Summary
Infektiöse Lungenentzündung gehört zu den häufigsten Infektionen beim Menschen. Eine geeignete in-Vivo -Modell ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der Krankheit und Prüfung der Wirksamkeit neuer Therapeutika. Mit diesem Modell murine oropharyngealen Aspiration Pneumonie kann man die Pathogenese und neue Therapien gegen diese tödliche Infektionen untersuchen.
Abstract
Murine Infektionsmodelle sind entscheidend für das Verständnis der Pathogenese der Krankheit und Prüfung der Wirksamkeit neuer Therapeutika entwickelt, um die verursachenden Erreger zu bekämpfen. Infektiöse Lungenentzündung zählt zu den häufigsten Infektionen von Patienten in der Klinik vorgestellt und somit garantiert eine geeignete in-Vivo -Modell. Typische Pneumonie-Modelle verwenden intranasale Impfung, die übermäßige Organismen außerhalb der Lunge verursacht Ziel Komplikationen und Symptome wie Sinusitis, Gastritis, Enteritis, physisches Trauma oder Mikropartikel beschlagen Aerosol imitieren Einlagen die Ausbreitung ist eher typisch für virale, tuberkulösen oder pilzartige Pneumonie. Diese Modelle entsprechen nicht exakt die Pathogenese der bakteriellen Lungenentzündung typischen Gemeinschaft oder Gesundheitswesen erworben. Im Gegensatz dazu imitiert dieses Mausmodell der oropharyngealen Aspirationspneumonie die Tröpfchen-Route im Gesundheitswesen-erworbener Pneumonie. Impfen 50 µL der Bakterien verursacht Aussetzung in den Mund-Rachenraum narkotisierten Mäuse reflexive Aspiration, die zu einer Lungenentzündung führt. Mit diesem Modell kann man die Pathogenese von Lungenentzündung-verursachenden Erreger und neue Therapien zur Bekämpfung dieser Krankheiten untersuchen.
Introduction
Infektion der unteren Atemwege ist die tödlichste Infektionskrankheit der Welt und die häufigste Todesursache in Entwicklungsländern1. Diese Infektionen entfallen weltweit mehr als 3,2 Millionen Todesfälle1. Darüber hinaus nosokomiale Pneumonie gehört zu den häufigsten und tödlichen Formen der Gesundheitswesen erworbenen Infektionen und wird durch die meisten Antibiotika-resistente Erreger2,3verursacht. Der typische Weg des Erwerbs von für beide ambulant erworbenen bakteriellen Pneumonie und nosokomialer Pneumonie ist das Bestreben der oropharyngealen Inhalt in die Alveolen. Murine Modelle verwendet, um diese Krankheiten oft zu studieren verwenden intranasale Impfung4, ein Großteil der Bakterien außerhalb der Lunge, wodurch Ziel Komplikationen und Symptome wie Sinusitis und physischen Traumata, die mit der Krankheit inkongruent sind der Hinterlegung Progression bei Menschen, die die Modelle wurden entwickelt, um zu emulieren. Andere Modelle können Inhalation Kammern und Micromisting Geräte, die genauer virale, tuberkulösen und Pilz-Pneumonien zu imitieren, aber nicht genau rekapitulieren die Normalroute des Erwerbs für typische bakterielle Pneumonien.
Das murine oropharyngealen Aspiration Lungenentzündung Modell kann genutzt werden, um den natürlichen Weg und Pathogenese der bakteriellen Pneumonie zu simulieren. Von Impfkeimen 50 µL Bakteriensuspension in den Mund-Rachenraum narkotisierten Mäuse mit einer Pipette folgt reflexive Anspruch, woraus sich infektiöse Lungenentzündung. Mit diesem Modell kann man die Pathogenese von Lungenentzündung-verursachenden Erreger und neue Therapien zur Bekämpfung dieser Krankheiten mit höheren Treue Vorbild mehr analog zur Aspiration Pneumonie Infektionen beim Menschen beobachtet untersuchen. Darüber hinaus sorgt im Gegensatz zu ähnlichen Modellen, die durch die Mundhöhle5,6infizieren, dieses Modell die volle Inokulum der Lunge statt den Darm erreicht wo es Off-Site-Entzündungen und Infektionen wie Gastritis verursachen kann und Enteritis. Schließlich, im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Modell, das erfordert ein Laryngoskop und inoculates durch die Luftröhre7, dieses Modell nicht behindert die Atemwege mit einer Magensonde Nadel und erfordert keine Injektion für Inokulum Lieferung. Impfung, stützt sich auf das natürliche streben Reflex der Maus.
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Protocol
Alle Verfahren, bei denen Tiere müssen von der Forscher institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt werden.
1. Vorbereitung der bakterielle Inokulum
- Bakterienkolonien zu isolieren.
- Streifen ein Bakterienstamm (z. B. A. Baumannii "HUMC1") auf geeigneten sterilen Agar Medium (z. B.Tryptic Soy Agar), wobei Sie darauf achten, isolierte Kolonien zu generieren.
- Inkubieren Sie zu angemessenen Bedingungen (z. B.über Nacht bei 37 ° C).
- Wachsen Sie über Nacht Kultur.
- Wählen Sie einen Vertreter, isolierten Kolonie von der Agarplatte mit einer sterilen Impfkeimen Schleife und es 10 mL geeigneten sterilen Brühe Medium (z.B. Tryptic Soja Brühe) zu impfen.
- Lassen Sie die Probe, die stationäre Phase zu angemessenen Bedingungen (z.B., 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min über Nacht in eine belüftete Kappe, 50 mL konische Ampulle) zu erreichen.
- Wachsen der Subkultur.
- 10 mL frische sterile Brühe mit einer Pipette übermitteln Sie 100 μL der Nacht Kultur.
- Erlauben Sie, um exponentielle/Log-Phase bei den richtigen Bedingungen (z.B., 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für 3 h in einer entlüftet-Cap, 50 mL konische Phiole) zu erreichen.
- Waschen der Subkultur.
- Entfernen Sie die Subkultur aus seiner Inkubation Umgebung.
- Zentrifugieren Sie bei 4.000 × g für 5 min um die Bakterien zu Pellets.
- Aspirieren und den überstand verwerfen.
- Pellet und Strudel kräftig bis voll Nukleinsäuretablette fügen Sie 10 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS hinzu).
- Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2 - 1.4.4 zweimal, für eine Gesamtmenge von 3 wäscht.
- Passen Sie die Konzentration der Bakteriensuspension.
- Mit einem Spektralphotometer, die Maßnahmen der Extinktion bei 600 nm (OD600), Messung die optische Dichte der Bakteriensuspension.
- Hinzufügen, sterile PBS die Bakteriensuspension bis die optische Dichte des Inokulums sinkt auf ein OD600 von 0,5, unter Verwendung der Gleichung Cich× Vich = Cf× Vf, wo "C" Konzentration, "V" ist, "ich" ist initial, und "f" ist endgültig. * Cf sollte immer 0,5; Vf ist die Variable zu lösen.
- Wenn die Bakteriensuspension eines OD600 von 0,5 unterschreitet, Zentrifugieren Sie es 4.000 × g für 5 min pellet-die Bakterien zu entfernen einen angemessenen Betrag des Überstands ein OD600 von 0,5 erreichen.
- Führen Sie serielle Verdünnungen in sterilen PBS (z.B. drei Verdünnungen von 1: 100, 1 × 10-6zu erreichen) und Platte auf sterile Agar der Korrelationskoeffizient bestimmen, die offenbart die Bakterienkonzentration in koloniebildenden Einheiten pro mL (KBE/mL) bei einer OD600 von 0,5.
Hinweis: Der Wert dieser Korrelationskoeffizient für jede Belastung der einzelnen Arten variiert und vor Inokulum Vorbereitung für eine Infektion festzustellen. - Verwenden Sie nach der Bestimmung der Korrelationskoeffizient, um erstellen Sie ein Inokulum die gewünschte Konzentration (z.B. 2 × 108- 1 × 109 KBE/mL); Wenn das gewünschte Inokulum OD600 von 0,5 übersteigt, Zentrifugieren der Bakteriensuspension bei 4.000 × g für 5 min pellet-die Bakterien zu entfernen, einen angemessenen Betrag des Überstands um die gewünschte Konzentration zu erreichen.
- Führen Sie in Vivo Pilotstudien um die Virulenz von jede bakterielle Isolat in jedem Stamm der Maus zu bestimmen, da diese Werte zwischen bakterielle Isolate der gleichen Spezies und Mäuse verschiedene genetische Hintergründe variieren. Für verschiedene Gram-negative ist das LD100 bei Mäusen in der Regel 1 bis 5 × 108 KBE/Maus, obwohl bestimmte Stämme am unteren Impfkulturen tödlich sind.
- Frieren Sie identische Aliquote für eine spätere Verwendung als auf Abruf, präzise Impfkulturen als zuvor veröffentlichten8 (optional).
- Bereiten Sie 1 L bakterielle Inokulum als oben beschrieben, Übertragung auf zwei konischen 500-mL-Fläschchen und Zentrifuge bei 4.000 × g für 5 min.
- Verwerfen Sie 450 mL des Überstands von konischen jede und Aufschwemmen Sie der Pellets von Bakterien im restlichen überstand.
- Übertragen Sie das konzentrierte bakterielle Inokulum auf eine 250 mL-Becherglas mit einer magnetischen Stir Bar und kontinuierlich auf einer Platte rühren bei 300 u/min mischen.
- Übertragen Sie sorgfältig genau 600 μL der konzentrierten bakterielle Inokulum (z.B.1 x 1010 KBE/mL) mit einer Pipette zu einem kryogenen 1,6 mL-Fläschchen mit genau 300 μL der sterilen H2O und 300 μL der sterilen Glycerin; mischen und speichern bei-80 ° C.
Hinweis: Notwendig für die Lagerung Glycerin kann verwirren die experimentellen Ergebnisse und Übersterblichkeit verursachen, so es notwendig ist, es zu waschen. - Wenn Sie bereit sind für den Einsatz, tauen Sie die Probe für 10 min bei Raumtemperatur auf.
- Übertragen Sie 1 mL zu einem konischen 50-mL-Fläschchen zu, fügen Sie 9 mL sterile PBS und Zentrifuge bei 4.000 × g für 5 min um die Bakterien zu Pellets. Den überstand abgesaugt und erneut die vorgegebene Anzahl der KBE (1 mL × eingefroren Lager Konzentration in KBE/mL) in einem entsprechenden Volumen von PBS, die gewünschte Konzentration für das infektiöse Inokulum zu erreichen.
(2) betäubende Mäuse
- Ketamin/Xylazin
Hinweis: Betäubung mit Ketamin/Xylazin hat eine lange Laufzeit, bietet genügend Zeit für den Forscher, die neue an dieser Technik für die Inokulation Vorgang, bevor die Maus erwacht ist.- 10 mL Injektionslösung durch die Kombination von 8,5 mL Pharmaceutifcal Grade PBS, 1 mL 100 mg/mL Ketamin-Stammlösung vorbereiten (Endkonzentration 10 mg/mL), und 20 mg/mL Stammlösung Xylazin 0,5 mL (Endkonzentration 10 mg/mL).
- Verwalten Sie 10 μL/g durch intraperitoneale Injektion der (IP) (z.B. 250 μl für eine 25-g-Maus).
- Die Augen der Mäuse mit Ketamin/Xylazin betäubt, weil ihre Augen anfällig sind für Beschädigungen während längerer Anästhesie zuweisen Sie Augenheilkunde Salbe.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in einem Käfig und überwachen Sie, bis es aus der Narkose erwacht.
Hinweis: Das Tier sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat.
- Isofluran
Hinweis: Mäuse aufwachen schnell aus Isofluran induzierte Narkose nach der Entnahme aus der Kammer Induktion diese Methode der Narkose sollte nur verwendet werden, nachdem Sie kompetent bei der Impfung Verfahren geworden.- Legen Sie die naive Mäuse in eine entsprechend dimensionierte Induktion Kammer mit Sauerstoff fließt.
- Nachdem die Kammer versiegelten geschlossen ist, Betäuben Sie die Mäuse mit eine Präzision Vaporizer Isofluran bei 4 % (V/V) für mindestens 5 min hinzufügen; die Narkose durch eine Maus aus der Induktion Kammer entfernen und Messen, wie lange es dauert, bis aus der Narkose aufwachen zu bestätigen (~ 60 s).
Hinweis: Beachten Sie, dass die Anästhesie, die Zeiten variieren basierend auf Richtlinien und einige Tiere erfordern mehr als 5 min bis vollständig betäubt werden. - Pflegen Sie die Narkose für bis zu 10 min durch eine Anpassung der Isofluran Konzentration auf 2-3 %; Wenn die Gesamtdauer der Narkose ist > 15 min, ophthalmologische Salbe für die Augen der narkotisierten Mäuse gelten.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in einem Käfig und überwachen Sie, bis es aus der Narkose, wie in Schritt 2.1 aufwacht.
(3) impfen/infizieren Mäuse
- Aussetzen einer narkotisierten Maus, durch die oberen Schneidezähne an einer starken, dünnen Schnur (z.B., Zahnseide) hängen an einem festen Gegenstand in einer Höhe ungefähr zweimal die Maus Körperlänge (z.B.20 cm) über der Arbeitsfläche (z. B. gesichert Labortisch).
- Ziehen Sie die Maus Zunge aus seinen Mund mit Pinzette steril, Blunt beendet. Übertragen Sie die Zunge auf eine sterile, behandschuhten Finger gegen versehentliche Zerkleinerung von der Maus Zunge. Halten Sie die Zunge außerhalb der Mündung, den Zugriff auf die Mund-Rachenraum und schlucken des Inokulums zur Seite zu verhindern.
- Halten Sie die Maus Zunge, Platz 50 μL Inokulum (Bakteriensuspension) in den Mund-Rachenraum mit einer Mikropipette; der Mund-Rachenraum befindet sich an der Kreuzung von der Mundhöhle und des Rachens im hinteren Bereich des Mundes.
Hinweis: Es ist sehr wichtig, nur Flüssigkeit durch pipettieren, die erste Station auf der Mikropipette liefern. Die Maus stoppt Atem für ein paar Sekunden, wenn das Inokulum im Oropharynx gelegt wird; Schließlich verursacht reflexive streben die Maus, um die Bakteriensuspension, angezeigt durch die markante knisterndes Geräusch von Flüssigkeit in die Lunge, führt zu einer Lungenentzündung Infektion zu inhalieren. - Wenn das Inokulum nicht weit steht genug, um normale Atmung zu blockieren, die Nasenlöcher mit Zangen zwingen reflexive Absaugen durch Mund und anschließende Einatmen des Inokulums Kneifen zurück.
- Lassen Sie nach der Inokulation die Zunge, entfernen Sie die Maus aus dem String Suspension, legen Sie sie in einen Käfig und überwachen Sie, bis er aus der Narkose, wie in Schritt 2.1 erwacht.
4. Überwachung der Progression der Erkrankung
Hinweis: Aufgrund von Tierleid, sollte verschiedene Indikatoren verwendet werden um anzuzeigen, wenn Mäuse moribund geworden; Euthanasie sollte nach dieser Bestimmung gemäß einer zuvor genehmigten IACUC Protokoll durchgeführt werden; verschiedene Marker des Moribundity gehören Körpertemperatur, Gewichtsverlust, aussehen, Gang und andere Biomarker, die von Blut (z. B. über iSTAT)9,10,11,12gewonnen werden können, 13,14,15,16.
- Einschläfern Sie die Mäuse nach zuvor genehmigten IACUC Protokoll (z.B. CO2 gefolgt von zervikale Dislokation).
- Entfernen Sie die Lunge aus euthanasierten Maus durch Schneiden der Luftröhre, Lungenarterie und Pulmonalvene in der Nähe der Lunge.
- Mikroskopie
- Legen Sie die Lunge (oder Teil) in einer Probe-Form.
- Füllen Sie den Probe-Schimmel mit optimalen schneiden Temperatur (O.C.T.) Verbindung, das Gewebe vollständig untertauchen.
- Einfrieren der Probe bei-80 ° C.
- Senden Sie die Probe an ein Labor Pathologie Abschnitt und montieren auf Folien für die Mikroskopie.
- Bakterielle Belastung
- Wiegen Sie das Lungengewebe auf einer Analysenwaage.
- Übertragen Sie das Lungengewebe auf 50 mL konisch Fläschchen mit 2-5 mL sterile PBS (abhängig von der Größe des Gewebes).
- Homogenisieren des Lungengewebes mit einem Gewebe-Homogenisator.
- Führen Sie Verdünnungsreihen Das Homogenat in sterilen PBS, etwa 1.000 KBE/mL, basierend auf erwartete bakterielle Belastung in der Lunge zu erreichen.
- Zum Beispiel wenn 1 × 109 KBE/mg zu erwarten ist, führen Sie drei Verdünnungen von 1: 100: Transfer 100 μL von Homogenat bis 9,9 mL PBS und Wirbel; Dies ist die erste 1: 100 Verdünnung. Übertragen Sie 100 μl der ersten 1: 100 Verdünnung auf 9,9 mL PBS und Wirbel; Dies ist die zweite 1: 100 Verdünnung. Übertragen Sie 100 μl der zweiten 1: 100 Verdünnung auf 9,9 mL PBS und Wirbel; Dies ist die dritte und letzte 1: 100 Verdünnung.
- Wenn bakterielle Belastung in der Lunge nicht bekannt ist, führen Sie eine Reihe von Verdünnungen des erwarteten Bereichs zu erfassen.
- Platte Dilution(s) auf sterile Agar.
- Sterile Tryptic Soy Bouillon (TSB) mit Agarplatten (TSA) vorbereiten: Mähdrescher 30 g TSB, 15 g Agar, 1 L Wasser, mischen mit einem Magnetrührer und Hitze zum Kochen bringen bei ~ 100 ° C für 5 min. zulassen, um Cool und dann Autoklaven auf flüssigen Zyklus für 15 min. abkühlen lassen ~ 55 ° C, Transfer 10 mL frisch autoklaviert TSA, sterile Petrischalen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Lassen Sie auf Benchtop für 2-5 d trocken oder unter einen Schrank für 10 min Biosafety aufgedeckt.
- 100 μl der Verdünnung auf einer Petrischale mit sterilem TSA übertragen und TSA mit einem Streuer oder Glas Perlen verteilt.
- Speichern der Petrischale über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator (d.h. 37 ° C Inkubator mit einem aufgedeckt 1-L-Becher mit Wasser gefüllt)
- KBE/mL Lunge Homogenat basierend auf Agar-Beschichtung zu bestimmen (z. B.100 KBE auf TSA Teller mit 100 μL der dritte und letzte Verdünnung, die oben beschriebenen wäre 100 KBE/100 μL × 100Dil #1 × 100Dil #2 × 100Dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
- Berechnen Sie KBE/mg Lungengewebe durch Division KBE/mL Lunge Homogenat von mg Lunge Gewebe/mL Homogenat (z. B., wenn oben beschriebene Beispiel 100 mg in 5 mL PBS, dann 1 × 109 KBE/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 homogenisiert Lungengewebe verwendet basierend CFUs/mg).
- Mikroskopie
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Representative Results
Durch sorgfältig Folgendes Protokoll, können leicht reproduzierbare und robuste Daten abgerufen werden. Es ist wichtig, sich strikt an die individuelle Inokulum Vorbereitung Protokoll für Experimente zu einem miteinander verglichen werden. Es ist auch wichtig, richtig Mäuse während des Verfahrens der Infektion zu behandeln. Achten Sie darauf, um Mäuse in einer Narkose Kammer frei von Isofluran zu platzieren. Mäuse werden Panik, wenn sie in eine Kammer platziert werden, die mit Isofluran vorausgefüllt und Überbeanspruchung, die experimentellen Ergebnisse möglicherweise gefährden kann auftreten. Führen Sie nach der Sicherung der Behälterdeckel langsam Isofluran durch eine schrittweise Erhöhung seiner Konzentration von 0 % bis 4 % (V/V) ein; hastig Verwaltung Isofluran kann auch Mäuse in Panik zu verursachen. Sobald die Mäuse bewusstlos werden, reduzieren Sie die Isofluran Konzentration auf 2-3 % (V/V) und es ermöglichen Sie ihnen, für ein paar Minuten in der Kammer verbleiben. Mäuse sind zu diesem Zeitpunkt bereit, sein infiziert (Abbildung 1).
Entfernen Sie eine Maus aus der Narkose Kammer und hängen Sie es durch die oberen Schneidezähne Zugriff auf der Zunge (Abbildung 2). Gebrauch stumpf endete Pinzette vorsichtig herausziehen der Zunge (Abbildung 3) dann übertragen die Zange statt Zunge auf eine sterile, behandschuhten Fingern (Abbildung 4), um die Maus Zunge Trauma zu verhindern. Übertragen Sie mit der Zunge noch außerhalb des Mundes 50 µL Inokulum auf Oropharynx (Abbildung 5). Hier ist es sehr wichtig, nur Flüssigkeit durch pipettieren, die erste Station auf der Mikropipette liefern. Weiter bis zum zweiten Anschlag kann eine große Blase in das Inokulum einzuführen, die die Infektion beeinträchtigt.
Sobald die Infektion abgeschlossen ist, gibt es eine Vielzahl von Optionen zum Testen von Mäusen. Man kann für Pathogenese Studien vergleichen nicht infizierten, infiziertem Gewebe (Abbildung 6). Wenn die Wirksamkeit neuer Therapeutika zu analysieren, kann die Lunge zu entfernen und Sie geschnitten und gefärbt. Dies geschieht zu einem Zeitpunkt oder zu mehreren Zeitpunkten zum Fortschreiten der Erkrankung (Abbildung 7) zeigen.
Eine weitere Möglichkeit ist die bakterielle Belastung in der Lunge von infizierten Mäusen zu beurteilen. Dies geschieht durch Entfernen der Lunge, Übertragung auf ein Fläschchen mit einem bekannten Volumen des sterilen PBS dann Homogenisieren mit einem Gewebe-Homogenisator (Spülung zwischen jeder Probe um Kreuzkontaminationen zu vermeiden). Plattieren serielle Verdünnungen der Lunge Homogenat auf nährstoffreichem Agar kann für die Berechnung der KBE/mL für jede Lunge homogenisierte und anschließend KBE/mg Lungengewebe (Abbildung 8). Auch dies kann zu einem Zeitpunkt oder zu mehreren Zeitpunkten Fortschreiten der Krankheit zu zeigen.
Es gibt unzählige andere Tests, die durchgeführt werden können, einschließlich Zytokin Analysen (Abbildung 9), Sepsis Biomarker von iSTAT (Abbildung 10), Durchflusszytometrie zu untersuchen, Zelle oberflächenmarker, Mobilfunk, Profilerstellung, RNAseq, etc.
Abbildung 1 : Bestimmung der LD100. Es ist notwendig, um Mäuse mit verschiedenen Impfkulturen Konzentrationen zu bestimmen, die LD100zu infizieren. Hier das Inokulum 2 × 108 KBE/Maus ist zu hoch, 5 × 107 und 2 × 107 sind zu niedrig, und 1 × 108 ist genau das richtige.
Abbildung 2 : Hängen Sie Mäuse am oberen Schneidezähne. Nachdem die Mäuse betäubt sind, entfernen Sie eine Maus aus der Induktion-Kammer (A) mit Zange heraus eine Schleife der Zeichenkette sicherte sich 20-30 cm über der Arbeitsfläche (B) bewegen die Zeichenfolge hinter der Maus obere Schneidezähne, ((C) gewährleisten die Zeichenfolge hinter den oberen Schneidezähnen gesichert ist und (D) lassen Sie die Maus durch die oberen Schneidezähne auf die Schleife der Zeichenkette zu hängen.
Abbildung 3 : Ziehen Sie die Zunge aus Mund, mit Zange und Transfer Griff, behandschuhten Fingern. Nach dem Aufhängen der Maus durch die oberen Schneidezähne (A) Zange verwenden, um die Maus Zunge, sanft zu erfassen (B) vorsichtig herausziehen der Zunge, ()(C) sorgfältig übertragen die Zunge von Zangen auf behandschuhten Finger, Trauma, der Maus zu verhindern Zunge, und (D) die Zunge mit behandschuhten Fingern festhalten. Achten Sie darauf, genügend Druck zu verhindern, dass die Zunge rutscht zurück in den Mund, aber nicht so viel Druck, dass ein Trauma entsteht. Die Zunge sollte geführt werden, außerhalb der Motte und zur Seite, um im nächsten Schritt Mikropipette ermöglichen. An dieser Stelle ist die Maus bereit für Infektion.
Abbildung 4 : Die Maus infizieren. Aufrechterhaltung der Zunge außerhalb des Mundes, mithilfe einer Mikropipette das Inokulum 50 µL, Oropharynx übertragen. Pipettieren Spitze im Mund auf der Rückseite der Zunge und der Bakteriensuspension, nur auf den ersten Gipfel der Mikropipette los zu verzichten; gehen Sie nicht bis zum zweiten Anschlag, da dies eine große Blase in das Inokulum einführen kann, die komplette streben stören können.
Abbildung 5 : Schliffbild von gesunden (nicht infizierte) Vs infiziert Lungengewebe. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung der Lunge Abschnitte vor und nach oropharyngealen Aspiration von A. Baumannii, die die Route der Ventilator-assoziierten Pneumonie (VAP) mit Todesfolge in der Regel innerhalb von 1-3 Tagen rekapituliert und erhebliche alveoläre Entzündung, wie hier zu sehen.
Abbildung 6 : Bakterielle Belastung zu bewerten; nachgedruckt und modifiziert mit Erlaubnis14 . Entfernen Sie nach Mäusen zu infizieren Lunge durch Dissektion nach erfolgreichen Euthanasie in Übereinstimmung mit den anwendbaren IACUC Protokoll. Sammeln die Masse des Lungengewebes, übertragen auf ein Fläschchen mit einem bekannten Volumen (2-5 mL) von sterilen PBS, dann mit einem Gewebe-Homogenisator zu homogenisieren. Achten Sie darauf, spülen Sie den Homogenisator mit Ethanol und sterile PBS zwischen jeder Probe um Kreuzkontamination zu verhindern. Führen Sie serielle Verdünnungen der Lunge Homogenat und verschiedenen Verdünnungen auf nährstoffreichem Agar-Platte und inkubieren entsprechend des gewählten Erregers. Die KBE/mL für jede Lunge Homogenat basierend auf KBE/Platte × Verdünnung zu berechnen, und dann durch mg Lunge Gewebe/mL Lunge Homogenat teilen. Dies geschieht zu einem Zeitpunkt oder zu mehreren Zeitpunkten Fortschreiten der Krankheit zu zeigen. Mediane werden mit Fehlerbalken Vertretung interquartile Bereiche angezeigt. p < 0,05 behandelte und unbehandelte Gruppe.
Abbildung 7 : Schliffbild der infizierten Lungengewebe, unbehandelt Vs behandelt, neu aufgelegt und mit Genehmigung14 geändert . Entfernen Sie nach Mäusen zu infizieren Lunge durch Dissektion nach erfolgreichen Euthanasie in Übereinstimmung mit den anwendbaren IACUC Protokoll. Entsprechend erhalten die Gewebe (z.B., inmitten der optimale Arbeitstemperatur Gel und bei-80 ° C eingefroren) dann senden an Pathologie-Labor oder andere kompetente Person für Schneiden und färben. Dies geschieht zu einem Zeitpunkt oder zu mehreren Zeitpunkten Fortschreiten der Krankheit zu zeigen.
Abbildung 8 : Zytokin Analyse; neu aufgelegt und mit Genehmigung14 geändert . Um zirkulierende Zytokine zu analysieren, beschaffen Sie ausreichend Blut (z.B. 50 µL über Heck nicking) zu, um für 30 min bei Raumtemperatur, Zentrifuge bei 1000 × g für 10 min bei 4 ° C gerinnen und Serum überstand zu sammeln. Das Serum kann dann durch Luminex multiplex für Zytokine analysiert werden. Dies geschieht zu einem Zeitpunkt oder zu mehreren Zeitpunkten Fortschreiten der Krankheit zu zeigen. Mediane werden mit Fehlerbalken Vertretung interquartile Bereiche angezeigt. p < 0,05 behandelten vs. unbehandelte Gruppe zum gleichen Zeitpunkt.
Abbildung 9 : Sepsis Biomarker; nachgedruckt und veränderte mit Erlaubnis14 . Sepsis Biomarker zu analysieren, 75 µL Blut (z. B.über Heck nicking) zu beschaffen und schnell auf eine iSTAT-Patrone, die für die gewünschten Analyten testet übertragen. Dies geschieht zu einem Zeitpunkt oder zu mehreren Zeitpunkten Fortschreiten der Krankheit zu zeigen. Mediane werden mit Fehlerbalken Vertretung interquartile Bereiche angezeigt. p < 0,05 behandelten vs. unbehandelte Gruppe zum gleichen Zeitpunkt.
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Discussion
Um sicher zu sein, sind die Mäuse nicht Miniatur Menschen. Ergebnisse aus Mausmodellen müssen im Zusammenhang betrachtet und anschließend auf Übertragbarkeit auf den Menschen, basierend auf Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den beiden Arten6interpretiert werden. Es ist auch wichtig, die entsprechenden Maus-Stamm als wählen sicher sind einige Infektionen anfälliger als andere; das gleiche gilt für die Erreger-Stamm von Wahl16.
Es ist wichtig, Infektionen auf eine anspruchsvolle und hoch reproduzierbare Weise durchführen. Impfkulturen kann tödlich für Mäuse einen Wert noch harmlos bei noch 90 % dieses Werts. Daher ist es unerlässlich, dass alle in diesem Protokoll aufgeführten Bedingungen auf die gleiche Weise, besonders wenn das Inokulum vorbereiten und infizieren reproduziert werden. Darüber hinaus wird jeder Erreger Krankheit auf eine einzigartige Inokulum verursachen. Deshalb muss man pilot Experimente durchführen, um festzustellen, die angemessene Inokulum für jede Belastung des Erregers und in jedem Stamm der Maus durchführen.
Bei Gram-negativen Bakterien genügt ein Inokulum ≤5 × 108 KBE/Maus in virulente Stämme zum Tod führen. Es wird empfohlen, keine Stämme verwenden, die nicht-tödliche ≤1 × 109 KBE/Maus sind, weil sie zweifelhafter Relevanz für die Pathogenese basierend auf schiere Menge des Materials in die Lunge16vorschlagen.
Im Vergleich zu anderen, gibt es sehr wenige technische Komplikationen für das Modell oropharyngealen Aspiration Pneumonie und Reproduzierbarkeit ist weit größer. Nur eine kleine Komplikation der Modellergebnisse, wenn die Oberflächenspannung um 50 µL Inokulum im Oropharynx platziert ermöglicht eine nasale Atmung, Aspiration-die Ursache der Infektion auszuschließen. In diesem Fall zwingt die einfach Kneifen die Nasenlöcher mit der Pinzette reflexive Absaugen durch Mund und anschließende Einatmen des Inokulums infektiöse Lungenentzündung zu induzieren. Dies ist jedoch ein technischer Fehler durch den Techniker, die leicht mit minimalen Praxis vermieden wird.
Hinsichtlich ihrer Relevanz für die Krankheit beim Menschen ist die eine Einschränkung dieses Modells, wie bei anderen Modellen von gramnegativen bakteriellen Infektionen, die Schnelligkeit des Fortschreitens der Krankheit. Menschen sind selten mit einem großen Bolus von einer Bakteriensuspension angesteckt, weshalb Mäuse Krankheit so schnell Fortschritte machen. Dennoch, alle FDA-zugelassene Behandlungen unterzogen werden solche translationale Forschung-Screenings in Tiermodellen zu ihr therapeutische Potenzial zu beurteilen, bevor ich auf klinische Studien am Menschen. Ironischerweise ist die Schnelligkeit des Modells auch ein attraktives Feature, da es Klarheit über therapeutische Wirksamkeit innerhalb kurzer Zeit liefern kann.
Keine Mausmodell ist perfekt, aber dies ist ein Modell mit der Fähigkeit, treu zu emulieren, die Route der Infektion und Pathogenese von Krankheiten des Menschen und die Wirksamkeit möglicher Therapeutika, wodurch für die schnelle Übersetzung neuartiger Therapien Das sind in der Klinik dringend erforderlich.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases in der National Institutes of Health [Grant Zahlen R01 AI117211, R01 AI130060 R21 AI127954 und R42 AI106375 BS] und US Food and Drug Administration [Vertrag unterstützt. HHSF223201710199C, BML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
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