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Medicine

Murine Oropharyngeal आकांक्षा मॉडल वेंटीलेटर-एसोसिएटेड और अस्पताल के अधिग्रहण बैक्टीरियल निमोनिया

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/57672
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, LAC+USC Medical Center

Summary

संक्रामक निमोनिया मानव में सबसे आम संक्रमण के बीच है । vivo मॉडल में एक उपयुक्त रोग रोगजनन को समझने और उपंयास चिकित्सकीय की प्रभावकारिता के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण है । इस murine oropharyngeal आकांक्षा निमोनिया मॉडल के साथ, एक इन घातक संक्रमण के खिलाफ रोगजनन और नए उपचार की जांच कर सकते हैं ।

Abstract

Murine संक्रमण मॉडल रोग रोगजनन को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं और करणीय रोगजनकों का मुकाबला करने के लिए डिज़ाइन किए गए उपंयास चिकित्सकीय की प्रभावकारिता का परीक्षण । संक्रामक निमोनिया सबसे आम क्लिनिक में रोगियों द्वारा प्रस्तुत संक्रमण के बीच है और इस तरह vivo मॉडल में एक उपयुक्त वारंट । ठेठ निमोनिया मॉडल intranasal टीका, जो फेफड़ों के बाहर अत्यधिक जीवों जमा का उपयोग करें, बंद लक्ष्य जटिलताओं और लक्षण, जैसे साइनसाइटिस, gastritis, आंत्रशोथ, शारीरिक आघात, या एयरोसोल की नकल करने के लिए microparticle धुंध के कारण वायरल, तपेदिक, या कवक निमोनिया की अधिक विशिष्ट फैला । इन मॉडलों को सही ढंग से विशिष्ट समुदाय के रोगजनन-या स्वास्थ्य देखभाल प्राप्त बैक्टीरियल निमोनिया को प्रतिबिंबित नहीं है । इसके विपरीत, oropharyngeal आकांक्षा निमोनिया के इस murine मॉडल हेल्थकेयर-उपार्जित निमोनिया में छोटी बूंद मार्ग की नकल । anesthetized चूहों के oropharynx में बैक्टीरिया सस्पेंशन के Inoculating ५० µ एल की सजगता आकांक्षा का कारण बनता है, जो निमोनिया में परिणाम है । इस मॉडल के साथ, एक निमोनिया के रोगजनन की जांच कर सकते हैं-रोगजनकों और नए उपचार के कारण इन रोगों का मुकाबला करने के लिए ।

Introduction

लोअर श्वसन संक्रमण दुनिया के घातक संचारी रोग और विकासशील देशों में मौत का सबसे आम कारण है1. विश्व स्तर पर, इन संक्रमणों से अधिक ३,२००,००० मौतें1के लिए खाते । इसके अलावा, nosocomial निमोनिया स्वास्थ्य देखभाल के अधिग्रहण के सबसे आम और घातक रूपों में से एक है, और सबसे एंटीबायोटिक प्रतिरोधी रोगजनकों2,3के कारण होता है । दोनों समुदाय-अधिग्रहीत और nosocomial निमोनिया के लिए बैक्टीरियल निमोनिया के अधिग्रहण का विशिष्ट मार्ग alveoli में oropharyngeal सामग्री की आकांक्षा है । इन रोगों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया Murine मॉडल अक्सर intranasal टीका4का उपयोग करें, फेफड़ों के बाहर बैक्टीरिया के बहुत जमा, बंद लक्ष्य जटिलताओं और साइनसाइटिस और शारीरिक आघात है, जो रोग के साथ incongruent रहे हैं जैसे लक्षण के कारण मानव में प्रगति है कि मॉडल का अनुकरण करने के लिए डिजाइन किए गए थे । अंय मॉडलों सांस लेना कक्षों और micromisting उपकरणों, जो और अधिक सही वायरल, तपेदिक, और कवक निमोनिया नकल का उपयोग कर सकते हैं, लेकिन ठेठ बैक्टीरियल निमोनिया के लिए अधिग्रहण के सामांय मार्ग दोहराऊंगा सही नहीं है ।

murine oropharyngeal आकांक्षा निमोनिया मॉडल प्राकृतिक मार्ग और बैक्टीरियल निमोनिया के रोगजनन अनुकरण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । द्वारा inoculating ५० µ एल बैक्टीरियल सस्पेंशन के oropharynx में anesthetized चूहों का उपयोग कर एक पिपेट, सजगता आकांक्षा मग्न, जो संक्रामक निमोनिया में परिणाम. इस मॉडल का उपयोग कर, एक निमोनिया के रोगजनन की जांच कर सकते हैं-रोगजनकों और नए उपचार एक उच्च निष्ठा मॉडल के साथ इन रोगों का मुकाबला करने के लिए, अधिक आकांक्षा निमोनिया संक्रमण के अनुरूप मानव में मनाया. इसके अतिरिक्त, मौखिक गुहा5,6के माध्यम से संक्रमित समान मॉडल है कि इस मॉडल के विपरीत, यह सुनिश्चित करता है कि पूर्ण इनोक्युलम फेफड़ों के बजाय आंत तक पहुंचता है, जहां यह बंद का कारण हो सकता है साइट सूजन और संक्रमण, gastritis के रूप में और आंत्रशोथ । अंत में, एक और प्रकाशित मॉडल है कि श्वासनली7के माध्यम से एक laryngoscope और inoculates की आवश्यकता के विपरीत, इस मॉडल एक airway सुई के साथ gavage बाधा नहीं है और इनोक्युलम प्रसव के लिए इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है । इसके बजाय, टीका माउस के प्राकृतिक आकांक्षा पलटा पर निर्भर करता है ।

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Protocol

सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं शोधकर्ता संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए ।

1. बैक्टीरियल इनोक्युलम की तैयारी

  1. बैक्टीरियल कालोनियों को अलग करना ।
    1. लकीर एक जीवाणु तनाव (जैसे, एक. baumannii "HUMC1") उपयुक्त बाँझ आगर मध्यम पर (जैसे, Tryptic सोया आगार), पृथक कॉलोनियों उत्पन्न करने के लिए सावधान किया जा रहा.
    2. उपयुक्त परिस्थितियों में मशीन (जैसे, ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर) ।
  2. रातोंरात संस्कृति हो जाना ।
    1. एक प्रतिनिधि, एक बाँझ inoculating पाश के साथ आगर प्लेट से पृथक कॉलोनी का चयन करें और यह उचित बाँझ शोरबा मध्यम (जैसे, Tryptic सोया शोरबा) के 10 मिलीलीटर inoculate करने के लिए उपयोग करें ।
    2. नमूना उचित शर्तों पर स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए अनुमति दें (उदाहरणके लिए, ३७ ° c एक वेंट-कैप, ५० एमएल शंकु शीशी में रातोंरात २०० rpm पर मिलाना के साथ) ।
  3. उपसंस्कृति बढे ।
    1. स्थानांतरण १०० ताजा बाँझ शोरबा के 10 मिलीलीटर एक पिपेट का उपयोग कर रातोंरात संस्कृति के μL ।
    2. एक वेंट-कैप, ५० एमएल शंकु शीशी में 3 ज के लिए २०० rpm पर मिलाते हुए के साथ उचित परिस्थितियों (जैसे, ३७ ° c पर) को घातांक तक पहुंचने की अनुमति दें ।
  4. उपसंस्कृति को धो डालें ।
    1. उपसंस्कृति को अपनी मशीनी वातावरण से निकालें ।
    2. 5 मिनट के लिए ४,००० × जी में केंद्रापसारक जीवाणु गोली ।
    3. supernatant को महाप्राण और त्यागें ।
    4. पूरी तरह से reसस्पैंड जब तक तेजी से गोली और भंवर को बाँझ फॉस्फेट-खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. दोहराएं चरण 1.4.2-1.4.4 दो बार, कुल 3 बहाकर के लिए ।
  5. बैक्टीरियल सस्पेंशन की एकाग्रता को समायोजित करें ।
    1. एक spectrophotometer का उपयोग करना है कि ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) में ऑप्टिकल घनत्व उपाय, बैक्टीरियल निलंबन के ऑप्टिकल घनत्व को मापने ।
    2. इनोक्युलम की ऑप्टिकल घनत्व तक जीवाणु निलंबन के लिए बाँझ पंजाबियों जोड़ें ०.५ के एक आयुध डिपो६०० करने के लिए, समीकरण सीमैं× vi = cf× vf, का उपयोग कर जहां "c" एकाग्रता है, "V" मात्रा है, "मैं" प्रारंभिक है, और "f" अंतिम है । * Cf हमेशा ०.५ होना चाहिए; वीf को हल करने क चर है ।
    3. अगर बैक्टीरियल सस्पेंशन ०.५ के एक आयुध डिपो६०० के नीचे चला जाता है, यह 5 मिनट के लिए ४,००० × जी में जीवाणु गोली और supernatant की एक उचित मात्रा को हटाने के लिए ०.५ के एक आयुध डिपो६०० तक पहुंचने ।
    4. बाँझ पंजाबियों में धारावाहिक कमजोरियां प्रदर्शन (जैसे, तीन 1:100 कमजोर पड़ने 1 × 10-6हासिल करने के लिए) और प्लेट बाँझ आगर पर कॉलोनी में बैक्टीरियल एकाग्रता का पता चलता है कि संबंध गुणांक का निर्धारण करने के लिए प्रति मिलीलीटर बनाने इकाइयों (CFUs/ ०.५ के एक आयुध डिपो६०० पर ।
      नोट: इस सहसंबंध गुणांक का मान प्रत्येक प्रजाति के प्रत्येक तनाव के लिए अलग-अलग होगा और संक्रमण के लिए इनोक्युलम तैयारी करने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए ।
    5. सहसंबंध गुणांक का निर्धारण करने के बाद, यह वांछित एकाग्रता (जैसे, 2 × 108-1 × 109 CFUs/एमएल) के एक इनोक्युलम बनाने के लिए उपयोग करें; यदि वांछित इनोक्युलम ०.५ के आयुध डिपो६०० से अधिक है, ४,००० × जी में जीवाणु निलंबन के लिए 5 मिनट के लिए जीवाणु गोली और supernatant की एक उपयुक्त राशि निकालने के लिए वांछित एकाग्रता तक पहुंचने ।
    6. vivo पायलट अध्ययनों में प्रदर्शन माउस के प्रत्येक तनाव में अलग करने के लिए प्रत्येक जीवाणु के डाह का निर्धारण करने के रूप में इन मूल्यों बैक्टीरिया अलग एक ही प्रजाति और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों के बीच भिन्न होगा. विभिंन ग्राम-नकारात्मक प्रजातियों के लिए, LD चूहों में१०० आम तौर पर 1-5 × 108 CFUs/माउस है, हालांकि कुछ उपभेदों कम inocula पर घातक हैं ।
  6. ऑन-डिमांड, सटीक inocula के रूप में भविष्य के उपयोग के लिए समान aliquots फ़्रीज़ करें, जैसा कि पहले8 प्रकाशित किया गया है (वैकल्पिक).
    1. ऊपर वर्णित के रूप में बैक्टीरियल इनोक्युलम के 1 एल तैयार, २ ५०० मिलीलीटर शंकु शीशियों के लिए स्थानांतरण, और 5 मिनट के लिए ४,००० × जी पर केंद्रापसारक ।
    2. प्रत्येक शंकु शीशी से supernatant के ४५० मिलीलीटर त्यागें और शेष supernatant में बैक्टीरिया की छर्रों reसस्पेंड ।
    3. एक २५० मिलीलीटर एक चुंबकीय हलचल पट्टी और लगातार ३०० rpm पर एक हलचल थाली के शीर्ष पर मिश्रण युक्त चोंच के लिए केंद्रित बैक्टीरियल इनोक्युलम हस्तांतरण ।
    4. ध्यान केंद्रित बैक्टीरियल इनोक्युलम के ठीक ६०० μL स्थानांतरण (उदाहरणके लिए, 1 × 10 CFUs/एमएल) एक पिपेट का उपयोग कर एक १.६-एमएल क्रायोजेनिक शीशी से युक्त बिल्कुल ३०० μL बाँझ की एच2ओ और ३०० बाँझ μL की ग्लिसरॉल; मिक्स और पर स्टोर-८० ° c ।
      नोट: ग्लिसरॉल भंडारण के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक परिणाम मिल सकता है और अधिक मृत्यु का कारण तो यह इसे बाहर धोने के लिए आवश्यक है ।
    5. जब उपयोग के लिए तैयार है, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूने गल ।
    6. एक ५०-एमएल शंकु शीशी के लिए 1 मिलीलीटर स्थानांतरण, बाँझ पंजाबियों के 9 मिलीलीटर जोड़ें, और 5 मिनट के लिए ४,००० × जी पर केंद्रापसारक जीवाणु गोली करने के लिए । महाप्राण supernatant और CFUs की पूर्व निर्धारित मात्रा (CFUs में 1 मिलीलीटर × जमे हुए शेयर एकाग्रता/पंजाब के एक उचित मात्रा में) संक्रामक इनोक्युलम के लिए वांछित एकाग्रता तक पहुंचने के लिए reसस्पैंड ।

2. Anesthetizing चूहों

  1. Ketamine/Xylazine
    नोट: ketamine/xylazine के साथ संज्ञाहरण एक लंबी अवधि है, जो शोधकर्ता जो इस तकनीक पर नया है के लिए पर्याप्त समय प्रदान करता है टीका प्रक्रिया को पूरा करने से पहले माउस जागता है ।
    1. pharmaceutifcal ग्रेड पंजाबियों के ८.५ मिलीलीटर के संयोजन से इंजेक्शन समाधान के 10 मिलीलीटर तैयार, १०० मिलीग्राम/एमएल Ketamine स्टॉक समाधान (अंतिम एकाग्रता 10 मिलीग्राम/एमएल), और ०.५ मिलीलीटर 20 मिलीग्राम/एमएल Xylazine स्टॉक समाधान (अंतिम एकाग्रता 10 मिलीग्राम/एमएल) की 1 मिलीलीटर ।
    2. 10 μL/g द्वारा intraperitoneal (IP) इंजेक्शन (उदा., 25-g माउस के लिए २५० μL) ।
    3. Ketamine/Xylazine के साथ anesthetized चूहों की आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू करें क्योंकि उनकी आंखों संज्ञाहरण की विस्तारित अवधि के दौरान नुकसान होने का खतरा है ।
    4. एक पिंजरे में माउस प्लेस और निगरानी जब तक यह संज्ञाहरण से जाग ।
      नोट: पशु उपेक्षित छोड़ दिया जब तक यह पर्याप्त चेतना को कड़ी recumbency बनाए रखने के लिए आ गया है नहीं होना चाहिए ।
  2. Isoflurane
    नोट: चूहों जल्दी isoflurane से प्रेरित संज्ञाहरण के बाद प्रेरण कक्ष से हटा दिया जा रहा है, तो संज्ञाहरण के इस विधि केवल टीका प्रक्रिया में कुशल बनने के बाद इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    1. ऑक्सीजन बहने के साथ एक उचित आकार प्रेरण चैंबर में भोले चूहों प्लेस ।
    2. चैंबर बंद सील है के बाद, anesthetize एक परिशुद्धता vaporizer का उपयोग करने के लिए 4% पर isoflurane जोड़ने के लिए (v/ प्रेरण कक्ष से एक माउस को हटाने और कितनी देर तक यह संज्ञाहरण से जाग लेता है मापने के द्वारा संज्ञाहरण की पुष्टि करें (~ ६० s) ।
      नोट: संज्ञाहरण बार संस्थागत दिशा निर्देशों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं कि ध्यान रखें और कुछ जानवरों पूरी तरह से anesthetized बनने के लिए अधिक से अधिक 5 मिनट की आवश्यकता हो सकती है.
    3. 2-3% करने के लिए isoflurane एकाग्रता का समायोजन करके 10 मिनट के लिए संज्ञाहरण को बनाए रखने; संज्ञाहरण की कुल अवधि है > 15 मिनट, anesthetized चूहों की आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू होते हैं ।
    4. एक पिंजरे में माउस प्लेस और निगरानी जब तक यह संज्ञाहरण से जाग, चरण २.१ में के रूप में ।

3. Inoculating/चूहों को संक्रमित करना

  1. एक anesthetized माउस को निलंबित, एक मजबूत, पतली स्ट्रिंग (जैसे, दंत सोता) पर अपने शीर्ष कृन्तक द्वारा यह लटक लगभग दो बार एक ऊंचाई पर एक निश्चित वस्तु के लिए सुरक्षित है माउस शरीर की लंबाई (जैसे, 20 सेमी) ऑपरेटिंग सतह के ऊपर (उदा , प्रयोगशाला पीठ) ।
  2. धीरे से अपने मुंह से बाहर है माउस जीभ खींच बाँझ का उपयोग कर, कुंद-संदंश समाप्त हो गया । एक बाँझ, दस्ताने उंगली करने के लिए माउस की जीभ के आकस्मिक कुचलने को रोकने के लिए जीभ स्थानांतरण । मुंह के बाहर जीभ पकड़ो, oropharynx के लिए उपयोग की अनुमति और पक्ष को इनोक्युलम के निगलने को रोकने ।
  3. जबकि माउस की जीभ पकड़, एक micropipette का उपयोग कर oropharynx में ५०-μL इनोक्युलम (बैक्टीरियल सस्पेंशन) जगह; oropharynx मुंह के पीछे की ओर मौखिक गुहा और ग्रसनी के जंक्शन पर स्थित है ।
    नोट: यह बहुत ही micropipette पर पहले बंद करने के लिए pipetting द्वारा तरल उद्धार महत्वपूर्ण है । माउस इनोक्युलम oropharynx में रखा जाता है जब कुछ सेकंड के लिए साँस लेना बंद हो जाएगा; अंततः, सजगता आकांक्षा माउस जीवाणु निलंबन, तरल फेफड़ों, जो निमोनिया संक्रमण में परिणाम में प्रवेश के विशिष्ट खड़खड़ाते शोर द्वारा संकेत श्वास करने के लिए कारण होगा ।
  4. यदि इनोक्युलम अभी तक वापस पर्याप्त सामांय श्वसन ब्लॉक नहीं रखा है, संदंश के साथ नरेस चुटकी को मुंह और इनोक्युलम के बाद सांस लेना के माध्यम से सजगता आकांक्षा बल ।
  5. टीका के बाद, जीभ रिहाई, निलंबन स्ट्रिंग से माउस को हटाने, यह एक पिंजरे में जगह है, और निगरानी जब तक यह संज्ञाहरण से जाग, चरण २.१ में के रूप में ।

4. निगरानी रोग प्रगति

नोट: पशु पीड़ित होने के कारण, चूहों के मरणासन्न हो जाने पर विभिन्न संकेतकों का प्रयोग किया जाना चाहिए; इच्छामृत्यु पहले अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार, इस दृढ़ संकल्प के बाद किया जाना चाहिए; moribundity के विभिंन मार्करों शरीर का तापमान, वजन घटाने, उपस्थिति, चाल, और अंय जो रक्त से प्राप्त किया जा सकता है कि मार्क्स शामिल (जैसे, iSTAT के माध्यम से)9,10,11,12, 13,14,15,16.

  1. पहले अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों को Euthanize (जैसे, सह गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन के बाद2 ) ।
  2. फेफड़ों के लिए बंद श्वासनली, फेफड़े की धमनी, और फेफड़े की नस काटने के द्वारा euthanized माउस से फेफड़े निकालें ।
    1. माइक्रोस्कोपी
      1. एक नमूना मोल्ड में फेफड़ों (या भाग) प्लेस ।
      2. इष्टतम काटने तापमान (O.C.T.) यौगिक, पूरी तरह से ऊतक को विलय के साथ नमूना मोल्ड भरें ।
      3. -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज ।
      4. अनुभाग के लिए एक पैथोलॉजी लैब के लिए नमूना भेजें और माइक्रोस्कोपी के लिए स्लाइड पर माउंट.
    2. बैक्टीरियल बोझ
      1. एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर फेफड़ों के ऊतकों तौलना ।
      2. ५०-एमएल शंकु शीशी बाँझ पंजाबियों की 2-5 मिलीलीटर युक्त करने के लिए फेफड़ों के ऊतकों स्थानांतरण (ऊतक के आकार पर निर्भर करता है) ।
      3. एक ऊतक homogenizer के साथ फेफड़ों के ऊतकों Homogenize ।
      4. फेफड़ों में बैक्टीरियल बोझ की उम्मीद के आधार पर लगभग १,००० CFUs/एमएल प्राप्त करने के लिए बाँझ पंजाब में homogenate के धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन ।
        1. उदाहरण के लिए, यदि 1 × 109 CFUs/mg अपेक्षित है, तो तीन 1:100 कमजोरियां निष्पादित करें: homogenate के १०० μL का स्थानांतरण पंजाब और भंवर के ९.९ मिलीलीटर के लिए; यह पहला 1:100 कमजोर पड़ने वाला है । १०० μL पहले 1:100 के कमजोर पड़ने का स्थानांतरण पंजाब और भंवर के ९.९ मिलीलीटर के लिए; यह दूसरा 1:100 कमजोर पड़ने वाला है । पंजाब और भंवर के ९.९ मिलीलीटर के लिए दूसरा 1:100 कमजोर पड़ने के १०० μL स्थानांतरण; यह तीसरा और अंतिम 1:100 कमजोर पड़ने वाला है ।
        2. यदि फेफड़ों में बैक्टीरियल बोझ अज्ञात है, कमजोर पड़ने की एक सीमा प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षित सीमा पर कब्जा ।
      5. प्लेट कमजोर पड़ने (ओं) पर बाँझ आगर.
        1. आगर (TSA) प्लेटों के साथ बाँझ Tryptic सोया शोरबा (TSB) तैयार करें: TSB के 30 जी का मिश्रण, आगर के 15 जी, और 1 पानी की L, एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ मिश्रण, और गर्मी में उबलते तक ~ १०० ° c 5 मिनट के लिए. शांत करने के लिए अनुमति दें और फिर 15 मिनट के लिए तरल चक्र पर आटोक्लेव. करने के लिए शांत करने की अनुमति ~ ५५ ° c, स्थानांतरण 10 मिलीलीटर हौसले से autoclaved TSA पेट्री व्यंजन बाँझ करने के लिए, और कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं । 2-5 डी या 10 मिनट के लिए एक सुरक्षा कैबिनेट के तहत खुला के लिए benchtop पर शुष्क चलो ।
        2. स्थानांतरण १०० μL कमजोर पड़ने बाँझ tsa और एक प्रसारकर्ता या कांच के मोतियों का उपयोग कर TSA भर में फैल युक्त एक पेट्री पकवान के लिए ।
        3. एक humidified मशीन में ३७ ° c पर रातोंरात पेट्री पकवान स्टोर (यानी, ३७ डिग्री सेल्सियस एक खुला 1-एल पानी से भरा चोंच युक्त मशीन)
      6. CFUs/एमएल फेफड़ों homogenate का निर्धारण आगर चढ़ाना पर आधारित (जैसे, १०० तीसरे और अंतिम कमजोर पड़ने के १०० μL के साथ TSA थाली पर CFUs १०० CFUs/100 μL × १००दिल # 1 × १००दिल # 2 × १०० दिल #3 = 1 × 109 CFUs/एमएल) ।
      7. CFUs/मिलीग्राम फेफड़े के ऊतकों CFUs/एमएल फेफड़े homogenate द्वारा मिलीग्राम फेफड़े के ऊतकों/एमएल homogenate (जैसेकी गणना, यदि नमूना प्रयुक्त ऊपर वर्णित १०० पंजाब के 5 मिलीलीटर में फेफड़ों के ऊतकों homogenized के मिलीग्राम, तो 1 × 109 CFUs/एमएल ÷ १०० मिलीग्राम/5 मिलीलीटर = 5 × 107 CFUs/mg).

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Representative Results

ध्यान से प्रोटोकॉल का पालन करके, reproducible और मजबूत डेटा आसानी से प्राप्त किया जा सकता है । यह कड़ाई से प्रयोग के लिए एक अनुकूलित इनोक्युलम तैयारी प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है एक दूसरे की तुलना में हो । यह भी संक्रमण प्रक्रिया के दौरान ठीक से चूहों को संभालने के लिए महत्वपूर्ण है । एक संज्ञाहरण isoflurane से रहित कक्ष में चूहों जगह सुनिश्चित करें । चूहों अगर वे एक कक्ष है कि पूर्व isoflurane से भरा गया है और अतिरिक्त तनाव है, जो संभवतः प्रयोगात्मक परिणाम समझौता कर सकते है अनुभव हो सकता है में रखा जाता है आतंक होगा । कंटेनर ढक्कन हासिल करने के बाद, धीरे संवर्द्धित द्वारा isoflurane परिचय 0% से 4% करने के लिए अपनी एकाग्रता में वृद्धि (v/ जल्दबाजी election isoflurane भी चूहों के कारण दहशत पैदा कर सकता है । एक बार जब चूहे बेहोश हो, 2-3% (v/v) isoflurane एकाग्रता को कम करने और उंहें एक अतिरिक्त कुछ मिनट के लिए चैंबर में रहने के लिए अनुमति देते हैं । इस बिंदु पर, चूहों संक्रमित होने के लिए तैयार कर रहे हैं (चित्रा 1).

संज्ञाहरण कक्ष से एक चूहा निकालें और इसे अपने ऊपर कृन्तक द्वारा निलंबित करने के लिए जीभ (चित्रा 2) के लिए उपयोग की अनुमति । कुंद का प्रयोग करें संदंश को धीरे से बाहर जीभ खींच (3 आंकड़ा) तो संदंश-एक बाँझ, दस्ताने उंगलियों (आंकड़ा 4) के लिए आयोजित की जीभ हस्तांतरण के लिए है माउस जीभ को आघात से रोकने के । अभी भी मुंह के बाहर जीभ के साथ, ५०-µ l इनोक्युलम oropharynx (चित्रा 5) को हस्तांतरित । यहां, यह बहुत ही micropipette पर पहले बंद करने के लिए pipetting द्वारा तरल उद्धार महत्वपूर्ण है । दूसरे बंद करने के लिए जारी रखने के संक्रमण के साथ हस्तक्षेप करता है कि इनोक्युलम में एक बड़ा बुलबुला परिचय कर सकते हैं ।

एक बार संक्रमण पूरा हो गया है, वहां चूहों के परीक्षण के लिए विकल्प के असंख्य हैं । रोगजनन अध्ययन के लिए, एक संक्रमित ऊतक (चित्रा 6) के लिए संक्रमित तुलना कर सकते हैं । यदि उपंयास चिकित्सकीय की प्रभावशीलता का विश्लेषण, एक फेफड़ों को हटा सकते है और उंहें खोदी और दाग है । यह एक समय बिंदु पर या एकाधिक समय अंक में किया जा सकता है के लिए रोग प्रगति (चित्रा 7) दिखाओ ।

एक अन्य विकल्प है संक्रमित चूहों के फेफड़ों में जीवाणु के बोझ का आकलन करना. यह फेफड़ों को हटाने, बाँझ पंजाबियों की एक ज्ञात मात्रा युक्त एक शीशी को स्थानांतरित करने के द्वारा किया जाता है, तो एक ऊतक homogenizer (पार संक्रमण को रोकने के लिए प्रत्येक नमूने के बीच धोने) के साथ अनुमन्य । पोषक तत्व संपंन आगर पर फेफड़ों homogenate के सीरियल कमजोरियां चढ़ाना प्रत्येक फेफड़े homogenate के लिए CFUs/एमएल की गणना के लिए अनुमति देता है और बाद में CFUs/ यह भी एक समय बिंदु पर या कई समय अंक में किया जा सकता है रोग प्रगति दिखाने के लिए ।

वहां अनगिनत अंय परख कि प्रदर्शन किया जा सकता है, cytokine विश्लेषण सहित (9 अंक), पूति iSTAT (चित्रा 10) द्वारा, प्रवाह cytometry सेल सतह मार्करों, सेलुलर रूपरेखा, RNAseq, आदि की जांच कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : LD१००का निर्धारण । यह LD१००निर्धारित करने के लिए विभिन्न inocula सांद्रता के साथ चूहों को संक्रमित करने के लिए आवश्यक है. यहां, इनोक्युलम 2 × 108 CFUs/माउस बहुत अधिक है, 5 × 107 और 2 × 107 बहुत कम हैं, और 1 × 108 सिर्फ सही है ।

Figure 2
चित्रा 2 : शीर्ष कृन्तक द्वारा चूहों रुको । के बाद चूहों anesthetized रहे हैं, प्रेरण कक्ष से एक माउस को दूर, (क) संदंश का उपयोग करने के लिए बाहर काम की सतह के ऊपर 20-30 सेमी सुरक्षित स्ट्रिंग के एक पाश खींचने के लिए, (ख) माउस के शीर्ष कृन्तक के पीछे स्ट्रिंग ले जाएँ, (ग) स्ट्रिंग सुनिश्चित शीर्ष कृन्तक के पीछे सुरक्षित है, और (D) माउस स्ट्रिंग के लूप पर अपने शीर्ष कृन्तक द्वारा हैंग करने दें ।

Figure 3
चित्रा 3 : संदंश के साथ मुंह से बाहर खींच जीभ और दस्ताने उंगलियों को पकड़ हस्तांतरण । इसके ऊपर कृन्तक द्वारा माउस फांसी के बाद, (एक) संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे से है माउस जीभ समझ, (ख) धीरे से बाहर जीभ खींच, (ग) ध्यान से दस्ताने उंगलियों को संदंश से जीभ हस्तांतरण के लिए आघात को रोकने के लिए है माउस जीभ, और (घ) दस्ताने उंगलियों के साथ जगह में जीभ पकड़ो । जीभ को मुँह में वापस फिसल जाने से रोकने के लिए पर्याप्त दबाव लागू करना सुनिश्चित करें लेकिन इतना दबाव नहीं कि आघात मग्न रहे. जीभ कीट के बाहर और पक्ष के लिए आयोजित किया जाना चाहिए अगले कदम में micropipette का उपयोग करने के लिए अनुमति देते हैं । इस बिंदु पर, माउस संक्रमण के लिए तैयार है ।

Figure 4
चित्र 4 : माउस को संक्रमित । मुंह के बाहर जीभ को बनाए रखने के लिए, एक micropipette का उपयोग करने के लिए ५०-µ l इनोक्युलम oropharynx को हस्तांतरित । जीभ के पीछे मुंह के अंदर प्लास्टिक टिप प्लेस और बैक्टीरियल सस्पेंशन वितरण, केवल micropipette पर पहले शीर्ष पर जा; इस इनोक्युलम कि पूरी आकांक्षा के साथ हस्तक्षेप कर सकते में एक बड़ा बुलबुला लागू कर सकते है के रूप में दूसरे बंद करने के लिए मत जाओ ।

Figure 5
चित्रा 5 : Micrograph स्वस्थ (संक्रमित) बनाम संक्रमित फेफड़ों के ऊतकों । Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) से पहले और एक. baumanniiकी oropharyngeal आकांक्षा के बाद फेफड़ों के वर्गों के दाग, जो वेंटीलेटर से जुड़े निमोनिया (recapitulates) के मार्ग VAP, मृत्यु में जिसके परिणामस्वरूप आम तौर पर 1-3 दिनों के भीतर और पर्याप्त वायुकोशीय सूजन के रूप में यहां देखा ।

Figure 6
चित्रा 6 : बैक्टीरियल बोझ का आकलन; पुनर्मुद्रित और अनुमति के साथ संशोधित14 . चूहों को संक्रमित करने के बाद, लागू IACUC प्रोटोकॉल के अनुपालन में सफल इच्छामृत्यु के बाद विच्छेदन द्वारा फेफड़ों को हटा दें । फेफड़ों के ऊतकों के द्रव्यमान लीजिए, एक ज्ञात मात्रा (बाँझ पंजाबियों की 2-5 मिलीलीटर) से युक्त एक शीशी को हस्तांतरण, तो एक ऊतक homogenizer के साथ homogenize. एक नमूना के बीच में इथेनॉल और बाँझ पंजाबियों के साथ homogenizer कुल्ला करने के लिए सुनिश्चित करें कि पार संक्रमण को रोकने के लिए । फेफड़े के homogenate और थाली पोषक तत्वों से भरपूर पर विभिन्न कमजोर पड़ने के सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन और चुना रोगज़नक़ के लिए उचित मशीन । CFUs/प्लेट × कमजोर पड़ने के आधार पर प्रत्येक फेफड़े homogenate के लिए CFUs/एमएल की गणना, और फिर मिलीग्राम फेफड़े के ऊतकों/ यह एक समय बिंदु पर या एकाधिक समय बिंदुओं पर किया जा सकता है रोग प्रगति दिखाने के लिए । माध्य त्रुटि interquartile पर्वतमाला का प्रतिनिधित्व सलाखों के साथ प्रदर्शित कर रहे हैं । *p < 0.05 स्वास्थ्यकर्मी बनाम अनुपचारित समूह ।

Figure 7
चित्र 7 : संक्रमित फेफड़े के ऊतकों के Micrograph, अनुपचारित बनाम इलाज; पुनर्मुद्रित और अनुमति के साथ संशोधित14 . चूहों को संक्रमित करने के बाद, लागू IACUC प्रोटोकॉल के अनुपालन में सफल इच्छामृत्यु के बाद विच्छेदन द्वारा फेफड़ों को हटा दें । उचित ऊतक की रक्षा (जैसे, इष्टतम काटने के तापमान जेल में डूबे और-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए) तो पैथोलॉजी लैब या अन्य कुशल व्यक्ति को भेजने के लिए और धुंधला । यह एक समय बिंदु पर या एकाधिक समय बिंदुओं पर किया जा सकता है रोग प्रगति दिखाने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : Cytokine विश्लेषण; पुनर्मुद्रित और अनुमति के साथ संशोधित14 . परिसंचारी साइटोकिंस का विश्लेषण करने के लिए, पर्याप्त रक्त की खरीद (जैसे, पूंछ निक के माध्यम से ५० µ एल), कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए coagulate की अनुमति, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १,००० × जी में केंद्रापसारक, और सीरम supernatant इकट्ठा । इसके बाद साइटोकिंस के लिए Luminex मल्टीप्लेक्स द्वारा सीरम का विश्लेषण किया जा सकता है. यह एक समय बिंदु पर या एकाधिक समय बिंदुओं पर किया जा सकता है रोग प्रगति दिखाने के लिए । माध्य त्रुटि interquartile पर्वतमाला का प्रतिनिधित्व सलाखों के साथ प्रदर्शित कर रहे हैं । *p < 0.05 का इलाज समूह बनाम एक ही समय-बिंदु पर किया जाता है ।

Figure 9
चित्र 9 : पूति marks; पुनर्मुद्रित और अनुमति के साथ संशोधित14 . पूति के लिए मार्क्स का विश्लेषण, ७५ µ एल रक्त की खरीद (जैसे, पूंछ निक के माध्यम से) और जल्दी से एक iSTAT कारतूस को हस्तांतरण कि वांछित analytes के लिए परीक्षण । यह एक समय बिंदु पर या एकाधिक समय बिंदुओं पर किया जा सकता है रोग प्रगति दिखाने के लिए । माध्य त्रुटि interquartile पर्वतमाला का प्रतिनिधित्व सलाखों के साथ प्रदर्शित कर रहे हैं । *p < 0.05 का इलाज समूह बनाम एक ही समय-बिंदु पर किया जाता है ।

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Discussion

यह सुनिश्चित करने के लिए, चूहे लघु मनुष्य नहीं हैं । माउस मॉडल से प्राप्त परिणामों के संदर्भ में विचार किया जाना चाहिए और बाद में मनुष्यों के लिए लागू करने के लिए व्याख्या की, मतभेदों पर आधारित है और दोनों प्रजातियों के बीच समानताएं6। यह भी करने के लिए उपयुक्त माउस तनाव का चयन महत्वपूर्ण है के रूप में कुछ दूसरों की तुलना में कुछ संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील; एक ही विकल्प16के रोगज़नक़ तनाव पर लागू होता है ।

यह एक सटीक और अत्यधिक reproducible रास्ते में संक्रमण प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है । Inocula एक मूल्य पर चूहों के लिए घातक हो सकता है अभी तक उस मूल्य के भी ९०% पर हानिरहित । इस प्रकार, यह आवश्यक है कि सभी शर्तों इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध ठीक उसी तरह reproduced रहे हैं, विशेष रूप से जब इनोक्युलम की तैयारी और जब संक्रमण । इसके अतिरिक्त, प्रत्येक रोगज़नक़ एक अद्वितीय इनोक्युलम में रोग का कारण होगा । इसलिए, रोगज़नक़ के प्रत्येक तनाव और माउस के प्रत्येक तनाव के लिए उपयुक्त इनोक्युलम निर्धारित करने के लिए पायलट प्रयोगों को करने के लिए आवश्यक है ।

ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया, ≤ 5 × 108 CFUs/माउस के एक इनोक्युलम के साथ विषमय उपभेदों में मौत का कारण के लिए पर्याप्त है । यह उपभेदों है कि गैर ≤ 1 × 109 CFUs/माउस पर घातक है का उपयोग नहीं करने की सलाह दी है क्योंकि वे रोगजनन को संदिग्ध प्रासंगिकता का सुझाव सरासर मात्रा के आधार पर सामग्री के16फेफड़ों में रखा जा रहा है ।

दूसरों की तुलना में, वहाँ oropharyngeal आकांक्षा निमोनिया मॉडल के लिए बहुत कुछ तकनीकी जटिलताओं हैं और reproducibility कहीं अधिक है । केवल एक मॉडल परिणाम की मामूली जटिलता जब ५०-µ एल oropharynx में रखा इनोक्युलम के आसपास सतह तनाव नाक श्वसन, precluding आकांक्षा के लिए अनुमति देता है-संक्रमण का कारण । इस मामले में, बस संदंश के साथ नरेस चुटकी मुंह और संक्रामक निमोनिया पैदा करने के लिए इनोक्युलम के बाद साँस लेना के माध्यम से सजगता आकांक्षा मजबूर । यह है, तथापि, तकनीशियन, जो आसानी से ंयूनतम अभ्यास के साथ बचा है द्वारा एक तकनीकी त्रुटि ।

मानव रोग के लिए इसकी प्रासंगिकता के संदर्भ में, इस मॉडल की एक सीमा, ग्राम के अन्य मॉडलों की तरह-नकारात्मक बैक्टीरियल संक्रमण, रोग की प्रगति की तेजी है. मनुष्य शायद ही कभी एक जीवाणु निलंबन के एक बड़े बोल्स से संक्रमित हैं, यही कारण है कि चूहों इतनी तेजी से रोग के लिए प्रगति. फिर भी, सभी एफडीए को मंजूरी दी उपचार पशु मॉडलों में ऐसे शोधों अनुसंधान की जांच से गुजरना करने के लिए मानव में नैदानिक परीक्षणों पर जाने से पहले उनकी चिकित्सीय क्षमता का आकलन । विडंबना यह है कि, मॉडल की तेजी भी एक आकर्षक विशेषता है, क्योंकि यह समय की एक संक्षिप्त अवधि के भीतर चिकित्सीय प्रभावकारिता पर स्पष्टता प्रदान कर सकते हैं ।

कोई murine मॉडल सही है, लेकिन यह ईमानदारी से संक्रमण और मानव रोगों के रोगजनन के मार्ग का अनुकरण करने की क्षमता के साथ एक मॉडल है और संभावित चिकित्सकीय की प्रभावशीलता का आकलन है, जिससे उपंयास चिकित्सा के तेजी से अनुवाद के लिए अनुमति कि क्लिनिक में सख्त जरूरत है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान में एलर्जी और संक्रामक रोगों के इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित किया गया [अनुदान संख्या R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954, और R42 AI106375 को बी एस] और अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन [संविदा HHSF223201710199C को BML] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BD 214530 Combine with TSB to make TSA
Beads, Borosilicate Glass Kimble 135003 Sterilize by baking or autoclaving before each use
Beaker, 250 mL Pyrex 1003 Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula
Centrifuge Sorvall ST 40R Capable of 4,000×g at 4°C
Chamber for Anesthesia Kent Scientific Corporation VetFlo-0720 Accommodates up to 5 mice
Cryomold, Intermediate Size Sakura Tissue-Tek 4566 Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm
Dental Floss Oral-B 37000469537 Tie to stable post approx. 6" above table height
Forceps VWR 82027-440 Used to gently pull tongue out of mouse's mouth
Homogenizer for Lung Tissue Omni International TM125-115 Autoclave before first use; rinse between samples
Isoflurane for Anesthesia Abbott 10015516 Alternative drug can be used; modify procedure accordingly
iSTAT Cartridge Abbott 03P79-25 Various cartridges are available to suit your needs
Ketamine, 100 mg/mL Western Medical Supply 4165 Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL
Ointment for Eyes Akorn Tears Renewed Avoid touching eye with tip of dispenser
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound Fisher Scientific 23-730-571 Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning
Petri Dish VWR 25384-302 Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CM Dulbecco's PBS without calcium and magnesium
Pipette Tips, 200-μL VWR 10017-044 Autoclave before use
Pipetter, 200-μL Gilson Pipetman P200 Autoclave and calibrate before use
Spreader, Bacterial Cell Bel-Art F377360006 Sterilize by baking or autoclaving before each use
Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length VWR 58948-150 Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting
Stir Plate, Magnetic Corning PC-620D Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting
Tryptic Soy Broth (TSB) BD 211822 Combine with Agar to make TSA
Vial, Conical, Sterile, 50 mL Corning 431720 Used for preparing bacterial inocula
Vial, Conical, Sterile, 500 mL Corning 431123 Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula
Vial, Cryogenic, 2.0 mL Corning 430659 Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula
Xylazine, 20 mg/mL Akorn AnaSed Injection Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL

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References

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चिकित्सा अंक १३६ संक्रामक रोग murine मॉडल निमोनिया oropharyngeal आकांक्षा वेंटिलेटर से जुड़े निमोनिया अस्पताल में उपार्जित निमोनिया
Murine Oropharyngeal आकांक्षा मॉडल वेंटीलेटर-एसोसिएटेड और अस्पताल के अधिग्रहण बैक्टीरियल निमोनिया
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Nielsen, T. B., Yan, J., Luna, B., Spellberg, B. Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (136), e57672, doi:10.3791/57672 (2018).

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