Summary
感染性肺炎は人間の最も一般的な感染症の一つです。生体内で適切なモデルは、疾患病態の理解と治療の有効性をテストに不可欠です。このマウスの咽頭吸引性肺炎モデル病態とこれらの致命的な感染症に対する新しい治療法を調べることが 1 つ。
Abstract
マウス感染モデルは、病気の発症を理解し、原因となる病原体と戦うために設計された治療の有効性をテストのために重要です。伝染性肺炎はクリニックで患者によって提示される最も一般的な感染症の中で、したがって生体内で適切なモデルを保証します。典型的な肺炎モデルを使用して、ターゲットを合併症と副鼻腔炎、胃炎、腸炎、物理的な外傷または微粒子エアロゾルを模倣する噴霧などの症状を引き起こす肺の外の過剰な生物を預金鼻腔内接種ウイルスや結核性、真菌性肺炎のより典型的なスプレッド。これらのモデルは、コミュニティ- または医療取得の典型的な細菌性肺炎の病態を正確に反映しません。対照的に、この咽頭誤嚥性肺炎マウスモデルはヘルスケア市中肺炎における液滴ルートを模倣します。麻酔下のマウスの中咽頭に懸濁液 50 μ L の細菌を接種再帰誤嚥、肺炎の結果が発生します。このモデルでは、1 つは肺炎の原因となる病原体とこれらの病気と闘うための新しい治療法の病因を調べることができます。
Introduction
下部呼吸器感染症は世界最悪の伝染病および開発途上国1の死の最も一般的な原因です。世界的に、これらの感染症は以上 320 万の死1を占めています。さらに、院内肺炎医療取得感染の最も一般的な致命的な形態の間では、最も耐性病原体2,3によって引き起こされます。両方コミュニティ-取得肺炎および院内肺炎の買収の一般的なルートは、肺胞に咽頭内容の吸引です。多くの場合これらの病気を研究するために使用マウスのモデル鼻腔内接種4を使用オフのターゲット合併症と副鼻腔炎と物理的な外傷、病気と合同であるような症状を引き起こす肺の外の細菌の大部分を入金モデルだった人間の進行をエミュレートするように設計。他のモデルは、micromisting デバイスより正確に模倣するウイルス、結核性、および真菌性肺炎が、典型的な細菌性肺炎のための獲得の通常のルートを正確に要約できない吸入室を使用できます。
マウスの咽頭吸引性肺炎モデルは自然なルートと細菌性肺炎の病態をシミュレートするために利用されるかもしれない。接種した 50 μ L ピペットを使用して麻酔下のマウスの中咽頭に細菌懸濁液、によって伝染性肺炎の結果再帰吸引はすさまじい。このモデルを使用して、1 つは肺炎の原因となる病原体と人間にみられる誤嚥肺炎感染症に類似したより高い忠実度モデルこれらの疾病と戦うための新しい治療法の病態を調べることができます。さらに、口腔内5,6を介して感染する同様のモデルとは異なりこのモデルでは、完全菌それはオフサイトの炎症、感染症、胃炎などを引き起こすことができる腸ではなく肺に達すると腸炎。最後に、喉頭鏡を必要とし、気管7まで再接種別のパブリッシュされたモデルとは異なり、このモデルは強制経口投与針で気道を妨げない、接種配信の注射は必要ありません。代わりに、接種はマウスの自然吸引反射に依存しています。
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Protocol
動物を含むすべてのプロシージャは、研究員の制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認される必要があります。
1. 菌の準備
- 細菌のコロニーを分離します。
- 適切な滅菌寒天培地 (例えば、トリプシン大豆寒天)、上 (例えば、 A. baumannii "HUMC1") 菌株の連勝されて隔離されたコロニーを生成するように注意してください。
- 適切な条件 (例えば、37 ° C で一晩) で孵化させなさい。
- 一晩文化を育てます。
- 代表、寒天培地の滅菌接種ループから隔離されたコロニーを選択し、適切な滅菌流体培養基媒体 (例えば、トリプシン醤油スープ) 10 mL を接種します。
- 適切な条件 (例えば、ベント キャップ、50 mL コニカル バイアルで一晩 200 rpm で振とうしながら 37 ° C) で静止した段階に到達するサンプルを許可します。
- サブカルチャーを成長します。
- 一晩かけて培養の 100 μ L をピペットを使用して新鮮な滅菌液 10 mL に転送します。
- 適切な条件 (例えば、ベント キャップ、50 mL コニカル瓶で 3 h の 200 rpm で振とうしながら 37 ° C) で指数/ログ フェーズに到達することができます。
- サブカルチャーを洗います。
- サブカルチャーをインキュベーター環境から削除します。
- 細菌を餌に 5 分間、4,000 × g で遠心分離機します。
- 吸引し、上澄みを廃棄します。
- ペレットと完全に再停止されるまで精力的に渦に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を追加します。
- 3 洗浄の合計に対して手順 1.4.2 - 1.4.4 を 2 回、繰り返します。
- 細菌懸濁液の濃度を調整します。
- 600 の光学濃度を測定する分光光度計を用いた nm (外径600) 細菌懸濁液の光学密度を測定します。
- 滅菌 PBS 細菌懸濁液接種の光学密度低下 0.5、外径 φ600までを使用して追加、式 C私× V私=f× Vf濃度、"C"、"V"は、「私」のボリューム初期は、「f」は最終的な。* Cf常に 0.5;Vfは解決する変数です。
- 細菌懸濁液が 0.5 の OD600を下回った場合は、細菌を餌し、0.5 の OD600に到達する上清の適切な量を削除する 5 分間 4,000 × g で遠心分離機します。
- (例えば、1 × 10-6を達成するために 3 つの 1: 100 希釈) 滅菌 PBS のシリアル希薄を実行とコロニー形成細菌の濃度を明らかに相関係数を決定するための滅菌寒天プレート (CFUs/mL) あたりの単位0.5 の600を OD。
注: この相関係数の値それぞれの種ごとのひずみによってさまざまですが、感染の接種材料の準備の前に決定する必要があります。 - 相関係数を決定した後使用して接種目的濃度 (例えば、2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL);目的菌の OD600 0.5 より大きい場合は、細菌をペレットし、目的の濃度に到達する上清の適切な量を削除する 5 分間 4,000 × g で細菌懸濁液を遠心します。
- 生体内でこれらの値には同じ種の細菌分離株と異なる遺伝背景のマウスが異なります各系統マウスの各細菌分離株の病原性を判断するためのパイロット研究を実行します。様々 なグラム陰性菌種特定の菌株が低い接種で致命的なマウス LD100 1 5 × 108 CFUs/マウスでは一般に。
- (省略可能) 以前に公開された8として、オンデマンド、正確な接種として将来使用のため同じ因数を凍結します。
- 2 500 mL コニカル バイアル、4,000 × g で 5 分間遠心し、上記転送として菌の 1 L を準備します。
- 各円錐バイアルから上澄みの 450 mL を破棄し、残りの上清中の細菌のペレットを再懸濁します。
- 電磁攪拌棒を含む 250 mL のビーカーに集中して菌を転送し、継続的に 300 rpm で攪拌板の上にミックスします。
- 慎重に集中して菌を (例えば、1 × 1010 CFUs/mL) のまさに 600 μ L を転送滅菌 H2O の丁度 300 μ L と 300 を含む 1.6 mL セラムにピペットを使用して滅菌グリセリン; μ L混合し、-80 ° C で保存
注: ストレージに必要なグリセロールに実験結果を混同でき余分な死亡率を引き起こすので、洗い流す必要があります。 - 使用する準備ができたら、室温で 10 分間のサンプルを解凍します。
- 1 mL を 50 mL のコニカル バイアルに転送、細菌を餌に 5 分間、4,000 × g で 9 mL の滅菌 PBS と遠心分離機を追加します。上清を吸引し、感染接種目的濃度に到達する PBS の適切なボリュームで CFUs (1 mL × 冷凍ストック濃度 CFUs/mL) のあらかじめ決められた数量を再懸濁します。
2. マウスの麻酔
- ケタミン ・ キシラジン
注: ケタミン ・ キシラジンの併用麻酔は長い期間、新しいマウスを目覚めさせる前に接種手順を実行するこの方法では、研究者のための十分な時間を提供しています。- Pharmaceutifcal グレード、PBS 100 mg/mL ケタミン原液 1 mL 8.5 mL を組み合わせることにより注射液 10 mL を準備 (最終濃度 10 mg/mL)、および 20 mg/mL キシラジン原液 0.5 mL (最終濃度 10 mg/mL)。
- 腹腔内 (IP) 注入 (例えば25 g マウスの 250 μ L) による 10 μ L/g を管理します。
- 彼らの目は、長時間にわたって麻酔中の損傷になりやすいためケタミン ・ キシラジン麻酔マウスの目に眼軟膏を適用されます。
- ケージの中にマウスを置くし、麻酔から覚めるまで監視します。
注: 動物残さないように無人までそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。
- イソフルラン
注: マウスすばやくからウェイク アップ イソフルラン麻酔麻酔のこのメソッドは、接種手順の達人になる後のみ使用する必要がありますので誘導室から削除されました。- 適切なサイズの誘導の部屋に酸素が流れる素朴なマウスを配置します。
- 商工会議所はシャット ダウン シール、後麻酔精度の気化器を使用して少なくとも 5 分; 4% (v/v) イソフルランを追加するマウス誘導室からマウスを削除し、麻酔から覚める時間を測定して、麻酔を確認 (〜 60 s)。
注: は、制度のガイドラインに基づいて麻酔時間が異なる場合があり、いくつかの動物が 5 分以上になる完全に麻酔を必要があります注意してください。 - 2-3% にイソフルラン麻酔濃度を調整することで 10 分程度の麻酔を維持します。麻酔の合計期間が場合 > 15 分、麻酔下のマウスの目に眼軟膏を塗る。
- ケージの中にマウスを置くし、ステップ 2.1 のように、麻酔から覚めるまで監視します。
3. 接種/感染マウス
- 麻酔下のマウスを中断、約 2 回マウスのボディの長さ (例えば、20 cm) 営業の表面 (例えば上高さに固定オブジェクトにセキュリティで保護 (例えばデンタルフロス) 強い、薄い文字列にそのトップの切歯で掛かっています。、実験室ベンチ)。
- マウスの生殖不能、鈍終了鉗子を使用して口から舌をゆっくり引き抜きます。偶発的なマウスの舌の圧潰を防ぐために滅菌、手袋をはめた指に舌を転送します。口、咽頭へのアクセスを許可する側に接種の嚥下を防ぐ外舌を保持します。
- マウスの舌を押しながら; マイクロ ピペットを使用して咽頭に 50 μ L 接種 (細菌懸濁液) を配置します。中咽頭は、口腔内および咽頭口の後方の交差点に位置します。
注: のみ、マイクロ ピペットの最初のピット ストップにピペッティングして液体を提供する非常に重要です。マウスは接種を咽頭にある; に配置するとき、数秒間の呼吸を停止します。最終的には、再帰の誤嚥は、肺炎感染の結果、肺に入る液体の特徴的なパチパチ ノイズによって示される、細菌懸濁液を吸い込むには、マウスになります。 - 接種は遠くに配置されていない場合はバックアップ口と接種の後続の吸入を介して再帰吸引を強制的に鉗子で鼻孔をつまんで、通常呼吸をブロックするのに十分です。
- 接種後、舌をリリース、懸濁液文字列から、マウスを削除、ケージに配置ステップ 2.1 のように、麻酔から覚めるまで監視します。
4. 病気の進行の監視
メモ: 動物の苦しみ、ため様々 な指標は、使用マウスに瀕死の状態になることを示すため安楽死は、以前に承認された IACUC プロトコルに従って、この決定に従い実行されます必要があります。moribundity の様々 なマーカーは、体温、体重減少、外観、歩行、および血 (例えば、 istat コード経由)9,10、11,12から得られる他のバイオ マーカー 13,14,,1516。
- 以前に承認された IACUC プロトコル (例えばCO2頚部転位続いて) に従ってマウスを安楽死させます。
- 肺を安楽死させたマウスから気管、肺動脈、肺の近く肺静脈を切断することによって削除します。
- 顕微鏡
- 試験片金型で肺 (またはその一部) を配置します。
- 最適な切削温度 (O.C.T.) の化合物は、組織を完全に水没試験片金型を入力します。
- -80 ° C でサンプルを凍結します。
- セクションおよび顕微鏡検査のためのスライド マウントに病理学研究室にサンプルを送る。
- 細菌の負担
- 肺組織の分析用天秤で重量を量る。
- 50 mL コニカル バイアル 2 5 mL (組織のサイズ) に応じて滅菌 PBS の肺組織に転送します。
- 組織ホモジナイザーを用いた肺組織をホモジナイズしてください。
- 約 1,000 CFUs/mL、肺で予想される細菌負荷に基づいてを達成するために滅菌 PBS の磨砕液のシリアル希薄を実行します。
- たとえば、1 × 109 CFUs/mg が予想される場合は、3 1: 100 希釈を実行: 9.9 mL PBS と渦に磨砕液の転送 100 μ Lこれは、最初の 1: 100 希釈です。最初の 1: 100 希釈の 100 μ L を PBS と渦の 9.9 mL に転送します。これは、2 番目の 1: 100 希釈です。PBS の渦; 9.9 mL に 2 番目の 1: 100 希釈の 100 μ L を転送します。これは 3 番目と最後の 1: 100 希釈です。
- 肺の細菌の負荷が既知の場合は、予想の範囲をキャプチャする希釈の範囲を実行します。
- 滅菌の寒天プレート dilution(s)。
- 滅菌トリプシン大豆スープ (TSB) 寒天 (TSA) と準備: 結合 TSB の 30 g、寒天 15 g、1 L の水、磁気攪拌器、混ぜて、5 分クールなと液体のサイクル 15 分に冷却できるようにするために、オートクレーブをできるようにするための ~ 100 ° C で沸騰するまで加熱 〜55 ° C、転送 10 mL たてオートクレーブ滅菌シャーレ、TSA、部屋の温度に冷却すること。2-5 d または卓上乾燥やバイオ セーフティ キャビネット 10 分の下で発見できます。
- 滅菌 TSA を含むシャーレに 100 μ L の希釈を転送し、スプレッダやガラス ビーズを用いた TSA にまたがってください。
- 加湿のインキュベーター (すなわち水で満たされた発見の 1 L ビーカーを含む 37 ° C の定温器) で 37 ° C で一晩シャーレを格納します。
- 寒天めっきに基づく CFUs/mL 肺乳剤を決定 (例えば、TSA 板上を上記 3 番目と最後の希釈 100 μ 100 CFUs となります 100 CFUs/100 μ L × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109CFUs/mL)。
- Mg 肺組織/mL のホモジネート (例えば、上記サンプルを使用して 100 mg の PBS、1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg/5 mL = 5 × 107 5 mL で均質化された肺組織の場合による CFUs/mL 肺乳剤を割ることによって基づく CFUs/mg 肺組織を計算します。CFUs/mg)。
- 顕微鏡
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Representative Results
プロトコルに慎重に従うことによって、再現性と信頼性の高いデータを簡単に取得できます。1 互いに比較する実験のためのカスタマイズされた接種準備プロトコルを厳密に遵守するが重要です。また、感染中にマウスを適切に処理することが重要です。必ず欠いてイソフルラン麻酔室にマウスを配置してください。マウスは事前イソフルランで満たされている室に配置した場合はパニックし、実験結果を損なうことができます可能性が余分なストレスがあります。容器蓋を確保した後ゆっくりと 0% から 4% (v/v); その濃度を段階的に増加によるイソフルランを紹介します。急いでイソフルランの管理に、パニックにマウスもあります。マウスが無意識になると、2-3% (v/v) にイソフルラン麻酔濃度を削減し、追加数分の商工会議所で維持できるようにします。この時点で、マウスがする準備ができている (図 1) を感染しています。
麻酔室からマウスを外し、舌 (図 2) にアクセスできるようにその上門歯によって中断します。慎重に引き出します (図 3) 舌に使用鈍終了鉗子は滅菌の手袋をはめた指 (図 4) マウスの舌の外傷を防ぐために鉗子開催舌を転送します。まだ口の外の舌、咽頭 (図 5) に 50 μ L 接種を転送します。ここでは、のみマイクロ ピペットで最初のピット ストップにピペッティングにより液体を提供する非常に重要です。第 2 停止を続けて、感染を妨げる菌に大きなバブルが導入できます。
感染が完了すると、無数のマウスをテストするためのオプションがあります。病因学 1 つは比較することができます (図 6) の感染組織に感染します。治療の有効性を分析し場合、1 つ肺を削除してそれら断面し、ステンド グラスがあります。これは、1 つの時点でまたは病気の進行 (図 7) を表示する複数の時点で行うことができます。
別のオプションは、感染マウスの肺の細菌負荷を評価することです。これは、は (交差汚染を防ぐために各サンプル間洗浄) 組織ホモジナイザーを用いた均質化し、肺、滅菌 PBS の知られているボリュームを含むバイアルへの転送を削除することによって行われます。栄養豊富な寒天に肺ホモジネートのシリアル希薄をめっき CFUs/mL 各肺とその後 CFUs/mg 肺組織 (図 8) を計算できます。1 つの時点でまたは病気の進行を表示する複数の時点でこれは、あまりにも実行できます。
サイトカイン解析 (図 9)、istat コード (図 10)、フローサイトメトリー セル表面のマーカーを調べる携帯プロファイル、 RNAseq 等による敗血症バイオ マーカーなど、実行することができます他の無数の試金があります。
図 1: LD100を決定します。LD100を決定する接種濃度マウスに感染する必要は。ここでは、接種 2 × 108 CFUs/マウスが高すぎる、5 × 10 の7と 2 × 107が低すぎると 1 × 108がちょうどいい。
図 2: 上の前歯によってマウスがハングします。マウスを麻酔後誘導室から 1 つのマウスを削除 (A)鉗子を使用して作業面の上の 20-30 cm をセキュリティで保護された文字列のループを抽出 (B)マウスの上の前歯の後ろに文字列を移動 (C)文字列を確保します。上の前歯の後ろに保護されて、(D)文字列のループに、上の前歯がハングアップ マウスをしましょう。
図 3: 手袋をはめた指に鉗子と転送のグリップで口から舌を引っ張る。その上の前歯でマウスを切った後 (A)鉗子を使用して、マウスの舌をそっとつかみ、( B) (、舌をそっと引き出しますC)鉗子からマウスの外傷を防ぐために手袋をはめた指に舌を慎重に転送舌と (D)手袋をはめた指で舌を保持します。舌が口の中に滑りを防ぐために十分な圧力を適用する確認するが、多くはそのトラウマを圧力はそれほどすさまじい。蛾の外、次の手順でマイクロ ピペット アクセスを許可する側、舌を開催する必要があります。この時点で、マウスは感染症のため準備ができています。
図 4: マウスに感染します。口の外に舌を維持し、中咽頭に 50 μ L 接種を転送するのにピペットを使用します。舌の裏、口の中のピペット チップを置き、のみマイクロ ピペット; 最初先頭に起こって、細菌懸濁液を塗布完全な吸引に干渉できる接種材料を大きなバブルを導入することができます 2 番目のストップに行かない。
図 5: 健康 (感染していない) 対の光学顕微鏡像が肺組織を感染しています。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) は、 A. baumannii、通常 1 〜 3 日以内の死の結果として人工呼吸器関連肺炎 (VAP) のルートを繰り返すの咽頭吸引の前後に肺セクションの染色と実質的な肺胞炎症としてここに見られます。
図 6: 細菌負荷を評価; 再版され、変更アクセス許可14 .マウスを感染した後適用 IACUC プロトコルに準拠して成功した安楽死を施行した肺を削除します。肺組織の塊を収集、滅菌 PBS の知られているボリューム (2-5 mL) を含むバイアルに転送し、組織ホモジナイザーを用いた均質化します。エタノールと交差汚染を防ぐために各サンプル間に滅菌 PBS ホモジナイザーをすすぐこと。肺のシリアル希薄を実行し栄養豊富な寒天に様々 な希薄をプレートし、適切に選択された病原体間インキュベートします。CFUs/mL CFUs/プレート × 希釈に基づいて各肺乳剤を計算し、mg 肺組織/mL 肺ホモジネートによる分割します。これは、1 つの時点でまたは病気の進行を表示する複数の時点で行うことができます。中央分離帯は、四分位範囲を表す誤差範囲が表示されます。p < 0.05 処理と未処理のグループ。
図 7: 感染した肺組織の顕微鏡写真放置治療; 再版され、変更アクセス許可14対.マウスを感染した後適用 IACUC プロトコルに準拠して成功した安楽死を施行した肺を削除します。組織を適切に保持する(例えば、最適な切削温度のゲルに浸漬、-80 ° C で凍結)、切断および汚損の病理学研究室や他の熟練した個人に送信。これは、1 つの時点でまたは病気の進行を表示する複数の時点で行うことができます。
図 8: サイトカイン解析; 再版され、変更アクセス許可14 .循環サイトカインを分析するには、(例えば、尾刻み目をつける人経由で 50 μ L) の十分な血液を調達、1,000 × g で遠心する 4 ° C で 10 分間、室温で 30 分間凝固し、血清の上澄みを収集することができます。血清は、サイトカインのマルチプレックス Luminex によって分析できます。これは、1 つの時点でまたは病気の進行を表示する複数の時点で行うことができます。中央分離帯は、四分位範囲を表す誤差範囲が表示されます。p < 0.05 処理と同じ時点で未処理グループ。
図 9: 敗血症バイオ マーカー; 再版されるとで変更したアクセス許可14 .敗血症バイオ マーカーを分析し、(例えば、刻み目をつける人尾経由) 75 μ L の血液を調達し試験目的検体 istat コード カートリッジにすばやく転送します。これは、1 つの時点でまたは病気の進行を表示する複数の時点で行うことができます。中央分離帯は、四分位範囲を表す誤差範囲が表示されます。p < 0.05 処理と同じ時点で未処理グループ。
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Discussion
確かに、マウスは、ミニチュアの人間ではないです。マウス モデルから得られた結果をコンテキストでみなされておりその後の違いと 2 種6間の類似性に基づく人間への適用性の解釈する必要があります。それはまたとして適切なマウスの歪みを選択することが重要あるが他の人よりもいくつかの感染症の影響を受けやすい選択16の病原体の歪みも同様です。
厳格な再現性の高い方法で感染を行うために不可欠です。接種は、マウス 1 つの値ではまだその値の 90% も無害に致命的なことができます。したがって、特に接種の準備、感染するときは、正確な同じ方法でこのプロトコルに記載されているすべての条件を再現してが不可欠です。さらに、それぞれの病原体は、ユニークな菌で病気になります。したがって、マウスのそれぞれの株、病原体の各緊張に適切な接種を決定するためのパイロット実験を行うことが必要です。
グラム陰性菌、≤5 × 108 CFUs/マウスの菌は病原性菌株で死を引き起こすに十分です。肺16に配置されている材料の膨大な量に基づく病態に怪しげな関連性を示唆している彼らは、1 × 109 CFUs/マウスの致死性の菌株を使用しないことをお勧めします。
他の人と比較して、咽頭吸引性肺炎モデルの非常にいくつかの技術的な合併症があり、再現性ははるかに大きい。中咽頭に置かれた 50 μ L 接種周辺表面張力モデルの結果の 1 つだけマイナーな合併症は、鼻呼吸、誤嚥感染症の原因を除外できます。この場合、単に鉗子で鼻孔をつまんで感染肺炎を誘発する口と接種の後続の吸入を介して再帰吸引を強いる。しかし、これは最小限の練習で簡単に回避は技術者による技術的なエラーであります。
ひと疾患との関連性の面では、グラム陰性の細菌感染症の他のモデルのようなこのモデルの 1 つの制限は、病気の進行の速さです。人間は、ほとんど細菌懸濁液、なぜマウスは病気に急速に進行している大きな塊に感染しています。それにもかかわらず、FDA 承認のすべての治療は、ヒトでの臨床試験に移る前に彼らの治療の可能性を評価するための動物モデルのような橋渡し研究上映を受けます。皮肉にも、モデルの速さが魅力的な機能、また時間の短い期間内で治療効果の明快さを提供できるので。
モデルは完璧ではないが感染経路とひと疾患の病態を忠実にエミュレートし、により、新規治療法の急速な翻訳のための潜在的な治療法の有効性を評価する機能を持つモデル診療所で必死に必要な。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、国立研究所のアレルギーと感染症国立衛生研究 [許可番号 R01 AI117211、R01 AI130060、R21 AI127954、BS に R42 AI106375] と米国食品医薬品局 [契約によって支えられました。BML に HHSF223201710199C]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
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