Summary
Her presenterer vi en protokoll for multi-farge lokalisering av enkelt membran proteiner i organeller levende celler. For å knytte fluorophores, brukes selv merking proteiner. Proteiner, ligger i forskjellige membraner deler av den samme organeller, kan være lokalisert med en presisjon ~ 18 nm.
Abstract
Kunnskap om lokalisering av proteiner i cellular subcompartments er avgjørende å forstå deres spesifikke funksjon. Her presenterer vi en super-oppløsning teknikk som gir mulighet for fastsettelse av microcompartments som er tilgjengelige for proteiner ved å generere lokalisering og spore kart av disse proteinene. Videre av multi-farge lokalisering mikroskopi hentes lokaliseringen og sporing profiler av proteiner i forskjellige subcompartments samtidig. Teknikken er spesifikk for lever celler og er basert på gjentatte avbilding av enkelt mobile membran proteiner. Proteiner av interesse er genetisk smeltet sammen med spesifikke, såkalte selv merking koder. Disse kodene er enzymer som reagerer med et substrat på en kovalente måte. Konjugert til disse underlag er fluorescerende fargestoffer. Reaksjonen av enzym-merket proteiner med fluorescensen merket underlag resultater i merket proteiner. Her brukes Tetramethylrhodamine (TMR) og silisium Rhodamine (SiR) som fluorescerende fargestoffer knyttet til underlag av enzymer. Ved hjelp av underlaget konsentrasjoner i pM for nM, er sub stoichiometric merking oppnådd som resulterer i forskjellige signaler. Disse signalene er lokalisert med ~ 15 – 27 nm presisjon. Teknikken tillater multi-farge imaging enkelt molekyler, der antallet farger er begrenset av tilgjengelig membran-permeable fargestoffer og repertoaret av selv merking enzymer. Vi viser muligheten for teknikken ved å bestemme lokaliseringen av kvalitetskontroll enzym (Pten)-indusert kinase 1 (PINK1) i ulike mitokondrie rom under behandlingen i forhold til andre membran proteiner. Testen for ekte fysiske interaksjonene mellom annerledes merket enkelt proteiner av ett molekyl bånd eller co sporing er begrenset, men fordi de lave merking gradene redusere sannsynligheten for å ha to tilstøtende proteiner kalt samtidig. Mens teknikken er sterk for imaging proteiner i membranen avdelinger, i de fleste tilfeller er det ikke hensiktsmessig å avgjøre lokaliseringen av svært mobile løselig protein.
Introduction
Målet med denne protokollen er en bildebehandling metode for å lokalisere og spore enkelt membran proteiner i live cellene. Vi kaller denne metoden sporing og lokalisering mikroskopi (TALM)1,2. Som Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM)3 og fluorescens Photoactivation lokalisering mikroskopi ((F) PALM)4,5er TALM en enkel molekyl-baserte fluorescens lokalisering teknikk. Men er det tydelig i måten at mobiliteten av membran proteiner i kombinasjon med repeterende bilder av samme merket molekyl i ulike posisjoner avslører microcompartment som er tilgjengelig for mobile protein. Med andre ord, angis de mulige steder av proteinet arkitekturen til organeller og mobiliteten av protein1. Metoden er utfyllende til ulike andre super-oppløsning teknikker6,7,8 fordi det avslører lokalisering og bane kart av tenkelig mobile proteiner. Merkingen er basert på bruk av genmodifiserte fusion proteiner som sådan ikke-fluorescerende. Disse fusion proteiner er selv merking enzymer som reagerer covalently med et substrat konjugert til en farge. Denne prosedyren har fordelen at merking graden kan være kontrollert av hvor mye ekstra substrat. Videre kan variere fargen på fluorescens, avhengig av den valgte konjugert fargestoffet. Flere selv merking enzym-koder er tilgjengelige9. En annen fordel med å bruke selv merking enzym-koder er, at de konjugert fargestoffer vanligvis er mer stabil og lysere enn lysstoffrør proteiner1 og personlige proteiner derfor kan registreres lenger og mer presist til de er bleket. Dette gir innspillingen av baner av mobile proteiner og utvinning av diffusjon koeffisienter10,11.
Her viser vi muligheten for TALM med mitokondrie membran proteiner, men det kan også brukes for andre intra - og ekstra cellular membran proteiner, inkludert forskjellige cellen typer12,13. Vi viser at multi-farge TALM videre tillater samtidig æren av proteiner i forskjellige subcompartments i complementation til eksisterende super-oppløsning fluorescens mikroskopi teknikker14,15, 16. TALM er kompatibel med levende celle imaging17. Foto-fysikk av de valgte rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR) og silisium-Rhodamien (Herre), spesielt deres lysstyrke og stabilitet, lar post enkelt membran proteiner over flere rammer gir lokalisering (og bane). TALM er imidlertid begrenset lokalisering av løselig proteiner med høy diffusjon koeffisienter siden motion blur er for høy og samlet fotoner hver ramme er for lav for riktig lokalisering. Dessuten krever TALM mindre eksitasjon strøm enn for eksempel STORM eller stimulert utslipp nedbryting (STED) mikroskopi6,7, redusere fototoksisk effekter. Dette er viktig, siden fototoksisk stress ofte påvirker organellar morfologi18 og dermed mobilitet analyse19. I sum, presenterer vi multi-farge TALM i levende celler som en teknikk som fyller et gap mellom metodene for lokalisering mikroskopi STORM/STED / (F) PALM og teknikker som analysere protein mobilitet som fluorescens gjenoppretting etter photobleaching (FRAP)20 ,21, fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS)22og fluorescens krysse korrelasjon spektroskopi (FCCS)11,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokollen følger retningslinjene i lokal institusjon forskning etikk.
1. metoder
-
Cellekultur
- Dyrke celler, for eksempel HeLa celler (human livmorhalsen karsinom), i en T25 celle kultur kolbe som inneholder 5 mL av vekstmediet på 37 ° C og 5% CO2.
Merk: For bildebehandling, dele cellene på forberedt coverslips (se trinn 1.3 og 1.4) og holde i imaging medium.
- Dyrke celler, for eksempel HeLa celler (human livmorhalsen karsinom), i en T25 celle kultur kolbe som inneholder 5 mL av vekstmediet på 37 ° C og 5% CO2.
-
Cellen transfection
Merk: Bruk linjer som uttrykker stabilt merket proteiner mulig24 å unngå sterk overuttrykte. For forbigående transfection, tilpasse mengden plasmider DNA brukes til hva. For eksempel når Ca2 + fosfat transfection25 , transfect celler (80-90% confluency) i en 3,5 cm celle kultur parabol med 2.5-5 µg av plasmider DNA. Når du utfører dobbelt hva, bruk 2,5 µg per hver plasmider konstruksjon.- For to farger eksperimenter, bruk en celle linje med stabil uttrykk for selv merking Vigelandsparken og transiently transfect med plasmider koding de andre selv merking protein17.
Merk: Her, i to farger eksperimenter, HeLa celler ble brukt som stabilt uttrykt selv merking proteiner PINK1-Halo-Tag og Tom20-fSNAP-koden.
- For to farger eksperimenter, bruk en celle linje med stabil uttrykk for selv merking Vigelandsparken og transiently transfect med plasmider koding de andre selv merking protein17.
-
Rengjøring av coverslips
- Sted coverslips i et beaker. Legg til 30 mL av H2O i begeret som inneholder coverslips og forsiktig risting for å fjerne støv fra deres overflate.
- Samle på coverslips med pinsett og tørkes med en strøm av nitrogen.
- Fjern alle organisk forurensning på overflaten av coverslips, f.eksved plasma rengjøring.
Merk: For å unngå ytterligere smitte av glass, bruk hansker under håndtering av coverslips.
FORSIKTIG: Når coverslips er renset av plasma renhold, ryddes bare oversiden av coverslips; Bruk denne siden for belegg med poly-L-Lysine-polyethylene glycol-arginin-glycine-aspartate (PLL-PEG-RGD) (inndelingen 1.4) og seeding (inndelingen 1.5).
-
Dekkglassvæske belegg med PLL-PEG-RGD
Merk: PLL-PEG-RGD er en poly-L-Lysine (PLL) derivat knyttet med en polyetylenglykol (3000 Da) og et cysteine-glycine-arginine-glycine-aspartate-serine (CGRGDS)-peptid. PLL binder seg til den negativt ladde glassoverflaten og danner en pinne pensel. Dette reduserer drastisk uspesifikke binding av ladet fluorescerende fargestoffer. I tillegg RGD motivet etterligner signal peptid integrin reseptoren og fremmer dermed integrin-mediert etterlevelse av celler som ellers ikke enkelt holder seg.- Forberede PLL-PEG-RGD som beskrevet tidligere26. Kort sagt, løses 0,8 mg PLL-PEG-RGD i 1 mL av PBS. Legge til 10 µL av PLL-PEG-RGD løsningen på oversiden av en ren dekkglassvæske.
- Ta en andre dekkglassvæske og plassere den med ren overflaten opp ned på den første dekkglassvæske (som har drop PLL-PEG-RGD på toppen); Dette resulterer i sandwiching PLL-PEG-RGD løsningen mellom to coverslips.
- Forsiktig plassere den klemt coverslips i et beaker og ruge 1t ved romtemperatur i støvfritt tørre omgivelser.
- Etter 1 h, legge til 30 mL av H2O begeret til å fullt ut dekke coverslips med vann.
- Forsiktig risting begeret til coverslips koble fra hverandre.
- Bruke pinsett for å samle coverslips ut av vannet og tørk dem under en strøm av nitrogen gass.
Merk: Den belagt coverslips kan lagres i et tørt, sterile glass bensin fat med lokk for et par dager.
-
Utarbeidelse av prøven for bildebehandling
- Overfør enkelt belagt coverslips i en 35 mm celle kultur parabol, PLL-PEG-RGD belagt overflaten vender oppover og legge 2 mL Imaging medium på toppen.
- Legg ~ 500.000 trypsinized celler (200-500 µL) som uttrykker selvtillit merking kodene på respektive membran proteiner til 2 mL imaging medium i celle kultur parabol med belagt dekkglassvæske. Riste forsiktig av hånd for å sikre en homogen fordeling av cellene å få en enhetlig celle lag.
- Inkuber cellene på 37 ° C og 5% CO2 inntil 80% confluency er nådd.
Merk: Cellen prøver bør være seeded 3 dager før bildebehandling og 1 dag før transfection. Celler som stabilt express protein av interesse, kan bli sådd 2 dager før bildebehandling. Senere, er bare celler dyrket på dekkglassvæske fotografert.
-
Merking av merket proteiner
Merk: Mest fluorescerende underlag har å bli oppløst i vann-fri DMSO. Vi anbefaler for å bruke lager løsninger på 1 µM fluorescerende substrat når siste merking konsentrasjonen er 0,2-30 nM17. Imaging membran proteiner i cellene, bruke membran permeable fluorescerende underlag.- Varm opp tenkelig mediet 37 ° c i et vannbad.
- Pipetter 1 mL av forvarmes tenkelig mediet i en 2 mL tube med lokk. Legge til 0,2-30 µL av fluorescerende underlag fra 1 µM lager løsninger å forberede den endelige merking løsningen (siste konsentrasjon: 0,2-30 nM).
- Vortex merking løsningen for 10 s.
- Erstatte mediet i 35 mm kultur parabol med cellene i en dekkglassvæske (se trinn 1.5) av 1 mL av forberedt merking løsning.
- Inkuber cellene i merking løsning på 37 ° C og 5% CO2 i 20-30 min.
- Vask cellene med 2 mL PBS gang, deretter med 2 mL Imaging middels to ganger. Endelig Pipetter 1 mL av fersk tenkelig middels til cellen rett og sett prøven tilbake i inkubator på 37 ° C og 5% CO2 minst 1t. Før bildebehandling, utveksle tenkelig mediet igjen.
Merk: Når du kjører eksperimentet for første gang, Bekreft riktig målretting av selv merket proteiner til organellar membraner av flekker organeller med kommersielt tilgjengelig organelle bestemt fargestoffer27,28. I dette tilfellet også bruke 100-200 nM i substrat for selv merking enzymer for å produsere sterke signaler.
-
Utarbeidelse av et fluorescerende perle utvalg
Merk: For å fastslå den optiske drift og justere bilder av de ulike kanalene, brukes multi-farge fluorescerende perler (0,1 µm). Med de innspilte bildene genereres en vridning transformasjon matrise for to utslipp kanaler.- Fortynne løsning av perler til 1% med ren H2O.
- Sted 5 dråper løsningen med fluorescens perler fem forskjellige posisjoner på en renset dekkglassvæske (se trinn 1.3).
- La fluorescerende perle prøven tørr på en ren benk.
Merk: Utvalget kan gjenbrukes; Derfor dekk utvalget med aluminiumsfolie å unngå forurensning og holde det på 4 ° C.
2. mikroskopi
-
Eksperimentelle oppsett
Merk: En grunnleggende mikroskopi system for to-farge ett molekyl imaging er basert på en invertert mikroskop: det er utstyrt med to laser koplet via en multi-mode-optiske polarisering opprettholde monomode fiber i en enkelt totale interne refleksjon (TIR) kondensatoren, et oljeobjektiv for nedsenking utformet for TIRF, en polyband utslipp filtre, et bilde splitter og et svært sensitive kamera (figur 1). En TIR kondensator er nødvendig som tillater kontinuerlig tuning av hendelsen vinkelen bytte mellom den epi-, svært tilbøyelig og laminert optisk ark (svært tilbøyelig tynn belysning (HILO)29) og TIRF eksitasjon modus med optimalisert gjennomtrenging dyp. Bilder er kjøpt med en svært sensitiv avkjølt detektor, f.eks en rygg-opplyst elektron multiplisere belastet koplede enhet (EMCCD) kamera (quantum effektivitet QE > 90%) eller et sCMOS kamera (QE > 80-90%).- Bestemme den optiske drift av imaging fluorescerende perler (se trinn 2.2) under samme vilkår som de som senere skal brukes for eksperimentet, f.eksnår 10.000 rammer registreres i eksperimentet, posten også 10.000 rammer med perle prøven. For bestemmelse av den optiske drift, kan du sammenligne plasseringen av perlene i den første rammen og siste ervervet rammen (figur 1B). Eventuelt senere korrigere bildet serien for optisk drift30 og/eller bruke drift stabil miljøer.
- Utstyre filter kuben med den aktuelle dichroic stråle splitteren, f.eksfor oransje og røde fluorescens pluss tilstrekkelig utslipp filtrene for oransje fluorescens og røde fluorescens. Utstyre bilde splitter med egnet filtrene. Sjekk for mulige lekkasjen av signaler kanal til den andre kanalen ved enkelt fargeeksemplene i begge kanaler (figur 1 c).
Figur 1 : Optisk oppsett for multi-farge sporing og lokalisering mikroskopi (TALM) med oransje og rød emittere. (A) Inverted mikroskop oppsett med minst to eksitasjon lasere, en TIRF kondensator, en TIRF egnet målsetting, et bilde splitter og en følsom kamera. Innfelt: opphisse organeller i cellene, vinkelen på hendelsen strålen angis mindre enn den kritiske vinkelen for TIRF å oppnå svært lyst og laminert optisk ark belysning (HILO). DC1: Dichroic speil 1; Dc2: Dichroic speil 2. EF: utslipp filter. (B) Test på optisk drift av imaging plasseringen av en fluorescerende perle for 10.000 rammer med samme bildefrekvens som følgende eksperimenter (her: 15 Hz). Tilkoblede stillinger de første 500 rammene og de siste 500 bildene viser drift. Også et sammenslått bilde med plasseringen av først og den siste rammen i rødt og blått viser en minimal drift. Drift er avstanden mellom sentrum av signaler delt på total innspillingstid, her 125 pm/s. (C) sjekk på klart separasjon av signaler, her TMR og SiR. For begge kanaler, ble kumulativ sum bilder fra 3000 rammer (TMR i kanal 1) og SiR i kanal 2 generert. SiRHTL ble knyttet til Tom20-HaloTag og TMRHTL å OxPhos komplekse V-HaloTag. Fargene er falske farger. Skalere barer = 100 nm (B) og 1 µm (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
Fysiske innrettingen av bilde splitter genererte bilder
Merk: For montering prøven forberedt på en dekkglassvæske, en Self-Made sample-holder kan være brukt (figur 2A). For å unngå støv, etc. falle i prøven, plassere lokket på kultur parabol løst på toppen kammeret, når montert. Den samme utvalg-holderen kan brukes å montere dekkglassvæske med fluorescerende perler eller celler. Når cellene er fotografert, Legg til 0,5-0,8 mL Imaging medium. Bilde splitter deles bildet i to eller flere spectrally atskilt kanaler og prosjekter dem side ved side på samme kamera. Denne prosessen potensielt introduserer systematisk skjevheter mellom kanalene på grunn av forskjellige optisk veier krysset og hindrer direkte colocalization analyse. Derfor først utføre fysiske justering og andre, etter korrigering justering med en transformering matrise. For begge justering prosesser bør fluorescerende perler homogenously distribueres gjennom hele synsfeltet.- Montere forberedt prøven med fluorescerende perler i eksempel-holderen mellom polytetrafluoroethylene (PTFE)-ring og røde Gummiringen (figur 2A).
- Starte mikroskopet, alle maskinvarekomponenter og alle programvare trengs for mikroskopi.
- Rengjør målet og nederst i dekkglassvæske med en lofri vev tørke wetted med isopropanol. Tørk begge elementer med en frisk lofri vev. Plass en dråpe neddyppingsolje på elev av linsen.
- Plass prøven holderen med perle prøven på mikroskopet scenen slik at bunnen av dekkglassvæske kontakter olje. Fokus på perler med overføring lys eller en laser-linje.
- Justere de to eksitasjon lasere makt å oppnå lignende signal intensiteten i to fluorescens kanaler. Søke etter et område med mange forskjellige fluorescerende signaler.
- Generere en flettet visning av fluorescerende kanalene ved hjelp av kameraet Kontrollprogramvaren. Bruk skruer på bilde splitter å manuelt vippe interne speilene splitterens bilde å oppnå den beste overlappingen av signalene fra de to fluorescerende kanalene (figur 2B).
Merk: oppmerksomhet! Ikke overstige det dynamiske spekteret av kameraet.
-
Justering av spectrally atskilt kanaler av programvare utfører romlige transformasjon
Merk: Følgende del viser etter korrigering justering og lokalisering prosedyre med vår programvare plugin (tilgjengelig på forespørsel).- Start TIRF mikroskopet kontrollere programvare og vil vise individuelle kanaler i live stream-modus. Ta et snapshot bildet spennende fluorescens i alle kanaler (figur 2C).
- Bruk denne øyeblikksbilde for å produsere transformasjon matrix (se figur 2).
Merk: Transformasjon matrisen brukes for en romlig transformasjon, vanligvis en vridning en, som retter for oversettelse (divergens av signaler fra en enkelt kilde mellom to kanaler). - Starte programvare analyse plugin (kan fås på forespørsel fra våre lab, se figur 2C).
- Legg tidligere innspilte dual fargebilder (se trinn 2.2) av fluorescerende perler i programvaren. Velge brukte retning av fluorescerende kanalene. Klikk 'Ja' når spurt om 'kalibrere bilder' og velg tatt tidligere øyeblikksbilde.
- Åpne "Enheten MANAGER" for å definere enhet omregningsfaktorer (pikslers størrelse, bildefrekvens, Foton konverteringsfaktor).
- Åpne "lokalisering MANAGER". Bestemme punkt spredning funksjon (PSF) først. Trykk: "PSF radius". I "PSF Estimator" vinduet som åpnes, kan du definere numeriske blenderåpning og utslipp maksimal. Starte "anslag PSF radius" ved å klikke. Godta den fått eksperimentell PSF. definere boksen evaluering, deflasjon looper, og hvor mange kjerner på datamaskinen brukes til beregning. Trykk "stedfeste" for å starte passer intensiteten fordelingen av enkelt partikler av en 2D symmetrisk Gaussisk funksjon (figur 2C).
- "Godta" fått eksperimentell PSF. definere boksen evaluering, deflasjon looper, og hvor mange kjerner på datamaskinen brukes til beregning. Trykk "stedfeste" for å starte passer intensiteten fordelingen av enkelt partikler av en 2D symmetrisk Gaussisk funksjon (figur 2C).
- Åpne "kalibrering MANAGER". I det gjengitte sammenslåtte bildet av de to kanalene vises opprinnelige signaler og lokaliserte centers. Velge "vridning" modus. Manuelt koble tilsvarende parene av lokaliserte sentre i to kanaler som stammer fra den samme fluorescerende perlen ved å tegne en linje.
- Koble tilsvarende signalene distribuert over hele synsfeltet. Etter dette, trykk på "godta". Lagre kalibreringen.
Merk: Romlige transformasjonen er samplet på hver fluorescerende perle og interpolert i mellom. Funksjonen utdraget transformasjon representerer en forskyvning feltet Δr(x,y) som brukes til å korrigere senere eksperimentelle dual-farge ett molekyl steder slik at de overlegg i deres lokalisering presisjon. Romlig transformasjon matrix er vanligvis en vridning som korrigerer for oversettelse, skalering og rotasjon mellom kanaler med nanometer nøyaktighet, og det kan konkluderes fra denne manuelle tilordninger (figur 2C).
Figur 2 : Arbeidsflyt for dual farge justering. (A) dekkglassvæske med fluorescerende perler er montert i en prøve holder mellom en PTFE og en gummi ring. Deretter den øvre og nedre delen av kammeret er boltet sammen. (B) fysiske innrettingen av kanalen visninger som er generert av bilde splitter. Registrert fluorescerende signaler fra perler (0,1 µm) i to kanaler (grønn og rød, falske farger) flettes. De tilsvarende skruene optisk image splitter aktiveres manuelt til den beste overlappingen av ulike signaler er oppnådd (gul farge, nedre panel). (C) generering av en transformering matrise for post-processive kanal justering. Nøyaktig lokalisering av en partikkel er det nødvendig å bestemme punktet spredning funksjon (PSF) i avhengighet av utslipp bølgelengde og numeriske blenderåpning for målsettingen. Midten av eit PSF kan bestemmes av sin intensitet profil analysert av en symmetrisk todimensjonal Gaussian passer. Den resulterende lokaliseringen av signal toppen deretter projiseres på originalen, uklare signaler. I et sammenslått bilde koblet lokaliserte sentrene for signalene fra de to kanalene for å generere en transformering matrise som brukes senere til post-processive justeringen av eksperimentelle data. Skalere barer = 1 µm (B, C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
Ett molekyl imaging mitokondrie membran proteiner
Merk: Alle eksperimentene er utført ved romtemperatur. T-celler eller ikke-tilhenger celler må bli immobilisert i agarose før imaging31.- Montere prøven med tilhenger celler på dekkglassvæske mellom gummi og PTFE ringene (figur 3A). Fylle kammeret med 0,5-0,8 mL imaging medium.
- Gjenta trinn 2.2.2–2.2.5.
- Justere belysning vinkel TIRF mikroskopet kontrollere programvare for å lage en hendelse vinkel som er mindre enn den kritiske vinkelen for TIR modus å opphisse den spesifikke regionen rundt via en HILO ark32 (HILO modus, figur 1A).
FORSIKTIG: Unngå direkte øyekontakt med laserstrålen! - Angi EM forsterkningen og velger en eksponeringstid egnet for eksperimentet som samler nok fotoner per bilde.
- Sette laser makt å oppnå en høy signal til støy (S/N) forhold (figur 3B), siden lokalisering presisjonen samsvarer direkte med S/N33 (Figur 3 c).
- Finn et område i cellen periferien med ikke-overlappende, elongated mitokondrier og ett molekyl signaler (figur 3D; Supplerende Video 1). Hvis ingen enkelt molekyl signaler vises, vente til bleking resulterer i utseendet på ett molekyl signaler (figur 3E).
- Før antall signaler er for svakt til rimelig videreføring (vanligvis 1000-10.000 bilder avhengig av bleking virkemåten til fluorescerende fargestoff, figur 3F).
- Starte avbilding prosessering programvare og sjekk for mitokondrie strukturer ved å generere en kumulativ gjengitte sum bilde av minst 1000 registrerte rammer (Figur 3 g).
Merk: Raskeste mulig bildefrekvensen bestemmes av området avlesning. Synsfelt for en kanal er redusert med en dual-fargebilde splitter (512 x 512 piksler) til 256 x 512 bildepunkter, og for en Quad-farge til 256 x 256 piksler. Derfor, for å bruke et bilde splitter for to farger, dette er 30 Hz. sett overføringsmodusen ramme å oppnå lavest mulig avlesning tiden. - Starte programvare analyse plugin og Last rå data. Velge kanalen orientering og laste bildene. Bruk transformering matrise fra trinn 2.3.9 da bedt om "Kalibrer bilder". Kanaler vises separat.
- Åpne "enheten MANAGER" som før du definerer enhet omregningsfaktorer for hver kanal. Åpne "lokalisering MANAGER" for hver kanal. Definere boksen evaluering, antall deflasjon looper, Legg teoretisk PSF vilkår brukes og angi hvor mange kjerner på datamaskinen brukes til beregning. Trykk til slutt "stedfeste" for å få lokaliserte enkelt partikler (Figur 3 H; Supplerende Video 2).
- Merk at programmet vil endelig generere en kumulativ superresolution bilde viser lokalisert alle partikler (figur 3I).
- Utføre analyse, f.eksav åpen kildekode eller vår programvare som er tilgjengelig på forespørsel.
- Spore de enkelt molekylene i begge lokalisert kanaler, f.eksmed flere mål tracer10
Merk: Trinn 2.4.13 må innledende (eksperimentell) kunnskap om diffusibility av proteiner av interesse for betingelsene innstilt. Finne de riktige betingelsene er vanligvis en iterativ prosess.
Figur 3 : Trinnene under ett molekyl lokalisering mikroskopi. (A) A dekkglassvæske med prøven er montert mellom den øverste og nederste delen (grå) av hjemmelaget eksempel holderen (designet av J. Bereiter-Hahn). En gummi ring (rød) og en PTFE ring (hvit) forsegle systemet fra over og under dekkglassvæske, når prøve-holderen delene er bolt sammen. (B) Signal / støyforhold TMR signalet. (C) beregnet lokalisering presisjon histogrammet for alle lokaliserte partikler. (D) valg av et rimelig område for bildebehandling, her, celle periferi med tydelig atskilt mitokondrier. (E) opptak og bildebehandling: et enkeltbilde med forskjellige ett molekyl signaler vises (her, enkelt molekyler av CV-HaloTag/TMRHTL ble registrert). (F) intensitet av TMR over tid. (G) kumulativ sum bilde av 3000 rammer, ubehandlet. (H) partikler av CV-HaloTag/TMRHTL lokalisert med 2D Gaussisk funksjon fra et enkeltbilde. (jeg) kumulativ, gjengitt summen bildet viser alle lokaliserte CV-HaloTag/TMRHTL partikler fra 3000 rammer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multi-farge bildebehandling og colocalization analyse kan hjelpe deg for å finne den sub-organellar lokaliseringen av proteiner. Vi viste dette tidligere cytosolic fosfatase og tensin homologue, PINK1, som har forskjellige sub-Mitokondrielt steder på grunn av behandlingen av mitokondrie proteaser17. PINK1 er en viktig faktor garanterer mitokondrie funksjonalitet34,35. Å avgjøre lokaliseringen av PINK1 i forskjellige mitokondrie rom i sin behandling (figur 4A), multi-farge super-oppløsning mikroskopi med levende celler ble utført. Derfor PINK1 var genetisk smeltet sammen til en selv merking kode (HaloTag). For å avgjøre beliggenheten i forhold til andre proteiner i funksjonelle og dysfunksjonelle mitokondriene, ble Tom20, som en del av translocase på den ytre mitokondrie membran (TOM)36, merket med en annen selv merking kode (SNAPIN-koden). Tidsserier med minst 1.000 rammer (96 bilder per s) ble registrert. Kumulative bildet av alle signaler over tid kanal viste at PINK1 var lokalisert i stoffer og mitokondrier (figur 4B, venstre) under normale forhold, mens det ble beholdt på den ytre membranen av depolarized mitokondrier ( behandling med 10 µM av den uncoupler karbonyl cyanid m-klorofenyl hydrazine, CCCP, for 20 min). Tilsvarende bane kartene også vise denne forskjellen i spatio-temporale organisasjonen. Som summerte bildene lokalisert partikler avsløre, PINK1 distribueres hovedsakelig inne polarisert mitokondrier (figur 4C, venstre øvre panel), mens Tom20 er lokalisert i den ytre mitokondrie membranen (OM) (figur 4C, venstre nedre panel). Dette blir enda mer tydelig i det sammenslåtte bildet av lokaliserte Tom20 og PINK1 partikler, hvor fordelingen av ytre membran protein Tom20 er mye bredere (figur 4C, høyre panel).
Figur 4 : To farger super-oppløsning mikroskopi viser den subcompartmental lokaliseringen av PINK1 i mitokondrier. (A) hypotetiske PINK1 skytling og bearbeiding i mitokondrier. (B) lokalisering og bane kart fra PINK1 under normale forhold og depolarized mitokondrier. (C) to-farge super-oppløsning lokalisering mikroskopi å avsløre mitokondrie lokalisering av PINK1 i forhold til Tom20. Bilde rekke 1000 rammer med en bildefrekvens på 96 bilder per s. venstre øvre panel: lokalisering kart over PINK1 (merket via HaloTag med TMRHTL). Venstre nedre panel: lokalisering kart over Tom20 (merket via SNAPIN-koden med SiRBG). Høyre panel: flettingen kumulativ sum bilde av PINK1-TMR (rød) og Tom20-SiR (blå) steder. (D) samme data pluss steder av respiratoriske kompleks I (CI, grønn) i indre mitokondrie membranen. CI var smeltet til paGFP (CI-paGFP). Høyre: Mener tverrsnitt profilen Tom20 (blå), PINK1 (rød) og CI (grønn) fluorescens i området markant det sammenslåtte bildet. Mener tverrsnitt profilene ble innhentet av snitt 30 parallelle orientert cross linjer (intervall 40-nm). Tilpasset versjon gjengitt med tillatelse fra Beinlich et al. 16, copyright (2015) ACS kjemiske biologi. Alle farger er falske farger. Skalere barer = 1 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å bekrefte lokaliseringen av PINK1 i mitokondrier, en tredje ble protein lokalisert i indre mitokondrie membranen også avbildet. Derfor den 30 kDa delenhet i luftveiene komplekse jeg (CI) var smeltet til photoactivable GFP (paGFP) og registrert av FPALM4. Den kumulative trippel fargebilde og tverrsnitt fordelingen viser overlegget CI (grønn) og PINK1 (rød) (Figur 4 d), bekrefter import av full lengde PINK1. PINK1 har en N-terminal mitokondrie målretting sekvens og dermed etiketten ble satt på C-terminus av kinase. Co lokalisering med CI viser at full lengde PINK1 hadde blitt importert. Fluorescens fordelingen langs et tverrsnitt viser at en kvote PINK1 partikler tilsynelatende også colocalized med Tom20 i den ytre mitokondrie membranen. Sannsynligvis, er dette PINK1 forbundet med Tom20, som er import reseptoren. Som disse dataene viser, er flere mitokondrie mikro-rom okkupert av subpopulasjoner av PINK1. For å løse dette spørsmålet om sub-Mitokondrielt lokalisering av biokjemiske metoder ville være mye mer vanskelig, siden det ville kreve strenge sub fraksjoneres av forskjellige membraner og et klart skille løselig komponenter utelate kryssforurensning.
Supplerende Video 1: opptak av ett molekyl opptak, 100 rammer, CV-HaloTag/TMR HTL. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Video 2: lokaliserte data. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, ble en teknikk for to farger ett molekyl lokalisering av mobile membran proteiner presentert. Etter den protokollen, membran proteiner er smeltet å selv merking proteiner som reagerer med rhodamine fargestoffer TMR og SiR konjugert til deres respektive underlag. Rhodamine fargestoffer er lyse og photostable og dermed tillate repeterende tenkelig1. For vellykket forestilling må flere betingelser og viktige emner holdes i bakhodet.
Først er det viktig å velge riktige filtrene og splitters å skille signalene fra TMR og SiR klart. For å redusere bakgrunn fra utenfor cellen, var en precleaning og belegg av dekkglassvæske med PLL-PEG-RGD nyttig. Siste konsentrasjonen av fargestoff-underlaget må testes av vurderer slektskap av selv merking enzymet for sin substrat og tilgjengelighet av enzymet i cellen. Nano-til picomolar konsentrasjoner var tilstrekkelig for mitokondrie proteiner17 og stress granulater13. For andre organeller må de nødvendige konsentrasjonene testes. Hvis den flekker er for sterk i begynnelsen av innspillingen og ingen enkelt molekyler er lett gjenkjennelig, er det best å vente til bleking har redusert mengden av fluorescerende fargestoffer slik at avtegner enkelt partikler (SP). Vi har funnet at konsentrasjoner av fargestoffer høyere enn 30 nM for BG-underlag og 1 nM for HTL underlag under farging prosedyren, eller lengre flekker ganger for å øke antall merket molekyler, er ikke gjennomførbart. For hvert eksperiment, intensiteten av eksitasjon laseren har tilpasses, siden subcellular plasseringen av fargestoff påvirker fluorescens atferd (quantum avkastning, bleking, blinker)5 på grunn av ulike miljøforhold som pH og redoks staten3. Det må videre nevnes at bakgrunnen er høyere på to-farge eksperimenter sammenlignet med én farge bildebehandling. Dette påvirker presisjonen for lokalisering. Derfor er det avgjørende å optimalisere laser makt å oppnå god signal til støy (S/N) forhold, men lav photobleaching priser. Typisk laser makt tettheter i HILO mikroskopi er i størrelsesorden 25 ± 8 kW/cm2. For finjustering av eksitasjon kraft, kan ulike typer neutral density filter brukes hvis laserdioder er ikke direkte modulert og ikke modulert via en acousto-optiske modulator. Det anbefales å bruke spesielle 2 mm tykk speil for TIRF for å redusere strålen skjevheter. Spesielt under TIR og HILO forhold, er veldig effektivt blokkerer eksitasjon lys nødvendig. For ett molekyl bildebehandling og lokalisering med underpiksel nøyaktighet kreves en riktig romlige samplingfrekvens (Nyquist-Shannon sampling teoremet). Dette bør være dobbelt så høy som maksimal romlige frekvensen definert av oppløsning grensen av tenkelig system37. Bruke et oljeobjektiv nedsenking med en høy numeriske blenderåpning (NA > 1.4), oppløsning, d = λ / (2 × NA), er vanligvis på 200-250 nm for oransje til langt rødt fargestoffer. Dermed vurderer den fysiske pikselstørrelsen av detektor, forstørrelsen av tenkelig optikk skal resultere i en bildestørrelse pixel ca 100 nm. For en EMCCD kameraet med pixel størrelse på 16 x 16 µm2 i kombinasjon med en 150 X-målet, pikselstørrelsen er 106,7 nm og dermed tilstrekkelig.
Vanligvis er det foreslått bruk stabil transfekterte celler fordi dette har fordelen at en jevn mengde merket proteiner er uttrykt i de fleste av de celler24. Imidlertid to-farge lokalisering og spore eksperimenter, ville dette kreve en dobbel transfection og dobbel utvalg med forskjellige antibiotika. Derfor er det ofte mer mulig å transiently transfect en allerede stabil celle linje med en andre plasmider koding ytterligere merket protein av interesse.
For mitokondriene er bevegelse og fragmentering viktig. Fragmentert eller flytte organeller bør ikke registrert eller analysert. Bevegelse kan kontrolleres ved overliggende gjengitte bilder av lokaliserte molekyler fra begynnelsen og slutten av eksperimentet med to forskjellige farger (USANN). En homogen fordeling av signalene fra organeller i overlappingen angir at organeller ikke har flyttet. Vanligvis reduserer romtemperatur bevegelse av cellulære forbindelser og strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke biofysikk grupper og Jacob Piehler på universitetet Osnabrück for kontinuerlig støtte, Wladislaw Kohl for kundestøtte og utarbeidelse av materiale og CellNanOs styret for å gi mikroskop for bruk. Prosjektet ble finansiert av SFB 944.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
| Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
| EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
| Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 - 619 nm |
| Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 - 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
| Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
| Glutamine | Biochrom | #0951C | |
| HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
| Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
| Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Immersion Oil - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
| Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
| MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
| Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
| Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
| RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
| Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
| Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
| Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
| Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
| TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
| TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |
References
- Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
- Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).
- Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).
- Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. , Available from: https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences (2016).
- Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5 (8), (2008).
- Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).
- Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).
- Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. , (2018).
- Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).
- Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).
- Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).
- Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).
- Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).
- Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52 (2), 456-467 (1973).
- Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).
- Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5 (5), 455 (2008).
- Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).
- Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601 (2016).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
- Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).
- Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).
- Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
