Summary
Pneumonia infecciosa é entre as infecções mais comuns em humanos. Um modelo apropriado na vivo é fundamental para compreender a patogênese da doença e testar a eficácia da terapêutica de romance. Com este modelo de pneumonia de aspiração orofaríngea murino, um pode examinar a patogênese e novos tratamentos contra essas infecções mortais.
Abstract
Modelos de infecção murino são essenciais para compreender a patogênese da doença e testar a eficácia da terapêutica novela projetada para combater agentes patogénicos causadores. Pneumonia infecciosa está entre as infecções mais comuns apresentadas pelos pacientes na clínica e, portanto, garante um modelo apropriado na vivo . Pneumonia típica modelos usam inoculação intranasal, que deposita excessivos organismos fora do pulmão, causando complicações fora do alvo e sintomas, tais como sinusite, gastrite, enterite, trauma físico ou micropartículas de nebulização para imitar o aerossol Espalhe mais típico de pneumonia viral, fúngica ou tuberculosa. Estes modelos não refletem com precisão a patogênese da pneumonia bacteriana típica ou cuidados de saúde-adquirida na Comunidade. Em contraste, este modelo murino de pneumonia por aspiração orofaríngea imita a rota da gota em pneumonia adquirida na saúde. Suspensão em orofaringe de ratos anestesiados inocular 50 µ l das bactérias faz com que aspiração reflexiva, o que resulta em uma pneumonia. Com este modelo, pode-se examinar a patogênese de patógenos causadores de pneumonia e novos tratamentos para combater estas doenças.
Introduction
Infecção respiratória inferior é a mais mortal das doenças transmissíveis do mundo e a causa mais comum de morte nos países em desenvolvimento1. Globalmente, estas infecções são responsáveis por mais de 3,2 milhões de mortes1. Além disso, uma pneumonia nosocomial está entre as formas mais comuns e mortais de infecções adquiridas de saúde e é causada por patógenos mais resistentes aos antibióticos,2,3. A rota típica de aquisição da pneumonia bacteriana para ambos adquirida na Comunidade e pneumonia nosocomial é a aspiração do conteúdo da orofaringe em alvéolos. Murino modelos utilizados para estudar estas doenças frequentemente usam inoculação intranasal4, depositando muito das bactérias fora do pulmão, causando complicações fora do alvo e sintomas como sinusite e traumas físicos, que são incongruentes com a doença progressão em humanos que os modelos foram projetados para emular. Outros modelos podem usar câmaras de inalação e dispositivos de micromisting, que com mais precisão imitam pneumonias virais, tuberculosas e fúngicas, mas não com precisão recapitular a rota normal de aquisição para pneumonias bacterianas típicas.
O modelo de uma pneumonia de aspiração orofaríngea murino pode ser utilizado para simular a rota natural e patogênese da pneumonia bacteriana. Pela inoculando 50 µ l da suspensão bacteriana em orofaringe de ratos anestesiados com uma pipeta, aspiração reflexiva segue, o que resulta em uma pneumonia infecciosa. Usando este modelo, um pode examinar a patogênese de patógenos causadores de pneumonia e novos tratamentos para combater estas doenças com um modelo de fidelidade maior, mais semelhante a infecções de pneumonia de aspiração observadas em humanos. Além disso, ao contrário dos modelos semelhantes que infectam através da cavidade oral5,6, este modelo garante que o inóculo completo atinge os pulmões em vez do intestino, onde pode causar inflamação fora do local e infecções, como a gastrite e enterite. Finalmente, ao contrário de outro modelo publicado que requer um laringoscópio e inocula-se através da traqueia7, este modelo não obstrua as vias aéreas com uma agulha de gavagem e não exige a injeção para a entrega de inóculo. Em vez disso, inoculação depende o reflexo de aspiração natural do mouse.
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Protocol
Todos os procedimentos que envolvam animais devem ser aprovados do pesquisador institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC).
1. preparação do inóculo bacteriano
- Isole colônias bacterianas.
- Raia uma estirpe bacteriana (por exemplo, a. baumannii "HUMC1") em ágar-ágar estéril apropriado (por exemplo, ágar Tryptic soy), tendo o cuidado de gerar colónias isoladas.
- Incube a condições apropriadas (por exemplo, durante a noite a 37 ° C).
- Cresce a cultura durante a noite.
- Selecione um representante, colônia isolada da placa de ágar com um loop inoculando estéril e usá-lo para inocular 10 mL do meio de caldo estéril apropriado (por exemplo, caldo Tryptic soy).
- Permitir que a amostra chegar a fase estacionária em condições adequadas (por exemplo, 37 ° C, com agitação a 200 rpm durante a noite em um frasco cónico ventilado-cap, 50 mL).
- Cresce a subcultura.
- Transferi 100 μL da cultura durante a noite a 10 mL de caldo estéril fresco, usando uma pipeta.
- Permita alcançar a fase exponencial/log em condições adequadas (por exemplo, 37 ° C, com agitação a 200 rpm para 3h em um frasco cónico ventilado-cap, 50 mL).
- Lave a subcultura.
- Remova a subcultura do seu ambiente de incubação.
- Centrifugar a 4.000 × g por 5 min para as bactérias de Pelotas.
- Aspirar e desprezar o sobrenadante.
- Adicione 10 mL de salina tampão fosfato (PBS) para a pelota e vórtice vigorosamente até totalmente resuspended.
- Repita as etapas 1.4.2 - 1.4.4 duas vezes, para um total de 3 lavagens.
- Ajuste a concentração da suspensão bacteriana.
- Usando um espectrofotômetro que mede a densidade óptica em 600 nm (OD600), medir a densidade óptica da suspensão bacteriana.
- Adicionar PBS estéril à suspensão bacteriana até a densidade óptica do inóculo cai para uma OD600 de 0.5, usando a equação Ceu× Veu = Cf× Vf, onde "C" é a concentração, "V" é o volume, o "eu" é inicial, e "f" é final. * Cf sempre deve ser 0,5; Vf é a variável para resolver.
- Se a suspensão bacteriana cai abaixo de um OD600 de 0.5, centrifugá-lo a 4.000 × g por 5 min para as bactérias de pelotas e retirar uma quantidade apropriada de sobrenadante para alcançar uma OD600 de 0,5.
- Realizar diluições em série em PBS estéril (por exemplo, três diluições de 1: 100 para atingir 1 × 10-6) e placa no ágar estéril para determinar o coeficiente de correlação que revela a concentração bacteriana em formadoras unidades por mL (CFUs/mL) em um OD de600 de 0,5.
Nota: O valor do coeficiente de correlação deste irá variar para cada cepa de cada espécie e deve ser determinado antes da preparação do inóculo para a infecção. - Depois de determinar o coeficiente de correlação, usá-lo para criar um inóculo da concentração desejada (por exemplo, 2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL); Se o inóculo desejado for maior que o OD600 de 0.5, centrifugar a suspensão bacteriana 4.000 × g por 5 min para as bactérias de pelotas e retirar uma quantidade apropriada de sobrenadante para atingir a concentração desejada.
- Execute na vivo estudos-piloto para determinar a virulência de cada isolado bacteriano em cada cepa de rato como esses valores variam entre isolados bacterianos da mesma espécie e ratos de diferentes origens genéticas. Para várias espécies de bactérias Gram-negativas, o LD100 em camundongos é geralmente 1-5 × 108 CFUs/rato, embora certas estirpes são letais em inóculos inferiores.
- Congele as alíquotas idênticas para uso futuro como inóculos sob demanda, precisos, como publicado anteriormente8 (opcional).
- Prepare 1 L de inóculo bacteriano como descrita acima, transferência para dois frascos Erlenmeyer 500 mL e centrifugar 4.000 × g por 5 min.
- Descartar a 450 mL do sobrenadante de cada frasco de Erlenmeyer e ressuspender as pelotas de bactérias no sobrenadante restante.
- Transferir o inóculo bacteriano concentrado para um copo de 250 mL contendo uma barra de agitação magnética e misture continuamente em cima de um prato de agitar a 300 rpm.
- Transferir com cuidado, exatamente 600 μL de inóculo bacteriano concentrado (por exemplo, 1 × 1010 CFUs/mL) com uma pipeta para um frasco criogênico de 1,6 mL, contendo exatamente 300 μL de estéril H2O e 300 μL de glicerol estéril; mistura e loja a-80 ° C.
Nota: O glicerol necessário para armazenamento pode confundir os resultados experimentais e causar excesso de mortalidade, por isso é necessário lavá-lo. - Quando estiver pronto para uso, descongele a amostra durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Transferir 1 mL para um frasco de Erlenmeyer de 50 mL, adicionar 9 mL de PBS estéril e centrifugar a 4.000 × g por 5 min para as bactérias de Pelotas. Aspirar o sobrenadante e ressuspender a quantidade pré-determinada de CFUs (1 mL × congelado a concentração das ações em CFUs/mL) em um volume adequado de PBS para atingir a concentração desejada para o inóculo infeccioso.
2. anestesiar os ratos
- Xilazina/cetamina
Nota: A anestesia com cetamina/xilazina tem uma longa duração, que dispõe de tempo suficiente para o pesquisador, que é novo nesta técnica para concluir o procedimento de inoculação antes o mouse desperta.- Prepare-se 10 mL de solução injetável, combinando 8,5 mL de pharmaceutifcal série PBS, 1ml de 100mg/mL solução estoque de cetamina (concentração final 10 mg/mL) e 0,5 mL de 20 mg/mL solução estoque de xilazina (concentração final 10 mg/mL).
- Administre 10 μL/g por injeção intraperitoneal de (IP) (por exemplo, 250 μL para um rato de 25-g).
- Aplica a pomada oftálmica aos olhos dos ratos anestesiados com cetamina/xilazina, porque seus olhos estão danificados durante longos períodos de anestesia.
- Coloque o mouse em uma gaiola e monitorar até ele acorda da anestesia.
Nota: O animal não deve ser deixado sem supervisão até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
- Isoflurano
Nota: Os ratos rapidamente acordam da anestesia induzida por isoflurano após ser removido da câmara de indução, então este método de anestesia só deve ser usado depois de se tornar proficientes em procedimento de inoculação.- Coloque os ratos ingênuo em uma câmara de indução apropriadamente dimensionados com oxigênio fluindo.
- Depois que a câmara é vedada, anestesiar os ratos usando um vaporizador de precisão para adicionar isoflurano em 4% (v/v) pelo menos 5 min; confirmar a anestesia, removendo um rato da câmara de indução e medir o tempo que demora para acordar da anestesia (~ 60 s).
Nota: Esteja ciente de que anestesia vezes podem variar com base em diretrizes institucionais e alguns animais podem exigir mais de 5 min para tornar-se totalmente anestesiado. - Manter a anestesia por até 10 min. ajustando a concentração de isoflurano para 2-3%; se a duração total da anestesia é > 15 min, aplique pomada oftálmica nos olhos de ratos anestesiados.
- Coloque o mouse em uma gaiola e monitorar até ele acorda da anestesia, como no passo 2.1.
3. inocular/infectar ratos
- Suspender um rato anestesiado, pendurá-lo pelos seus incisivos superiores em uma corda forte, fina (por exemplo, fio dental) fixados a um objeto fixo a uma altura de aproximadamente duas vezes do mouse comprimento do corpo (por exemplo, 20 cm) acima da superfície de funcionamento (por exemplo bancada de laboratório).
- Suavemente puxe a língua do rato fora de sua boca utilizando pinça estéril, sem corte-terminado. Transferi a língua para um dedo estéril, com luvas para evitar o esmagamento acidental da língua do rato. Segure a língua fora da boca, permitindo o acesso à orofaringe e evitando a deglutição do inóculo para o lado.
- Enquanto segura a língua do rato, coloque o inóculo de 50 μL (suspensão bacteriana) na orofaringe utilizando uma micropipeta; a orofaringe está localizada na junção da cavidade oral e faringe em direção a parte traseira da boca.
Nota: É muito importante entregar apenas líquido pipetando para a primeira parada da micropipeta. O rato vai parar de respirar por alguns segundos quando o inóculo é colocado na orofaringe; eventualmente, aspiração reflexiva fará com que o mouse inalar a suspensão bacteriana, indicada pelo ruído crepitante distintivo do líquido entrar nos pulmões, o que resulta em infecção de uma pneumonia. - Se o inóculo não é colocado longe de volta suficiente para bloquear a respiração normal, beliscar as narinas com fórceps para forçar reflexiva aspiração através da boca e inalação subsequente do inóculo.
- Após a inoculação, solte a língua, remover o mouse da cadeia de suspensão, colocá-lo em uma gaiola e monitorar até ele acorda da anestesia, como no passo 2.1.
4. monitorar a progressão da doença
Nota: Devido ao sofrimento dos animais, vários indicadores devem ser usados para indicar quando os ratos se tornam moribundos; eutanásia deve ser realizada após esta determinação, em conformidade com um protocolo IACUC previamente aprovado; vários marcadores de moribundity incluem a temperatura corporal, perda de peso, aparência, da marcha e outros biomarcadores que podem ser obtidos a partir do sangue (por exemplo, através do iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.
- Eutanásia nos ratos, de acordo com protocolo previamente aprovado de IACUC (por exemplo, CO2 , seguido por deslocamento cervical).
- Remova os pulmões de eutanásia mouse cortando a traqueia, artéria pulmonar e veia pulmonar perto dos pulmões.
- Microscopia
- Coloque os pulmões (ou parte) em um molde do espécime.
- Encha o molde de amostra com temperatura de corte ideal (O.C.T.) composto, submergindo completamente o tecido.
- Congelar a amostra a-80 ° C.
- Envie a amostra para um laboratório de patologia de seção e montar em lâminas de microscopia.
- Carga bacteriana
- Pese o tecido pulmonar em uma balança analítica.
- Transferi o tecido pulmonar para frasco cónico de 50 mL contendo 2-5 mL de PBS estéril (dependendo do tamanho do tecido).
- Homogeneizar o tecido pulmonar com um homogeneizador.
- Realize diluições em série do homogeneizado em PBS estéril para atingir aproximadamente 1.000 CFUs/mL, com base na carga bacteriana esperada nos pulmões.
- Por exemplo, se 1 × 109 CFUs/mg é esperado, realizar três diluições de 1: 100: transferir 100 μL de homogeneizado a 9,9 mL de PBS e vortex; Esta é a primeira diluição 1: 100. Transferir 100 µ l da primeira diluição 1: 100 para 9,9 mL de PBS e vortex; Esta é a segunda diluição de 1: 100. Transferir 100 μL da segunda diluição de 1: 100 para 9,9 mL de PBS e vortex; Esta é a diluição de 1: 100 terceira e final.
- Se a carga bacteriana nos pulmões é desconhecida, execute uma série de diluições para capturar a escala prevista.
- Placa dilution(s) em ágar estéril.
- Prepare-se estéril Tryptic Soy caldo (TSB) com placas de agar (TSA): Combine 30 g de TSB, 15 g de ágar-ágar, 1 L de água, misturar com um agitador magnético e aqueça até ferver a ~ 100 ° C durante 5 min. deixe esfriar e então autoclave no ciclo líquido durante 15 min. permitir arrefecer à ~ 55 ° C, transferência 10ml recém autoclavado TSA para pratos de Petri estéril e deixar arrefecer à temperatura ambiente. Deixe secar na bancada para 2-5 d ou descobertos sob uma armário por 10 min de biossegurança.
- Transferir 100 µ l da diluição para uma placa de Petri contendo TSA estéril e espalharam TSA usando um difusor ou vidro grânulos.
- Armazenar o prato de Petri durante a noite a 37 ° C numa incubadora umidificado (ou seja, incubadora 37 ° C, contendo um copo 1-L descoberto, cheio de água)
- Determinar CFUs/mL pulmão homogenate baseado no chapeamento de ágar (por exemplo, 100 CFUs na placa TSA com 100 μL de terceira e última diluição descrita acima seria 100 CFUs/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
- Calcular o tecido de pulmão CFUs/mg baseado dividindo homogenate de pulmão CFUs/mL por mg pulmão homogeneizado de tecido/mL (por exemplo, se o exemplo descrito acima usado 100 mg de tecido pulmonar homogeneizado em 5 mL de PBS e, em seguida, 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 10-7 CFUs/mg).
- Microscopia
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Representative Results
Cuidadosamente, seguindo o protocolo, reproduzíveis e robustos de dados podem ser facilmente obtidos. É fundamental para aderir do inóculo personalizado preparação protocolo para experiências ser comparado com um outro. Também é importante tratar adequadamente os ratos durante o processo de infecção. Não se esqueça de colocar os ratos em uma câmara de anestesia desprovido de isoflurano. Os ratos entrará em pânico se eles são colocados em uma câmara que tenha sido previamente preenchida com isoflurano e podem experimentar o estresse em excesso, que possivelmente pode comprometer resultados experimentais. Depois de garantir a tampa do recipiente, introduzir lentamente isoflurano, incrementalmente, aumentando sua concentração de 0% a 4% (v/v); às pressas administração de isoflurano pode também causar ratos em pânico. Uma vez que os ratos ficam inconscientes, reduzir a concentração de isoflurano para 2-3% (v/v) e permitir-lhes permanecer na câmara por mais alguns minutos. Neste momento, os ratos estão prontos para ser infectado (Figura 1).
Remover um mouse da câmara de anestesia e suspendê-lo por seus incisivos superiores para permitir o acesso para a língua (Figura 2). Uso sem corte-terminado fórceps para gentilmente puxe para fora a língua (Figura 3) então transfere a língua fórceps-realizada para um estéril, com luvas dedos (Figura 4) para evitar trauma à língua do rato. Com a língua fora da boca, transferi o inóculo de 50 µ l para a orofaringe (Figura 5). Aqui, é muito importante entregar apenas líquido pipetando para a primeira parada da micropipeta. Continuando a segunda paragem pode introduzir uma bolha grande inóculo que interfere com a infecção.
Uma vez que a infecção é completa, há uma infinidade de opções para testes com ratos. Para estudos de patogênese, um pode comparar não infectados de tecido infectado (Figura 6). Se analisar a eficácia da terapêutica de romance, um pode remover os pulmões e os seccionados e corados. Isso pode ser feito em um ponto do tempo, ou em vários pontos de tempo para mostrar a progressão da doença (Figura 7).
Outra opção é avaliar a carga bacteriana nos pulmões de ratos infectados. Isto é feito através da remoção dos pulmões, transferir para um frasco contendo um volume conhecido de PBS estéril, homogeneizando então com um homogeneizador (enxaguar entre cada amostra para evitar contaminação cruzada). Chapeamento de diluições em série do pulmão homogeneizado em agar nutriente-rica permite calcular a CFUs/mL para cada pulmão homogeneizado e, posteriormente, tecido de pulmão CFUs/mg (Figura 8). Isso, também pode ser feito em um ponto do tempo, ou em vários pontos de tempo para mostrar a progressão da doença.
Existem inúmeros outros ensaios que podem ser executados, incluindo análises de citocina (Figura 9), biomarcadores de sepse pelo iSTAT (Figura 10), citometria de fluxo para investigar marcadores de superfície celular, celular, criação de perfil, RNAseq, etc.
Figura 1 : Determinação LD100. É necessário infectar camundongos com diferentes concentrações de inóculos para determinar o LD100. Aqui, o inóculo 2 × 108 CFUs/rato é muito alto, 5 × 107 e 2 × 107 são muito baixos e 1 × 108 é apenas para a direita.
Figura 2 : Hang ratos por incisivos superiores. Depois que os ratos são anestesiados, remover um rato da câmara de indução, (A) usar fórceps para retirar um laço de corda garantiu 20-30 cm acima da superfície de trabalho, (B) mover a sequência de caracteres para trás incisivos superiores do rato, (C) garantir a cadeia de caracteres é protegido por trás de incisivos superiores, e (D) deixe o mouse Segure pelos seus incisivos superiores do loop de sequência de caracteres.
Figura 3 : Puxar a língua da boca com o aperto fórceps e transferência para os dedos com a luva. Depois de pendurar o mouse pelos seus incisivos superiores, (A) usar fórceps para Segure cuidadosamente a língua do rato, (B) gentilmente puxe para fora a língua, ( C) transferir cuidadosamente a língua do fórceps para dedos com luvas para evitar trauma do rato língua, e (D) segurar a língua no lugar com os dedos com a luva. Certifique-se de aplicar pressão suficiente para impedir que a língua escorregar de volta para a boca, mas não tão muito pressão esse trauma ensues. A língua deve realizar-se fora a traça e para o lado para permitir o acesso de micropipeta na próxima etapa. Neste ponto, o mouse está pronto para a infecção.
Figura 4 : Infectar o mouse. Manter a língua fora da boca, use uma micropipeta para transferir o inóculo de 50 µ l para a orofaringe. Coloque a ponta da pipeta dentro da boca, na parte de trás da língua e dispense a suspensão bacteriana, só passa para o primeiro topo a micropipeta; Não vá para a segunda parada como isto pode introduzir uma bolha grande inóculo que possa interferir com aspiração completa.
Figura 5 : Micrografia de saudáveis (não infectados) vs infectado o tecido pulmonar. Hematoxilina e eosina (H & E) coloração de seções do pulmão antes e após a aspiração da orofaringe de a. baumannii, que recapitula a rota de pneumonia associada à ventilação mecânica (VAP), resultando em morte normalmente dentro de 1-3 dias e alveolar substancial inflamação como visto aqui.
Figura 6 : Avaliar a carga bacteriana; reproduzido e modificado com autorização14 . Após infectar camundongos, remova os pulmões por dissecação bem sucedida eutanásia em conformidade com o protocolo IACUC aplicável a seguir. Coletar a massa do tecido pulmonar, transferir para um frasco contendo um volume conhecido (2-5 mL) de PBS estéril e, em seguida, homogeneizar com um homogeneizador. Certifique-se de enxaguar o homogenizador com etanol e PBS estéril entre cada amostra para evitar a contaminação cruzada. Realizar diluições em série do homogenate pulmão e várias diluições em ágar nutriente-ricos da placa e incubar apropriadamente para o patógeno escolhido. Calcular a CFUs/mL para cada pulmão homogenate baseado na diluição de × CFUs/placa e depois dividir pelo mg pulmão tecido/mL pulmão homogeneizado. Isso pode ser feito em um ponto do tempo, ou em vários pontos de tempo para mostrar a progressão da doença. Medianas são exibidas com barras de erro representando faixas de percentis. p < 0.05 Tratado vs grupo não tratado.
Figura 7 : Micrografia de tecido pulmonar infectada, não tratada vs tratados; reproduzido e modificado com autorização14 . Após infectar camundongos, remova os pulmões por dissecação bem sucedida eutanásia em conformidade com o protocolo IACUC aplicável a seguir. Apropriadamente, preservar o tecido (por exemplo,, imerso em gel de temperatura de corte ideal e congelado a-80 ° C) em seguida enviar para o laboratório de patologia ou outro indivíduo proficiente para corte e coloração. Isso pode ser feito em um ponto do tempo, ou em vários pontos de tempo para mostrar a progressão da doença.
Figura 8 : Análise de citocinas; reproduzido e modificado com autorização14 . Para analisar a citocinas circulantes, obter sangue suficiente (por exemplo, 50 µ l através do corte de cauda), deixar coagular por 30 min à temperatura ambiente, centrifugar a 1.000 × g por 10 min a 4 ° C e coletar soro sobrenadante. O soro pode ser analisado por Luminex multiplex por citocinas. Isso pode ser feito em um ponto do tempo, ou em vários pontos de tempo para mostrar a progressão da doença. Medianas são exibidas com barras de erro representando faixas de percentis. p < 0.05 tratadas vs grupo não tratada ao mesmo tempo-ponto.
Figura 9 : Biomarcadores de sépsis; reimpresso e modificados com permissão14 . Para analisar os biomarcadores de sepse, adquirir 75 sangue µ l (por exemplo, através do corte de cauda) e transferir rapidamente a um cartucho do iSTAT que testa para analitos desejados. Isso pode ser feito em um ponto do tempo, ou em vários pontos de tempo para mostrar a progressão da doença. Medianas são exibidas com barras de erro representando faixas de percentis. p < 0.05 tratadas vs grupo não tratada ao mesmo tempo-ponto.
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Discussion
Para ter certeza, os ratos não são seres humanos em miniatura. Resultados obtidos em modelos do rato devem ser considerados no contexto e posteriormente interpretados para aplicabilidade aos seres humanos, com base em diferenças e semelhanças entre as duas espécies de6. Também é importante escolher a tensão apropriada do mouse como certos estão mais suscetíveis a algumas infecções do que outros; o mesmo se aplica para a cepa de patógeno de escolha16.
É essencial realizar infecções em uma maneira altamente reprodutível e exigente. Inóculos podem ser letais para ratos em um valor ainda inofensivo em até 90% desse valor. Assim, é imperativo que todas as condições enumeradas no presente protocolo são reproduzidas da mesma maneira, particularmente quando preparar o inóculo e infectar. Além disso, cada patógeno irá causar doença em um inóculo original. Portanto, é necessário realizar experimentos piloto para determinar o inóculo apropriado para todas as estirpes de patógeno e em cada cepa de rato.
Com bactérias Gram-negativas, um inóculo de ≤ 5 × 108 CFUs/rato é suficiente para causar a morte em cepas virulentas. É aconselhável não usar cepas que são não-letais no ≤ 1 × 109 CFUs/rato porque eles sugerem relevância duvidosa a patogênese baseada na grande quantidade de material a ser colocado para os pulmões,16.
Comparado aos outros, existem muito poucas complicações técnicas para o modelo de uma pneumonia de aspiração orofaríngea e reprodutibilidade é muito maior. Apenas uma pequena complicação dos resultados do modelo quando a tensão de superfície em torno do inóculo de 50 µ l colocado na orofaringe permite a respiração nasal, impedindo a aspiração, a causa da infecção. Neste caso, simplesmente apertar as narinas com fórceps obriga reflexiva aspiração através da boca e inalação subsequente do inóculo para induzir uma pneumonia infecciosa. Isto é, no entanto, um erro técnico pelo técnico, que é facilmente evitado com a prática mínima.
Em termos de sua relevância para doenças humanas, a uma limitação deste modelo, como outros modelos de infecções bacterianas Gram-negativas, é a rapidez da progressão da doença. Os seres humanos raramente são infectados com um grande bolo de uma suspensão bacteriana, é por isso que os ratos progridem para doença tão rapidamente. No entanto, todos os tratamentos aprovados pela FDA passam por tais seleções de pesquisa translacional em modelos animais para avaliar o seu potencial terapêutico antes de passar para os ensaios clínicos em seres humanos. Ironicamente, a rapidez do modelo também é uma característica atraente, uma vez que ele pode fornecer clareza na eficácia terapêutica, dentro de um breve período de tempo.
Nenhum modelo murino é perfeito, mas este é um modelo com a capacidade de emular fielmente a rota de infecção e patogênese de doenças humanas e avaliar a eficácia da terapêutica potencial, permitindo assim que para a tradução rápida de novas terapias que são desesperadamente necessários na clínica.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas no National Institutes of Health [Grant número R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 e R42 AI106375 BS] e Food and Drug Administration [contrato HHSF223201710199C a BML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
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