Summary
Infektiøse lungebetændelse er blandt de mest almindelige infektioner i mennesker. En passende i vivo model er afgørende for forståelse sygdom patogenese og teste effekten af roman therapeutics. Med denne murine oropharyngeale aspiration lungebetændelse model, kan en undersøger patogenese og nye behandlinger mod disse dødelige infektioner.
Abstract
Murine infektion modeller er afgørende for forståelse sygdom patogenese og teste effekten af roman therapeutics designet til at bekæmpe sygdomsfremkaldende patogener. Infektiøse lungebetændelse er blandt de mest almindelige infektioner som patienter i klinikken og dermed garanterer en passende i vivo model. Typiske lungebetændelse modeller bruger intranasal podning, som deponerer overdreven organismer uden for lungerne, forårsager off target komplikationer og symptomer, såsom bihulebetændelse, gastritis, enteritis, fysisk traume eller microparticle dug til at efterligne aerosol spredes mere typisk for viral, tuberkuløse eller fungal pneumoni. Disse modeller afspejler ikke præcist patogenesen af typiske EF - eller sundhedspleje-erhvervet bakteriel lungebetændelse. Derimod efterligner denne murine model af oropharyngeale aspirationspneumoni ruten droplet i healthcare erhvervet lungebetændelse. Suspension i oropharynx af bedøvede mus vaccinere 50 µL af bakterierne der forårsager refleksiv aspiration, hvilket resulterer i lungebetændelse. Med denne model, kan en undersøger patogenese af lungebetændelse-forårsager patogener og nye behandlinger til at bekæmpe disse sygdomme.
Introduction
Nedre luftvejsinfektion er verdens mest dødelige smitsomme sygdomme og den mest almindelige dødsårsag i udviklingslandene1. Globalt, tegner disse infektioner sig for mere end 3,2 millioner dødsfald1. Derudover nosokomiel pneumoni er blandt de mest almindelige og dødbringende former for sundhedspleje erhvervede infektioner, og er forårsaget af den mest antibiotika-resistente patogener2,3. Den typiske erhvervelse af bakteriel lungebetændelse for både erhvervet og nosokomiel pneumoni er aspiration af oropharyngeale indholdet i alveolerne. Murine modeller bruges til at studere disse sygdomme ofte bruge intranasal podning4, deponering meget af bakterier uden for lungerne, forårsager off target komplikationer og symptomer som bihulebetændelse og fysiske traumer, som er inkongruente med sygdommen progression i menneskelige som modellerne var designet til at efterligne. Andre modeller kan bruge indånding kamre og micromisting enheder, der mere præcist efterligne viral, tuberkuløse og fungal lungebetændelser, men ikke præcist sammenfatte den normale rute af anskaffelsessum for typiske bakterielle lungebetændelser.
Murine oropharyngeale aspiration lungebetændelse model kan udnyttes til at simulere naturlig rute og patogenese af bakteriel lungebetændelse. Ved vaccination 50 µL af den bakterielle suspension i oropharynx af bedøvede mus ved hjælp af en pipette, ensues refleksiv aspiration, hvilket resulterer i infektiøse lungebetændelse. Bruger denne model, kan en undersøger patogenese af lungebetændelse-forårsager patogener og nye behandlinger til at bekæmpe disse sygdomme med en højere troskab model, mere svarer til aspiration lungebetændelse infektioner observeret i human. Desuden, i modsætning til lignende modeller, der inficerer gennem mundhulen5,6, sikrer denne model, at den fulde inokulum når lungerne i stedet for tarmen, hvor det kan forårsage off-site betændelse og infektioner, såsom gastritis og enteritis. Endelig, i modsætning til et andet offentliggjort model, der kræver en laryngoscope og inokulerede gennem luftrøret7, denne model hindrer ikke luftvejene med en sonde kanyle og kræver ikke injektion for inokulum levering. I stedet, podning afhængig af den naturlige aspiration refleks af musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr skal godkendes af forskerens institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC).
1. forberedelse af bakteriel inokulum
- Isolere bakteriel kolonier.
- Streak en bakteriel stamme (f.eks. A. baumannii "HUMC1") på passende steril agarsubstratet (f.eks.Tryptic soja agar), være omhyggelig med at generere isolerede kolonier.
- Der inkuberes ved passende betingelser (fxnatten over ved 37 ° C).
- Vokse overnight kultur.
- Vælg en repræsentant, isoleret koloni fra agar plade med en steril inoculating loop og bruge det til podes 10 mL af passende steril bouillon medium (f.eks, Tryptic soja bouillon).
- Tillad prøve at nå frem til den stationære fase på de rette betingelser (fx37 ° C under omrystning på 200 rpm natten over i et udluftet-cap, 50 mL konisk hætteglas).
- Vokse subkultur.
- Overfør 100 μL af overnight kultur til 10 mL frisk steril bouillon ved hjælp af en pipette.
- Gør det muligt for at nå eksponentiel/log fase ved de rette betingelser (fx37 ° C under omrystning på 200 rpm i 3 timer i en udluftet-cap, 50 mL konisk hætteglas).
- Vaske subkultur.
- Fjerne subkultur fra omgivelserne kvægbruget.
- Der centrifugeres ved 4000 × g for 5 min at sammenpresse bakterier.
- Opsug og supernatanten.
- Der tilsættes 10 mL af sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til pellet og vortexes kraftigt indtil fuldt genopslemmes.
- Gentag trin 1.4.2 - 1.4.4 to gange, i alt 3 vasker.
- Justere koncentrationen af bakteriel suspension.
- Bruger et spektrofotometer, der måler optisk tæthed på 600 nm (OD600), måling af Ekstinktionen af bakteriel suspension.
- Tilføje steril PBS til bakteriel suspension indtil Ekstinktionen af inokulat falder til en OD600 af 0,5, ved hjælp af ligningen Cjeg× Vjeg = Cf× Vf, hvor "C" er koncentration, "V" er volumen, "jeg" er oprindelige, og "f" er endelige. * Cf bør altid være 0,5; Vf er variabel til at løse.
- Hvis den bakterielle suspension falder til under en OD600 af 0,5, centrifugeres det ved 4000 × g for 5 min pellet bakterier og fjerne en passende mængde supernatant til at nå en OD600 på 0,5.
- Udføre serielle fortyndinger i steril PBS (fx, tre 1: 100 fortyndinger at opnå 1 × 10-6) og plade på sterile agar til at bestemme korrelationskoefficienten, der afslører den bakterielle koncentration i kolonidannende enheder pr. mL (CFUs/mL) på en OD600 på 0,5.
Bemærk: Værdien af denne korrelationskoefficient varierer for hver stamme af hver art og skal bestemmes før inokulum forberedelse til en infektion. - Efter bestemmelse af korrelationskoefficienten, bruge det til at oprette et inokulum af den ønskede koncentration (f.eks., 2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL); Hvis den ønskede inokulum er større end 0,5 OD600 , centrifugeres den bakterielle suspension ved 4000 × g i 5 min pellet bakterier og fjerne en passende mængde supernatant at nå den ønskede koncentration.
- Udføre i vivo pilotundersøgelser for at bestemme virulens i hver bakteriel isolat i hver stamme af musen som disse værdier vil variere mellem bakteriel isolater af samme art og mus af forskellige genetiske baggrunde. For forskellige Gram-negative arter er LD100 i mus normalt 1-5 × 108 CFUs/mus, selv om visse stammer er dødelige på lavere inocula.
- Fryse identiske delprøver til senere brug som on demand, præcise inocula, som tidligere udgivne8 (valgfrit).
- Forberede 1 L af bakteriel inokulum som beskrevet ovenfor, overførsel til to 500 mL konisk hætteglas, og der centrifugeres ved 4000 × g i 5 min.
- Kassér 450 mL af supernatanten fra hvert konisk hætteglas og resuspend pellets af bakterier i den resterende supernatanten.
- Overføre den koncentrerede bakteriel inokulum til et 250 mL bægerglas indeholdende en magnetisk røre bar og løbende mix på toppen af en røre pladen på 300 rpm.
- Omhyggeligt overføre præcis 600 μl af koncentreret bakteriel inokulum (f.eks.1 × 1010 CFUs/mL) ved hjælp af en pipette til en 1,6-mL kryogene hætteglas indeholdende præcis 300 μl sterilt H2O og 300 μL af steril glycerol; mix og opbevares ved-80 ° C.
Bemærk: Glycerol nødvendige til opbevaring kan forvirre de eksperimentelle resultater og forårsage overskydende dødelighed, så det er nødvendigt at vaske det. - Når du er klar til brug, tø prøve i 10 min ved stuetemperatur.
- Der overføres 1 mL til en 50 mL konisk hætteglas, tilføje 9 mL steril PBS, og der centrifugeres ved 4000 × g i 5 min at sammenpresse bakterier. Opsug supernatanten og resuspend det forudbestemte antal CFUs (1 mL × frosne stock koncentration i CFUs/mL) i et passende volumen af PBS til at nå den ønskede koncentration for de smitsomme inokulum.
2. bedøve mus
- Ketamin/xylazin
Bemærk: Anæstesi med ketamin/xylazin har en lang varighed, som tilbyder tilstrækkelig tid til den forsker, der er nyt på denne teknik til at fuldføre podning procedure før musen vækker.- Forberede 10 mL af injicerbar løsning ved at kombinere 8,5 mL af pharmaceutifcal grade PBS, 1 mL 100 mg/mL ketamin stamopløsning (slutkoncentration 10 mg/mL), og 0,5 mL af 20 mg/mL xylazin stamopløsning (slutkoncentration 10 mg/mL).
- Administrere 10 μL/g ved intraperitoneal (IP) injektion (fx, 250 μL for en 25 g mus).
- Anvende oftalmologiske salve for øjnene af musene bedøvede med ketamin/xylazin fordi deres øjne er tilbøjelige til at skade under længerevarende af anæstesi.
- Placere musen i et bur og overvåge indtil det vågner op fra anæstesi.
Bemærk: Dyret må ikke efterlades uden opsyn indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency.
- Isofluran
Bemærk: Mus hurtigt vågne op fra isofluran-induceret anæstesi efter at blive fjernet fra induktion kammer, så denne metode af anæstesi bør kun anvendes efter at blive dygtige til podning procedure.- Placer de naive mus i en passende størrelse induktion kammer med ilt flyder.
- Efter salen er forseglet lukke, bedøver musene bruger en præcision vaporizer for at tilføje isofluran på 4% (v/v) i mindst 5 min; bekræfte anæstesi ved at fjerne en mus fra induktion kammer og måle hvor lang tid det tager for at vågne op fra anæstesi (~ 60 s).
Bemærk: Vær opmærksom at anæstesi kan variere baseret på institutionelle retningslinjer og nogle dyr kan kræve mere end 5 min at blive fuldt bedøvede. - Opretholde anesthesia for op til 10 min ved at justere isofluran koncentration til 2-3%; hvis samlede varighed af anæstesi er > 15 min, anvende oftalmologiske salve for øjnene af bedøvede mus.
- Placere musen i et bur og overvåge indtil det vågner op fra anæstesi, som i trin 2.1.
3. vaccination/inficerer mus
- Suspendere en bedøvede mus, hang det i dets øverste fortænder på en stærk, tynde snor (fx, tandtråd) fastgjort til et fast objekt på en højde ca to gange med musen kropslængde (f.eks.20 cm) over de operationelle overflade (f.eks. laboratoriebænk).
- Træk forsigtigt med musen tungen ud af munden ved hjælp af steril, blunt-ended pincet. Overføre tungen til en steril, behandsket finger til at forhindre utilsigtet knusning af musens tungen. Hold tungen uden for munden, giver adgang til oropharynx og forhindrer indtagelse af inokulum til side.
- Mens du holder musens tunge, placere 50 μL inokulum (bakteriel suspension) i oropharynx med en mikropipette; oropharynx er beliggende ved krydset af mundhulen og svælget mod bagsiden af munden.
Bemærk: Det er meget vigtigt at kun leverer flydende når der afpipetteres på det første stop på mikropipette. Musen vil stoppe vejrtrækningen i et par sekunder når inokulat er placeret i oropharynx; til sidst, vil refleksiv aspiration forårsage musen til at indånde den bakterielle suspension, anført af den særprægede knitrende støj af væske ind i lungerne, hvilket resulterer i lungebetændelse infektion. - Hvis inokulat ikke er placeret langt tilbage nok til at blokere normal respiration, klemme nares med pincet til at tvinge refleksiv aspiration gennem munden og efterfølgende indånding af inokulat.
- Efter podning, slippe tungen, fjerne musen fra strengen suspension, placere den i et bur og overvåge indtil det vågner op fra anæstesi, som i trin 2.1.
4. overvågning af sygdomsprogression
Bemærk: På grund af dyrenes lidelser, forskellige indikatorer skal anvendes til at angive når mus bliver døende; dødshjælp bør udføres efter denne bestemmelse, i henhold til en tidligere godkendt IACUC protokol; forskellige markører for moribundity omfatter kropstemperatur, vægttab, udseende, gangart og andre biomarkører, der kan opnås fra blod (f.eks. via iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.
- Aflive mus efter tidligere godkendt IACUC protokol (f.eks., CO2 efterfulgt af cervikal dislokation).
- Fjerne lungerne fra aflivede mus ved at skære luftrøret, lungepulsåren og pulmonale vene tæt på lungerne.
- Mikroskopi
- Placer den lungerne (eller dele) i en model støber.
- Fyld formen modellen med Optimal opskæring temperatur (O.C.T.) sammensatte, sænkes helt ned i vævet.
- Fryse prøve ved-80 ° C.
- Send prøven til et patologi laboratorium at sektion og montere på dias til mikroskopi.
- Bakteriel byrde
- Veje lungevæv på en Analysevægt.
- Overføre lungevæv til 50 mL konisk hætteglas indeholdende 2-5 mL steril PBS (afhængigt af størrelsen af væv).
- Homogeniseres lungevæv med et væv homogeniseringsapparat.
- Udføre serielle fortyndinger af homogenatet i steril PBS til at opnå cirka 1.000 CFUs/mL, baseret på forventede bakteriel byrde i lungerne.
- For eksempel, hvis 1 × 109 CFUs/mg forventes, udføre tre 1: 100 fortyndinger: overføre 100 μL af homogenatet til 9,9 mL PBS og vortex; Dette er den første fortynding, 1: 100. Overføre 100 μL af den første fortynding 1: 100 til 9,9 mL PBS og vortex; Dette er den anden fortynding, 1: 100. Overføre 100 μL af den anden 1: 100 fortynding til 9,9 mL PBS og vortex; Dette er den tredje og sidste 1: 100 fortynding.
- Hvis bakteriel byrde i lungerne er ukendt, udføre en række fortyndinger at fange det forventede område.
- Plade dilution(s) på sterile agar.
- Forberede sterile Tryptic soja bouillon (TSB) med agar (TSA) plader: Kombiner 30 g af TSB, 15 g agar og 1 L vand, bland med en magnetomrører, og varme indtil kogende på ~ 100 ° C i 5 min. lad den afkøle og derefter autoklave på flydende cyklus i 15 min. lad den afkøle til ~ 55 ° C, overførsel 10 mL frisk autoklaveres TSA til sterile petriskåle, og afkøles til stuetemperatur. Lad tørre på benchtop for 2-5 d eller afdækket under en biosikkerhed kabinet i 10 min.
- Overføre 100 μL af fortynding til en petriskål, der indeholder sterilt TSA og fordelt på TSA ved hjælp af en sprederen eller glas perler.
- Gemme petriskål natten over ved 37 ° C i en fugtig inkubator (dvs., 37 ° C inkubator indeholdende en udækket 1-L bægerglas fyldt med vand)
- Bestemme CFUs/mL lunge homogenatet baseret på agar plating (f.eks.100 CFUs på TSA plade med 100 μL af tredje og endelige fortynding beskrevet ovenfor ville være 100 CFUs/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
- Beregne CFUs/mg lungevæv baseret ved at dividere CFUs/mL lunge homogenatet af mg lunge væv/mL homogenatet (f.eks.hvis prøven beskrevet ovenfor bruges 100 mg af lungevæv homogeniseret i 5 mL PBS, så 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 CFUs/mg).
- Mikroskopi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Omhyggeligt efter protokollen, kan reproducerbare og robust data nemt indhentes. Det er afgørende at strengt til ens tilpassede inokulum forberedelse protokol for eksperimenter skal sammenlignes med en hinanden. Det er også vigtigt at korrekt håndtere mus under proceduren infektion. Sørg for at placere mus i en anæstesi kammer isofluran. Mus vil gå i panik hvis de placeres i et kammer, der har været fyldt med isofluran og kan opleve overskydende stress, som muligvis kan kompromittere eksperimentelle resultater. Efter at sikre container låg, langsomt indføre isofluran ved gradvist at øge sin koncentration fra 0% til 4% (v/v); hast administrere isofluran kan også forårsage mus til panik. Når musene bliver bevidstløs, reducere isofluran koncentration til 2-3% (v/v) og tillade dem at forblive i salen i yderligere nogle minutter. På dette tidspunkt mus er klar til at blive smittet (figur 1).
Fjerne en mus fra anæstesi kammer og suspendere det af sin øverste fortænder at give adgang til tungen (figur 2). Brug blunt-ended pincet til at trække forsigtigt ud af tungen (figur 3) derefter overføre pincet-holdt tungen til en steril, behandskede fingre (figur 4) for at undgå traumer til musens tungen. Med tunge stadig uden for munden, overføre 50 µL inokulum til oropharynx (figur 5). Her er det meget vigtigt at kun leverer flydende når der afpipetteres på det første stop på mikropipette. Fortsætter til det andet stop kan indføre en stor boble i den inokulum, der forstyrrer infektionen.
Når infektionen er komplet, er der et utal af muligheder for at teste mus. For patogenesen undersøgelser, man kan sammenligne inficerede til inficeret væv (figur 6). Hvis analysere effektiviteten af roman therapeutics, kan man fjerne lungerne og har dem i snit og farves. Dette kan gøres på et tidspunkt eller på flere tidspunkter at vise sygdomsprogression (figur 7).
En anden mulighed er at vurdere den bakterielle byrde i lungerne af inficerede mus. Dette gøres ved at fjerne lungerne, overførsel til et hætteglas indeholdende en kendt mængde af steril PBS, derefter homogenisering med et væv homogeniseringsapparat (skylles mellem hver prøve at forhindre krydskontaminering). Plating serielle fortyndinger af lunge homogenatet på næringsrige agar giver mulighed for beregning af CFUs/mL for hver lunge homogenatet og efterfølgende CFUs/mg lungevæv (figur 8). Dette, kan også ske på et tidspunkt eller på flere tidspunkter at vise sygdomsprogression.
Der er utallige andre assays, der kan udføres, herunder cytokin analyser (figur 9), sepsis biomarkører af iSTAT (figur 10), flowcytometri at undersøge celle overflade markører, cellulære profilering, RNAseq, osv.
Figur 1 : Bestemmelse af LD100. Det er nødvendigt at inficere mus med forskellige inocula koncentrationer til at bestemme LD100. Her, inokulum 2 × 108 CFUs/mus er for høj, 5 × 107 og 2 × 107 er for lavt, og 1 × 108 er lige højre.
Figur 2 : Hænge mus af øverste fortænder. Når musene er bedøvede, fjerne en mus fra salen induktion (A) bruge pincet til at trække en løkke af streng sikret 20-30 cm over bordpladen, (B) flytte streng bag musens øverste fortænder, (C) sikre strengen er sikret bag øverste fortænder og (D) Lad musen hænge ved dens øverste fortænder på loop af strengen.
Figur 3 : Træk tungen ud af munden med pincet og overførsel greb til behandskede fingre. Efter hængende musen ved dens øverste fortænder (A) bruge tang til at forsigtigt fat med musen tungen, (B) træk forsigtigt ud af tungen, (C) omhyggeligt overføre tungen fra pincet til behandskede fingre at undgå traumer på musens tungen, og (D) holde tungen på plads med behandskede fingre. Sørg for at lægge tilstrækkeligt pres til at forhindre, at tungen glider tilbage i munden, men ikke så meget pres at traumer ensues. Tungen skal holdes uden for møl og til siden, der giver mulighed for mikropipette adgang i næste trin. På dette tidspunkt, er musen klar til infektion.
Figur 4 : Inficere musen. Opretholde tungen uden for munden, bruge en mikropipette til at overføre 50 µL inokulum til oropharynx. Anbring med pipette overfoeres tip inde i munden på bagsiden af tungen og dispensere bakteriel suspension, kun vil den første top på mikropipette; går ikke til det andet stop som dette kan indføre en stor boble i den inokulum, der kan forstyrre komplet aspiration.
Figur 5 : Mikrograf af sunde (uinficerede) vs inficeret lungevæv. Hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning af lunge sektioner før og efter oropharyngeale aspiration af A. baumannii, som sammenfatter ruten af respirator-associeret pneumoni (VAP), hvilket resulterer i død typisk indenfor 1-3 dage og væsentlig alveolaris betændelse som ses her.
Figur 6 : Vurdere bakteriel byrde; genoptrykt og modificeret med tilladelse14 . Efter inficerer mus, skal du fjerne lungerne af dissektion efter vellykket eutanasi i overensstemmelse med den gældende IACUC protokol. Indsamle massen af lungevæv, overføre til et hætteglas indeholdende en kendt mængde (2-5 mL) af steril PBS, så homogeniseres med et væv homogeniseringsapparat. Sørg for at skylle homogeniseringsapparat med ethanol og steril PBS i mellem hver prøve at undgå krydskontaminering. Udføre serielle fortyndinger af lunge homogenatet og plade forskellige fortyndinger på næringsrige agar og inkuberes passende for den valgte patogen. Beregne CFUs/mL for hver lunge homogenatet baseret på CFUs/plade × fortynding, og derefter dividere med mg lunge væv/mL lunge homogenatet. Dette kan gøres på et tidspunkt eller på flere tidspunkter at vise sygdomsprogression. Medianerne vises med fejllinjer repræsenterer interkvartil intervaller. p < 0,05 behandles vs ubehandlet gruppe.
Figur 7 : Mikrograf af inficerede lungevæv, ubehandlet vs behandlet; genoptrykt og modificeret med tilladelse14 . Efter inficerer mus, skal du fjerne lungerne af dissektion efter vellykket eutanasi i overensstemmelse med den gældende IACUC protokol. Hensigtsmæssigt bevare vævet (f.eks., fordybet i Optimal opskæring temperatur gel og frosset ved-80 ° C) derefter sende til patologi laboratorium eller anden kyndig person for skæring og farvning. Dette kan gøres på et tidspunkt eller på flere tidspunkter at vise sygdomsprogression.
Figur 8 : Cytokin analyse; genoptrykt og modificeret med tilladelse14 . For at analysere cirkulerende cytokiner, skaffe tilstrækkelige blod (fx, 50 µL via hale nicking), gør det muligt at koagulere i 30 min. ved stuetemperatur, centrifugeres ved 1.000 × g i 10 min. ved 4 ° C, og indsamle serum supernatanten. Serum kan derefter analyseres af Luminex multiplex for cytokiner. Dette kan gøres på et tidspunkt eller på flere tidspunkter at vise sygdomsprogression. Medianerne vises med fejllinjer repræsenterer interkvartil intervaller. p < 0,05 behandlede vs ubehandlet gruppe på samme tidspunkt.
Figur 9 : Sepsis biomarkører, genoptrykt og modificeret med tilladelse14 . At analysere sepsis biomarkører, skaffe 75 µL blod (f.eks.via hale nicking) og hurtigt at overføre til en iSTAT patron, der tester for ønskede analysander. Dette kan gøres på et tidspunkt eller på flere tidspunkter at vise sygdomsprogression. Medianerne vises med fejllinjer repræsenterer interkvartil intervaller. p < 0,05 behandlede vs ubehandlet gruppe på samme tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
At være sikker, er mus ikke miniature mennesker. Resultaterne fra musemodeller skal betragtes i sammenhæng og efterfølgende fortolkes for anvendelse på mennesker, baseret på forskelle og ligheder mellem to arter6. Det er også vigtigt at vælge den passende mus stamme som visse er mere modtagelige for nogle infektioner end andre; det samme gælder patogen stamme af valg16.
Det er vigtigt at udføre infektioner i en krævende og meget reproducerbar måde. Inocula kan være dødelig for mus på én værdi endnu harmløse selv 90% af denne værdi. Det er således bydende nødvendigt, at alle betingelser i denne protokol er gengivet på nøjagtig samme måde, især når forbereder inokulat og inficere. Derudover vil hvert patogen forårsage sygdom på en unik inokulum. Det er derfor nødvendigt at foretage pilotforsøg for at bestemme den passende inokulum for hver stamme af patogenet og i hver stamme på musen.
Med gramnegative bakterier er en inokulum ≤5 × 108 CFUs/musen tilstrækkeligt til at forårsage død i virulente stammer. Det anbefales ikke at bruge stammer, der er ikke-dødelige på ≤1 × 109 CFUs/mus, fordi de foreslår tvivlsom relevans for patogenesen baseret på ren og skær antal materiale lægges ind i lungerne16.
I forhold til andre, der er meget få tekniske komplikationer for oropharyngeale aspiration lungebetændelse model og reproducerbarhed er langt større. Kun en mindre komplikation af modelresultater når overfladespænding omkring 50 µL inokulum placeret i oropharynx tillader nasal respiration, udelukker aspiration-den årsag til infektion. I dette tilfælde tvinger blot klemme nares med pincet refleksiv aspiration gennem munden og efterfølgende indånding af inokulat at fremkalde infektiøse lungebetændelse. Dette er dog en teknisk fejl med den tekniker, som nemt undgås med minimal praksis.
Med hensyn til dets relevans for sygdom hos mennesker er en begrænsning af denne model, som andre modeller af Gram-negative bakterielle infektioner, hurtighed af progressionen af sygdommen. Mennesker smittes sjældent med en stor bolus af en bakteriel suspension, hvilket er grunden til mus videre til sygdommen så hurtigt. Ikke desto mindre underkastes alle FDA-godkendte behandlinger sådanne Translationel forskning screeninger i dyremodeller for at vurdere deres terapeutiske potentiale før man går videre til kliniske forsøg på mennesker. Ironisk nok, hurtighed af modellen er også en attraktiv egenskab, da det kan give klarhed på terapeutiske virkning inden for en kort periode.
Ingen murine model er perfekt, men dette er en model med evnen til at trofast emulere infektionsvejen og patogenese af menneskelige sygdomme og vurdere effektiviteten af potentielle therapeutics, hvilket giver mulighed for hurtig oversættelse af nye behandlingsformer der er desperat behov for klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme på National Institutes of Health [Grant numre R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 og R42 AI106375 til BS] og US Food and Drug Administration [kontrakt HHSF223201710199C til BML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
- Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
- Spellberg, B., Talbot, G. H. Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia. Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).
- Kalil, A. C., et al. Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).
- Medina, E.
- Azoulay-Dupuis, E., et al. In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J.
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiology. 15, 252 (2015).
- Trammell, R. A., Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research. Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).
- Bast, D. J., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Hankenson, F. C., et al. Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).
- Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model. Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).
- Nielsen, T. B., et al. Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE. mBio. 8 (4), (2017).
- Nielsen, T. B., et al. Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis. Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).
- Cheng, B. L., et al. Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection. Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).
- Wong, D., et al. Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
