئة، ونقل إلى قنينة تحتوي على وحدة تخزين معروفة (2-5 مل) من برنامج تلفزيوني العقيمة، ثم تجانسه مع الخالطون أنسجة. يجب التأكد من شطف الخالطون مع الإيثانول و PBS العقيمة بين كل عينة منع حدوث التلوث المنتقل. إجراء تخفيف المسلسل من هوموجيناتي الرئة ولوحة تخفيف مختلف في أجار الغنية بالمغذيات واحتضان مناسب لمسببات المرض الذي تم اختياره. حساب كفوس مليلتر لكل هوموجيناتي الرئة استناداً إلى تمييع × كفوس/لوحة ومن ثم القسمة على هوموجيناتي الرئة مليلتر أنسجة الرئة مغ. يمكن أن يتم ذلك عند نقطة مرة واحدة أو في نقاط زمنية متعددة لإظهار تطور المرض. يتم عرض الوساطات مع أشرطة الخطأ تمثل النطاقات المجال. ف < معاملة 0.05 مقابل المجموعة غير المعالجة.
الشكل 7 : صورة مجهرية لانسجة الرئة المصابة، دون علاج مقابل العلاج؛ وطبع وتعديلها مع إذن14 . بعد إصابة الفئران، إزالة الرئتين بتشريح عقب القتل الرحيم الناجح امتثالا للبروتوكول IACUC المنطبقة. مناسب الحفاظ على الأنسجة (مثل، منغمسين في "درجة الحرارة المثلى قطع" جل والمجمدة في-80 درجة مئوية) ثم ترسل إلى مختبر علم الأمراض أو فرد آخر يتقن لتمزيقها وتلطيخ. يمكن أن يتم ذلك عند نقطة مرة واحدة أو في نقاط زمنية متعددة لإظهار تطور المرض.
الشكل 8 : تحليل سيتوكين؛ طبع وتعديلها مع إذن14 . لتحليل السيتوكينات المتداولة، شراء الدم كافية (مثلاً، 50 ميليلتر عبر الذيل نيكينج)، والسماح يتجمد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، أجهزة الطرد المركزي في 1,000 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع المصل طافية. ثم يمكن تحليلها المصل قبل لوميناكس متعدد السيتوكينات. يمكن أن يتم ذلك عند نقطة مرة واحدة أو في نقاط زمنية متعددة لإظهار تطور المرض. يتم عرض الوساطات مع أشرطة الخطأ تمثل النطاقات المجال. ف < 0.05 المعالجة مقابل غير المعالجة المجموعة في نفس الوقت-نقطة.
الرقم 9 : المؤشرات الحيوية الانتان؛ إذن طبع ومعدلة مع14 . لتحليل المؤشرات الحيوية الانتان وشراء 75 ميليلتر الدم (مثلاً، عن طريق نيكينج الذيل) ونقل بسرعة إلى خرطوشة المعهد الوطني الإيطالي أن الاختبارات للمطلوب تحليلها. يمكن أن يتم ذلك عند نقطة مرة واحدة أو في نقاط زمنية متعددة لإظهار تطور المرض. يتم عرض الوساطات مع أشرطة الخطأ تمثل النطاقات المجال. ف < 0.05 المعالجة مقابل غير المعالجة المجموعة في نفس الوقت-نقطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بالتأكيد، أن الفئران ليست البشر مصغرة. ويجب النظر فيها في سياق النتائج التي تم الحصول عليها من نماذج الماوس وتفسيرها لاحقاً لانطباق للبشر، استناداً إلى أوجه الاختلاف والتشابه بين هذين النوعين6. من المهم أيضا أن اختيار السلالة المناسبة الماوس كمعينة تكون أكثر عرضه لبعض أنواع العدوى من الآخرين؛ وينطبق نفس الشيء سلالة الممرض من اختيار16.
من الضروري أن تؤدي العدوى بطريقة متشددة واستنساخه بدرجة عالية. لقاح يمكن أن يكون مميتاً للفئران في قيمة واحدة بعد غير ضارة حتى 90 في المائة من تلك القيمة. وبالتالي، من الضروري أن جميع الشروط المذكورة في هذا البروتوكول ترد في بالضبط نفس الطريقة، لا سيما عند إعداد العدوى وعند إصابة. بالإضافة إلى ذلك، كل الممرض سوف يتسبب المرض في العدوى فريدة من نوعها. ولذلك، من الضروري القيام بتجارب رائدة لتحديد العدوى المناسبة لكل سلالة من الكائنات الممرضة وفي كل سلالة من الماوس.
مع بكتيريا سلبية الغرام، العدوى دي فايف × 108 كفوس/الماوس كافية لإحداث الوفاة في سلالات ضراوة. ينصح بعدم استخدام السلالات التي غير قاتلة في دي وان × 109 كفوس/الماوس نظراً لأنها تشير إلى صلة المرضية استناداً إلى الكم الهائل من المواد التي يجري وضعها في الرئتين16مشكوك فيها.
مقارنة بالآخرين، هناك تعقيدات تقنية قليلة جداً لنموذج الالتهاب الرئوي المكنسية الطموح وإمكانية تكرار نتائج أكبر بكثير. مضاعفات ثانوية واحدة فقط من نتائج النموذج عندما يوضع التوتر السطحي حول العدوى 50 ميليلتر في البلعوم يسمح للتنفس الأنفي، النافية لتطلع سبب العدوى. وفي هذه الحالة، ببساطة معسر في الصورين مع الملقط يجبر تطلع انعكاسي عن طريق الفم واستنشاق اللاحقة من العدوى للحث على الالتهاب الرئوي المعدية. ومع ذلك، هذا خطأ فني بالفني، التي يتم تجنبها بسهولة مع الحد الأدنى من الممارسة.
من حيث أهميتها للأمراض البشرية، هو القيد واحد من هذا النموذج، مثل نماذج أخرى من العدوى البكتيرية الغرام، سرعة تطور المرض. ونادراً ما مصابون بالبشر بلعه كبيرة وقف البكتيرية، ولهذا السبب تقدم الفئران للمرض بسرعة. ومع ذلك، جميع العلاجات التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير الخضوع لهذه الفحوصات متعدية للبحث في نماذج حيوانية لتقييم إمكانياتها العلاجية قبل الانتقال إلى التجارب السريرية على البشر. ومن المفارقات أن سرعة الطراز أيضا ميزة جذابة، نظراً لأنها يمكن أن توفر الوضوح في الفعالية العلاجية ضمن فترة قصيرة من الوقت.
لا يوجد نموذج مورين الكمال، ولكن هذا نموذج مع القدرة على مضاهاة إخلاص مسار العدوى والمرضية للأمراض التي تصيب الإنسان وتقييم مدى فعالية العلاجات المحتملة، مما يسمح لترجمة رواية العلاج السريع التي تمس الحاجة إليها في العيادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وأيده هذا العمل بالمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية في المعاهد الوطنية للصحة [أرقام المنحة R01 AI117211، R01 AI130060 و R21 AI127954 و AI106375 R42 لدرجة البكالوريوس] ولنا الغذاء والدواء [العقد HHSF223201710199C إلى BML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
- Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
- Spellberg, B., Talbot, G. H. Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia. Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).
- Kalil, A. C., et al. Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).
- Medina, E.
- Azoulay-Dupuis, E., et al. In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J.
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiology. 15, 252 (2015).
- Trammell, R. A., Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research. Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).
- Bast, D. J., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Hankenson, F. C., et al. Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).
- Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model. Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).
- Nielsen, T. B., et al. Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE. mBio. 8 (4), (2017).
- Nielsen, T. B., et al. Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis. Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).
- Cheng, B. L., et al. Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection. Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).
- Wong, D., et al. Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
