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Biology

Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

doi: 10.3791/57690 Published: June 30, 2018

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la localizzazione di multi-colore delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule vive. Per allegare fluorofori, proteine self-etichettatura sono usate. Proteine, trova in scomparti di diverse membrane dell'organello stesso, possono essere localizzati con una precisione di ~ 18 nm.

Abstract

Conoscenza circa la localizzazione delle proteine in subcomparti cellulare è fondamentale per capire la loro funzione specifica. Qui, presentiamo una tecnica di Super-risoluzione che permette per la determinazione del microcompartments che sono accessibili per le proteine generando localizzazione e tracciamento di mappe di queste proteine. Inoltre, da microscopia localizzazione multi-colore, la localizzazione e tracciamento profili delle proteine in diversi subcomparti sono ottenuti simultaneamente. La tecnica è specifica per le cellule vive e si basa sull'imaging ripetitivo delle proteine di membrana mobile singolo. Le proteine di interesse sono geneticamente fuso con specifici, i cosiddetti self-etichettatura tag. Questi tag sono enzimi che reagiscono con un substrato in modo covalente. Coniugato di questi substrati sono coloranti fluorescenti. Reazione delle proteine enzima-etichetta con la fluorescenza etichettato risultati di substrati in proteine con etichettate. Qui, tetrametilrodamina (TMR) e silicio rodamina (SiR) vengono utilizzati come coloranti fluorescenti attaccati ai substrati degli enzimi. Utilizzando concentrazioni di substrato nel pM a Nm, Sub-stechiometrico etichettatura è raggiunto che si traduce in segnali distinti. Questi segnali sono localizzati con ~ 15 – 27 nm precisione. La tecnica permette per l'imaging multi-colore di singole molecole, per cui il numero di colori è limitato dalla disponibili coloranti membrana permeabile e il repertorio di enzimi con etichetta automatica. Per determinare la localizzazione dell'enzima di controllo di qualità (Pten) mostreremo la fattibilità della tecnica-indotta della chinasi 1 (PINK1) in diversi compartimenti mitocondriali durante l'elaborazione in relazione alle altre proteine di membrana. Il test per vere interazioni fisiche tra proteine diversamente con etichetta singole di singola molecola FRET o co-rilevamento è limitato, però, perché i gradi d'etichettatura Bassi diminuiscono la probabilità di avere due proteine adiacenti con l'etichetta allo stesso tempo. Mentre la tecnica è forte per l'imaging di proteine nei compartimenti di membrana, nella maggior parte dei casi non è opportuno determinare la localizzazione delle proteine solubili altamente mobile.

Introduction

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L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un metodo di imaging per localizzare e tenere traccia di proteine di membrana singola all'interno di cellule vive. Noi chiamiamo questo metodo di rilevamento e localizzazione microscopia (TALM)1,2. Come microscopia di ricostruzione ottica stocastica (tempesta)3 e microscopia a fluorescenza fotoattivazione localizzazione ((F) PALM)4,5, TALM è una tecnica di localizzazione singola molecola-basato fluorescenza. Tuttavia, è distinto in modo che la mobilità delle proteine di membrana in combinazione con formazione immagine ripetitiva dello stesso etichettato molecola alle diverse posizioni rivela la microcompartment che è accessibile per la proteina mobile. In altre parole, le possibili localizzazioni della proteina sono impostate dall'architettura dell'organello e dalla mobilità della proteina1. Il metodo è complementare a vari altri super-risoluzione tecniche6,7,8 , perché rivela la localizzazione e la traiettoria mappe dalle proteine mobile imaging. L'etichettatura è basato sull'utilizzo di proteine di fusione geneticamente ingegnerizzati che sono di per sé non fluorescenti. Queste proteine di fusione sono enzimi che reagiscono in modo covalente con un substrato coniugato a un colorante con etichetta automatica. Questa procedura ha il vantaggio che il grado d'etichettatura può essere controllata dalla quantità di substrato aggiunto. Inoltre, permette di variare il colore della fluorescenza, a seconda il colorante coniugato selezionato. Diversi auto-etichettatura degli enzimi-tag sono disponibili9. Un altro vantaggio dell'utilizzo di self-etichettatura degli enzimi-tag è, che le tinture coniugate sono solitamente più stabile e più proteine fluorescenti1 e singole proteine pertanto possono essere registrati più brillante e più precisamente fino a quando essi vengono sbiancati. Questo consente la registrazione delle traiettorie delle proteine cellulari e l'estrazione di diffusione coefficienti10,11.

Qui, noi dimostrare la fattibilità di TALM con proteine di membrana mitocondriale, ma può essere applicato anche per altre proteine di membrana intra - ed extracellulari, compresi tipi differenti delle cellule12,13. Mostriamo che multi-colore TALM ulteriormente consente la distinzione simultanea delle proteine in diversi subcomparti a complementazione a esistente super-risoluzione fluorescenza microscopia tecniche14,15, 16. TALM è compatibile con live cell imaging17. La foto-fisica del rhodamines selezionate tetrametilrodamina (TMR) e silicio-Rhodamien (SiR), in particolare loro luminosità e stabilità, permette di proteine di membrana singolo record in più fotogrammi fornendo mappe di localizzazione (e traiettoria). Tuttavia, TALM è limitata per la localizzazione delle proteine solubili con i coefficenti di diffusione alta poiché il motion blur è troppo alto e i fotoni raccolti per ogni frame sono troppo bassi per la corretta localizzazione. Inoltre, TALM richiede meno energia di eccitazione di ad esempio tempesta o svuotamento di emissione stimolata (STED) microscopia6,7, la riduzione di effetti fototossici. Questo è importante, poiché lo stress fototossico colpisce spesso organellari morfologia18 e così mobilità analisi19. In somma, presentiamo TALM multicolore in cellule viventi come una tecnica che colma una lacuna tra i metodi di microscopia di localizzazione STORM/STED/PALM (F) e le tecniche che analizzano la mobilità di proteine come il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP)20 ,21, fluorescenza correlazione spettroscopia (FCS)22e fluorescenza cross correlazione spettroscopia (FCC)11,23.

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Protocol

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Il seguente protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca istituzione locale.

1. metodi

  1. Coltura cellulare
    1. Coltivare le cellule, per esempio le cellule HeLa (carcinoma della cervice umana), in un matraccio di cultura cellulare T25 contenente 5 mL di medium di crescita a 37 ° C e 5% CO2.
      Nota: Per l'imaging, dividere le celle su preparati vetrini coprioggetti (Vedi punti 1.3 e 1.4) e tenere in mezzo di imaging.
  2. Transfezione delle cellule
    Nota: Utilizzare linee cellulari che esprimono stabilmente le proteine etichettate quando possibile24 per evitare forte sovraespressione. Per trasfezione transiente, adattare l'importo utilizzato per la transfezione del DNA del plasmide. Ad esempio, quando viene utilizzato il Ca2 + fosfato transfezione25 , transfect cellule (confluency di 80 – 90%) in una piastra di coltura cellulare di 3,5 cm con 2,5-5 µ g di DNA plasmidico. Quando si esegue la transfezione doppia, utilizzare 2,5 µ g per ogni costrutto di plasmide.
    1. Per gli esperimenti di doppio colore, utilizzare una linea cellulare con espressione stabile di una proteina self-etichettatura e transitoriamente transfect con il plasmide che codifica l'altre proteine self-etichettatura17.
      Nota: Qui, per esperimenti di doppio colore, cellule HeLa sono state usate che esprime stabilmente le proteine self-etichettatura PINK1-Halo-Tag e Tom20-fSNAP-Tag.
  3. Pulizia dei vetrini coprioggetti
    1. Posizionare i vetrini coprioggetti in un becher. Aggiungere 30 mL di H2O nel becher contenente i coprioggetti e agitare delicatamente per rimuovere la polvere dalla loro superficie.
    2. Raccogliere i coprioggetti con pinzette e asciugarle con un flusso di azoto.
    3. Rimuovere qualsiasi contaminazione organica sulla superficie delle lamelle, per esempio, dalla pulizia al plasma.
      Nota: Per evitare ulteriori contaminazioni del materiale vetro, indossare i guanti durante la manipolazione di lamelle.
      Attenzione: Quando le lamelle sono pulite di pulizia al plasma, solo il lato superiore delle lamelle è pulito; utilizzare questo lato per rivestimento con poli-L-lisina-polietilene glicole-arginina-glicina-aspartato (PLL-PEG-RGD) (sezione 1.4) e semina (punto 1.5) cellulare.
  4. Vetrino coprioggetti rivestimento con PLL-PEG-RGD
    Nota: PLL-PEG-RGD è un derivato di poli-L-lisina (PLL) collegato con un polietilene glicole (Da 3.000) ed un peptide (CGRGDS) cysteine-glycine-arginine-glycine-aspartate-serine. PLL si lega alla superficie del vetro caricato negativamente e forma un pennello di PEG. Questo riduce drasticamente il legame aspecifici di caricate coloranti fluorescenti. Inoltre, il motivo RGD imita il peptide di segnale del recettore integrina e promuove l'adesione integrina-mediata delle cellule che altrimenti non facilmente aderire in.
    1. Preparare PLL-PEG-RGD come descritto in precedenza26. In breve, sciogliere 0,8 mg di PLL-PEG-RGD in 1 mL di PBS. Aggiungere 10 µ l della soluzione PLL-PEG-RGD sul lato superiore di un vetrino coprioggetto pulito.
    2. Prendere un secondo vetrino coprioggetto e posizionarla con la sua superficie pulita upside-down sul primo vetrino coprioggetti (che ha la goccia di PLL-PEG-RGD sulla parte superiore); in questo modo che racchiude la soluzione PLL-PEG-RGD tra due vetrini coprioggetti.
    3. Posizionare i vetrini coprioggetti sandwich in un becher e incubare per 1 h a temperatura ambiente in un ambiente privo di polvere secco.
    4. Dopo 1 h, aggiungere 30 mL di H2O Becher per coprire integralmente i coprioggetti con acqua.
    5. Agitare delicatamente il bicchiere fino a lamelle staccano da altro.
    6. Utilizzare pinzette per raccogliere i coprioggetti fuori dall'acqua e asciugarli sotto un getto di gas azoto.
      Nota: Lamelle rivestite possono essere memorizzate in un bicchiere asciutto, sterile capsula di Petri con coperchio per un paio di giorni.
  5. Preparazione del campione per l'imaging
    1. Trasferire singole lamelle rivestite in una piastra di coltura cellulare di 35 mm, con la superficie ricoperta di PLL-PEG-RGD rivolta verso l'alto e aggiungere 2 mL di imaging medio sulla parte superiore.
    2. Aggiungi ~ 500.000 cellule tripsinizzate (200 – 500 µ l) che esprimono i tag auto-etichettatura presso le proteine di membrana rispettivi a 2 mL medio nella piastra di coltura delle cellule con il coprioggetto rivestito di imaging. Agitare delicatamente a mano per garantire una distribuzione omogenea delle cellule per ottenere un uniforme strato di cellule.
    3. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO2 sino al confluency di 80%.
      Nota: I campioni delle cellule dovrebbero essere seminati 3 giorni prima di formazione immagine e 1 giorno prima della trasfezione. Cellule, che esprimono stabilmente la proteina di interesse, possono essere seminate 2 giorni prima di formazione immagine. Più tardi, solo le cellule coltivate sul coprioggetto sono Imaging.
  6. Etichettatura di proteine etichettate
    Nota: Substrati più fluorescente devono essere sciolto in DMSO privo di acqua. Si consiglia di utilizzare soluzioni di riserva di substrato fluorescente di 1 µM, quando la concentrazione di etichettatura finale è di 0,2 – 30 nM17. Per l'imaging di proteine di membrana all'interno delle cellule, utilizzare substrati fluorescenti permeabile di membrana.
    1. Riscaldare a 37 ° C in un bagno d'acqua medio imaging.
    2. Pipettare 1 mL di terreno imaging pre-riscaldato in una provetta da 2 mL con coperchio. Aggiungere 0,2 – 30 µ l di substrati fluorescenti dalle soluzioni di riserva di 1 µM per preparare la soluzione di etichettatura finale (concentrazione finale: 0,2 – 30 nM).
    3. Vortex la soluzione di etichettatura per 10 s.
    4. Sostituire il mezzo nella piastra di coltura di 35mm con le cellule su un vetrino coprioggetti (Vedi punto 1.5) da 1 mL di preparato soluzione di etichettatura.
    5. Incubare le cellule nella soluzione di etichettatura a 37 ° C e 5% di CO2 per 20 – 30 min.
    6. Lavare le cellule con 2 mL di PBS una volta, poi con 2 mL di mezzo di imaging due volte. Infine, Pipettare 1 mL di terreno nuovo imaging per il piatto di cella e rimettere il campione in incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per almeno 1 h. Prima di formazione immagine, scambiare ancora una volta il mezzo di imaging.
      Nota: Quando si esegue l'esperimento per la prima volta, confermare la corretta destinazione di self-etichettate proteine alle membrane organellari macchiando gli organelli con coloranti specifici disponibili in commercio organello27,28. In questo caso, anche uso 100 – 200 nM del substrato per gli enzimi auto-etichettatura per produrre segnali forti.
  7. Preparazione di un campione di perlina fluorescente
    Nota: Al fine di determinare la deriva ottica e per allineare le immagini dei diversi canali, multi-colore perline fluorescenti (0,1 µm) sono usati. Con le immagini registrate, verrà generata una matrice di trasformazione affine per i canali di due emissione.
    1. Diluire la soluzione di perline all'1% con pura H2O.
    2. Posto 5 gocce della soluzione preparata con le perline di fluorescenza in cinque posizioni diverse su un vetrino coprioggetti pulito (Vedi punto 1.3).
    3. Lasciare il campione di perlina fluorescente asciugare su un banco pulito.
      Nota: Il campione può essere ri-utilizzato; di conseguenza, coprire il campione con foglio di alluminio per evitare la contaminazione e tenerlo a 4 ° C.

2. microscopia

  1. Messa a punto sperimentale
    Nota: Un sistema di microscopia di base per l'imaging di doppio-colore singola molecola si basa su un microscopio invertito: è dotata di due laser accoppiato tramite una polarizzazione multi-mode-ottico mantenendo le fibre monomodali in una singola riflessione interna totale (TIR) condensatore, un obiettivo a immersione in olio progettato per TIRF, un filtri di emissione polyband, uno splitter di immagine e una fotocamera altamente sensibili (Figura 1). Un condensatore TIR, è necessario che per la regolazione continua dell'angolo incidente permette di passare tra la epi-, fortemente inclinato e foglio laminato ottico (illuminazione sottile ed inclinata (HILO)29) e la modalità di eccitazione TIRF con ottimizzato profondità di penetrazione. Immagini sono acquisite con un sistema di sensore raffreddato altamente sensibili, ad esempio, un retro-illuminato elettrone moltiplicando addebitato fotocamera dispositivo accoppiato (EMCCD) (efficienza quantica QE > 90%) o una fotocamera sCMOS (QE > 80 – 90%).
    1. Determinare la deriva optical imaging perline fluorescenti (Vedi punto 2.2) alle stesse condizioni come quelle che saranno successivamente utilizzati per l'esperimento, per esempio, quando 10.000 fotogrammi vengono registrate nell'esperimento, registra anche 10.000 fotogrammi con il campione della perla. Per la determinazione della deriva ottica, confrontare la posizione delle perle nel primo fotogramma e l'ultimo fotogramma acquisito (Figura 1B). Se necessario, dopo la serie di immagini per ottica deriva30 di correggere e/o utilizzare ambienti stabili deriva.
    2. Dotare il cubo di filtro con il divisore di fascio dicroico appropriato, ad esempio, per fluorescenza arancia e rosso, più i filtri di adeguata emissione per fluorescenza arancio e fluorescenza rossa. Dotare lo splitter di immagine con i filtri adatti. Per verificare la possibile perdita dei segnali da un canale in altro canale singolo colore campioni registrati in entrambi i canali (Figura 1).

Figure 1
Figura 1 : Layout ottico per microscopia rilevamento e localizzazione multi-colore (TALM) con emettitori di arancione e rossi. (A) installazione di microscopio invertito con almeno due laser di eccitazione, un condensatore TIRF, un obiettivo adatto TIRF, uno splitter di immagine e una telecamera sensibile. Inserto: per eccitare gli organelli all'interno delle cellule, l'angolo del fascio incidente deve essere impostato più piccola di quanto l'angolo critico per TIRF raggiungere altamente inclinata e laminato illuminazione ottica foglio (HILO). DC1: Specchio dicroico 1; DC2: Specchio dicroico 2. EF: filtro di emissione. (B) prova su ottica deriva da posizioni di una perlina fluorescente per 10.000 fotogrammi con lo stesso frame rate a partire dai seguenti esperimenti di imaging (qui: 15 Hz). Collegato posizioni dei primi 500 telai e l'ultima 500 fotogrammi mostrano la deriva. Inoltre, un'immagine unita con la posizione del primo e l'ultimo frame in rosso e blu mostrano una minima deriva. La deriva è che la distanza tra il centro dei segnali diviso per il tempo di registrazione totale, qui 125 pm/s. (C) Check sulla netta separazione dei segnali, qui TMR e SiR. Per entrambi i canali, sono state generate immagini somma cumulativa di 3.000 fotogrammi (TMR nel canale 1) e SiR nel canale 2. SiRHTL è stato fissato a Tom20-HaloTag e TMRHTL a OxPhos complesso V-HaloTag. I colori sono falsi colori. Scala bar = 100 nm (B) e 1 µm (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Immagini generate allineamento fisico dell'immagine splitter
    Nota: Per il montaggio del campione preparato su un vetrino coprioggetti, un self-made supporto del campione può essere utilizzato (Figura 2A). Per evitare la polvere, ecc. che rientrano nel campione, collocare il coperchio della piastra di coltura senza bloccare sopra la camera, quando montato. Il supporto del campione stesso può essere utilizzato per montare il vetrino coprioggetto con perline fluorescenti o cellule; Quando le cellule sono immaginate, aggiungere 0,5 – 0,8 mL di mezzo di imaging. L'immagine splitter divide l'immagine in due o più spettralmente separati canali e loro side-by-side proietta la stessa fotocamera. Questo processo potenzialmente introduce distorsioni sistematiche tra i canali a causa di distinti percorsi ottici attraversati e ostacola l'analisi diretta di colocalizzazione. Pertanto, in primo luogo eseguire allineamento fisico e secondo, post-correzione allineamento con una matrice di trasformazione. Per entrambi i processi di allineamento, perline fluorescenti devono essere distribuiti omogeneamente in tutto il campo visivo.
    1. Montare il campione preparato con le perline fluorescenti in supporto del campione tra il politetrafluoroetilene (PTFE)-anello e l'anello di gomma rossa (Figura 2A).
    2. Avviare il microscopio, tutti i componenti hardware e tutti i software necessari per microscopia.
    3. Pulire l'obiettivo e la parte inferiore del coprivetrino con un panno di tessuto panno imbevuto di isopropanolo. Poi asciugare entrambi gli elementi con una salvietta fresca. Mettere una goccia di olio per immersione sulla pupilla della lente dell'obiettivo.
    4. Posizionare il portacampioni con il campione di tallone sul palco microscopio in modo che la parte inferiore del coprivetrino contatti l'olio. Concentrarsi sui branelli di trasmissione della luce o una linea laser.
    5. Regolare la potenza dei due laser di eccitazione per raggiungere intensità di segnale simile nei due canali di fluorescenza. Cerca una località con molti distinti segnali fluorescenti.
    6. Generare una visualizzazione unita dei canali fluorescente utilizzando il software di controllo della telecamera. Quindi utilizzare le viti a immagine splitter per inclinare manualmente gli specchi interni dello splitter immagine per ottenere la migliore sovrapposizione dei segnali dai due canali fluorescenti (Figura 2B).
      Nota: attenzione! Non superare la gamma dinamica della fotocamera.
  2. Allineamento dei canali spettralmente separati dal software eseguendo la trasformazione spaziale
    Nota: La parte seguente mostra la post-correzione allineamento e la procedura di localizzazione con il nostro plugin software (disponibile su richiesta).
    1. Avviare il microscopio TIRF software di controllo e scegliere di visualizzare singoli canali in modalità streaming. Prendere una fluorescenza di emozionante immagine snapshot in tutti i canali (Figura 2).
    2. Utilizzare questa immagine snapshot per produrre la matrice di trasformazione (Vedi Figura 2).
      Nota: La matrice di trasformazione viene utilizzata per una trasformazione spaziale, in genere uno affine, che corregge per la traduzione (divergenza dei segnali da una singola fonte di punto tra i due canali).
    3. Avviare il plugin di analisi del software (possono essere ottenute su richiesta dal nostro laboratorio, Vedi Figura 2).
    4. Caricare le immagini registrate in precedenza doppio colore (Vedi punto 2.2) di perline fluorescenti nel software. Scegliere l'orientamento usata dei canali fluorescenti.  Selezionare 'Sì' quando chiesto 'calibrare immagini', quindi selezionare l'istantanea precedentemente assunto.
    5. Aprire "Gestione unità" per definire i fattori di conversione unità (dimensione dei pixel, frame rate, fattore di conversione del fotone).
    6. Aprire il "MANAGER di localizzazione". Determinare che il punto di diffusione prima funzione (PSF). Premere il pulsante: "Raggio di PSF". Nella finestra "PSF Estimator" che si apre, definire l'apertura numerica e l'emissione massima. Avviare "stima PSF raggio" facendo clic su. Accettare lo sperimentali ottenuti FPF. definire la casella di valutazione, il numero di cicli di deflazione, e quanti core del computer sono utilizzati per il calcolo. Premere "localizzare" per avviare la distribuzione di intensità delle singole particelle di montaggio di una funzione gaussiana simmetrica 2D (Figura 2).
    7. "Accettare" la sperimentali ottenuti FPF. definire la casella di valutazione, il numero di cicli di deflazione, e quanti core del computer sono utilizzati per il calcolo. Premere "localizzare" per avviare la distribuzione di intensità delle singole particelle di montaggio di una funzione gaussiana simmetrica 2D (Figura 2).
    8. Aprire il "gestore di taratura". Nell'immagine renderizzata unita dei due canali, sono mostrati i segnali originali e i centri localizzati. Scegliere la modalità "affine". Connettersi manualmente coppie corrispondenti di centri localizzate nei due canali che hanno avuto origine dalla stessa perlina fluorescente tracciando una linea di connessione.
    9. Collegare i segnali corrispondenti distribuiti in tutto il campo visivo. Dopo questo, premere "accetta". Salvare la calibrazione.
      Nota: La trasformazione spaziale è campionata a ogni branello fluorescente e interpolata in mezzo. La funzione di trasformazione estratti rappresenta una Δr(x,y) di campo di spostamento che viene utilizzato per correggere successivamente le localizzazioni sperimentale dual-colore singola molecola, in modo che essi sovrapposizione all'interno della loro precisione di localizzazione. La matrice di trasformazione spaziale è in genere uno affine che corregge per la conversione, ridimensionamento e rotazione tra canali con precisione nanometrica, e si può dedurre da questo mapping uno a uno manuale (Figura 2).

Figure 2
Figura 2 : Flusso di lavoro per l'allineamento di doppio colore. (A) il coprioggetto con le perline fluorescenti è montato in un supporto del campione tra un PTFE e un anello di gomma. Quindi la parte superiore e inferiore della camera sono avvitati tra loro. (B) allineamento fisico delle visualizzazioni canale generati dal divisore di immagine. Registrato segnali fluorescenti dai branelli (0,1 µm) in due canali (verde e rosso, falsi colori) vengono unite. Le viti corrispondenti alle splitter ottico di immagine sono attivate manualmente fino ad ottenere la migliore sovrapposizione dei segnali diversi (colore giallo, pannello inferiore). (C) generazione di una matrice di trasformazione per l'allineamento del canale post-processive. Per la precisa localizzazione di una particella, è necessario determinare che il punto di diffusione di funzione (PSF) in dipendenza dalla lunghezza d'onda di emissione e l'apertura numerica dell'obiettivo. Il centro di un PSF può essere determinato dal relativo profilo di intensità analizzato da una gaussiana bidimensionale simmetrica in forma. La localizzazione il picco del segnale risultante è poi proiettata sui segnali originali, sfocati. In un'immagine unita, i centri localizzati dei segnali da due canali sono collegati per generare una matrice di trasformazione che viene successivamente utilizzata per l'allineamento post-processive dei dati sperimentali. Scala bar = 1 µm (B, C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Formazione immagine di singola molecola delle proteine di membrana mitocondriale
    Nota: Tutti gli esperimenti sono effettuati a temperatura ambiente. Le cellule T o cellule non aderenti devono essere immobilizzate in agarosio prima dell'imaging di31.
    1. Montare il campione con le cellule aderenti il coprivetrino tra la gomma e PTFE anelli (Figura 3A). Riempire la camera con 0,5 – 0,8 mL di mezzo di imaging.
    2. Ripetere i passaggi 2.2.2–2.2.5.
    3. Regolare il microscopio TIRF angolo di illuminazione controllo software per creare un angolo di incidenza è minore dell'angolo critico per la modalità di TIR eccitare la regione specifica di interesse tramite un HILO foglio32 (modalità di HILO, Figura 1A).
      Attenzione: Evitare il contatto visivo diretto con il raggio laser!
    4. Impostare il guadagno di EM e scegliere un tempo di esposizione adatto per l'esperimento che raccoglie sufficienti fotoni per ogni frame.
    5. Impostare la potenza del laser per raggiungere un alto segnale/rumore (S/N) rapporto (Figura 3B), dal momento che la precisione di localizzazione corrisponde direttamente al S/N33 (Figura 3).
    6. Trovare una zona nella periferia delle cellule con i mitocondri non sovrapposte, di forma allungati e segnali di singola molecola (Figura 3D; Complementare dei Video 1). Se nessun segnale di singola molecola sono visibile, attendere lo sbiancamento provoca la comparsa di segnali di singola molecola (Figura 3E).
    7. Registrare fino a quando il numero di segnali è troppo basso per ragionevole continuazione (solitamente 1.000 – 10.000 fotogrammi in base al comportamento d'imbianchimento della tintura fluorescente, Figura 3F).
    8. Avviare l'imaging elaborazione software e cerca strutture mitocondriali generando un'immagine somma cumulativa di rendering di almeno 1.000 fotogrammi registrati (Figura 3).
      Nota: Il più veloce possibile frame rate è dettato dalla zona di lettura. Il campo di vista per un canale è ridotto da un divisore di doppio-colore immagine (512 x 512 pixel) a 256 x 512 pixel e di un Quad-colore a 256 x 256 pixel. Così, per l'utilizzo di un'immagine splitter per due colori, questo è 30 Hz. impostare la modalità di trasferimento del telaio per ottenere il minor tempo possibile lettura.
    9. Avviare dati raw plugin e carico di analisi software. Selezionare le immagini di orientamento e carico di canale. Utilizzare la matrice di trasformazione dal passaggio 2.3.9 quando chiesto "Calibra immagini". Canali vengono visualizzati separatamente.
    10. Aprire "Gestione unità" come prima per definire i fattori di conversione di unità per ogni canale. Aprire il "MANAGER di localizzazione" per ogni canale. Quindi definire la casella di valutazione, numero di cicli di deflazione, aggiungere il PSF teorico per le condizioni utilizzato e impostare il numero di core del computer vengono utilizzato per il calcolo. Infine, premere il tasto "localizzare" per ottenere particelle singole localizzate (Figura 3 H; Complementare dei Video 2).
    11. Nota che il programma infine genererà un'immagine superresolution cumulativo Mostra tutte localizzate particelle (Figura 3I).
    12. Eseguire l'analisi, ad esempio, di software open source o il nostro software disponibili su richiesta.
    13. Traccia le singole molecole in entrambi i canali localizzati, ad esempio, con il tracciante multipla10
      Nota: Passaggio 2.4.13 necessita di conoscenza preliminare (sperimentale) circa la diffusibilità delle proteine di interesse per impostare correttamente le condizioni al contorno. Di solito, trovare le corrette condizioni di contorno è un processo iterativo.

Figure 3
Figura 3 : Passaggi durante la microscopia localizzazione singola molecola. (A), A coprire i vetrini con il campione viene montato tra la parte superiore e inferiore (grigio) del supporto del campione fatti in casa (progettato da J. Bereiter-Hahn). Un anello di gomma (rosso) e un anello in PTFE (bianco) sigillare il sistema da sopra e sotto il vetrino coprioggetto, quando le parti di supporto del campione sono bullone insieme. (B) rapporto segnale-rumore del segnale TMR. (C) calcolato istogramma di precisione di localizzazione per localizzate in tutte le particelle. (D) scelta di una regione ragionevole per l'imaging, qui, la periferia di cellule con i mitocondri chiaramente separate. (E) registrazione ed elaborazione di immagini: un singolo fotogramma con segnali distinti singola molecola è mostrato (qui, sono state registrate singole molecole di CV-HaloTag/TMRHTL ). Intensità di TMR (F) sopra il tempo di registrazione. (G) immagine somma cumulativa di 3.000 fotogrammi, non trasformati. (H) particelle di CV-HaloTag/TMRHTL localizzata con una funzione gaussiana 2D da un singolo fotogramma. (io) somma immagine mostrando tutte le particelle di CV-HaloTag/TMRHTL localizzate da 3.000 telai cumulativo, resa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

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Analisi di imaging e colocalizzazione di multi-colore può contribuire a determinare la localizzazione sub-organellari delle proteine. Abbiamo dimostrato questo in precedenza con la fosfatasi citosolica e tensin omologo, PINK1, che ha diverse sedi sub-mitocondriali dovute alla sua lavorazione da proteasi mitocondriale17. PINK1 è un fattore importante, garantendo la funzionalità mitocondriale34,35. Per determinare che la localizzazione di PINK1 in diversi compartimenti mitocondriali nel corso della sua elaborazione (Figura 4A), microscopia ad alta super-risoluzione multi-colore con cellule vive, che è stata effettuata. Pertanto, PINK1 geneticamente è stato fuso per un tag auto-etichettatura (HaloTag). Per determinare la localizzazione rispetto altre proteine nei mitocondri funzionali e disfunzionali, Tom20, come parte della traslocasi della membrana mitocondriale esterna (TOM)36, è stato taggato con un'altra etichetta self-etichettatura (SNAP-tag). Serie temporali con almeno 1.000 fotogrammi (96 fotogrammi al s) sono stati registrati. L'immagine cumulativo di tutti i segnali nel tempo da un canale mostrava che PINK1 è stata localizzata nel citosol e nei mitocondri (fig. 4B, pannello di sinistra) in condizioni normali, mentre esso è stato mantenuto presso la membrana esterna dei mitocondri depolarizzate ( trattamento con 10 µM di disaccoppiatore Carbonil cianuro m-clorofenil idrazina, CCCP, per 20 min). Le mappe di traiettoria corrispondente anche mostrano questa differenza nell'organizzazione spazio-temporale. Come rivelano le immagini sommate delle particelle localizzate, PINK1 è distribuito principalmente all'interno di mitocondri polarizzati (Figura 4, pannello superiore sinistro), mentre Tom20 è localizzata nella membrana mitocondriale esterna (OM) (Figura 4, pannello inferiore sinistro). Questo diventa ancora più chiaro nell'immagine unita di localizzata particelle Tom20 e PINK1, dove la distribuzione della proteina della membrana esterna Tom20 è molto più ampio (Figura 4, pannello di destra).

Figure 4
Figura 4 : Microscopia di Super-risoluzione di doppio colore mostrando la localizzazione subcompartmental di PINK1 in mitocondri. (A) supposto PINK1 spola ed elaborazione in mitocondri. (B) localizzazione e traiettoria mappe di PINK1 in condizioni normali e in mitocondri depolarizzati. (C) microscopia di localizzazione di Super-risoluzione Dual-color per rivelare la localizzazione mitocondriale di PINK1 in relazione Tom20. Serie di 1.000 fotogrammi registrati con un frame rate di 96 fotogrammi al pannello superiore sinistro s. di immagine: mappa di localizzazione di PINK1 (etichettato tramite HaloTag con TMRHTL). Pannello inferiore sinistra: mappa di localizzazione di Tom20 (etichettato tramite SNAP-Tag con SiRBG). Pannello di destra: immagine di somma cumulativa di Unione di PINK1-TMR (rosso) e localizzazioni Tom20-SiR (blu). (D), stessi dati più localizzazioni del complesso respiratorio mi (CI, verde) nella membrana mitocondriale interna. CI è stato fuso a paGFP (CI-paGFP). A destra: Significa profilo di sezione trasversale di Tom20 (blu), PINK1 (rosso) e fluorescenza di CI (verde) della regione contrassegnato della immagine unita. I profili di sezione trasversale media sono stati ottenuti facendo la media fino a 30 parallelo orientato croce linee (intervallo 40 nm). Versione adattata ristampato con il permesso di Beinlich et al. 16, biologia chimica ACS di copyright (2015). Tutti i colori sono falsi colori. Scala bar = 1 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per verificare la localizzazione di PINK1 all'interno di mitocondri, una terza proteina localizzata nella membrana mitocondriale interna anche era imaged. Di conseguenza, la subunità 30 kDa del complesso respiratorio mi (CI) è stato fuso a messo GFP (paGFP) e registrato da FPALM4. L'immagine di colore triple cumulativo e la distribuzione di sezione trasversale Mostra la sovrapposizione di CI (verde) e PINK1 (rosso) (Figura 4), confermando l'importazione di PINK1 full-length. PINK1 ha una sequenza targeting mitocondriale del N-terminale e così l'etichetta è stata messa al C-terminale della chinasi. Co-localizzazione con CI dimostra che l'intera lunghezza PINK1 era stato importato. La distribuzione di fluorescenza lungo una sezione trasversale che mostra una quota di PINK1 particelle apparentemente anche colocalized con Tom20 nella membrana mitocondriale esterna. Probabilmente, si tratta di PINK1 associato Tom20, che è il recettore di importazione. Come dimostrano questi dati, diversi micro-scomparti mitocondriale sono occupati dalle sottopopolazioni di PINK1. Per affrontare la questione della localizzazione sub-mitocondriali con i metodi biochimici sarebbe molto più difficile, poiché richiederebbe rigoroso Sub-frazionamento delle membrane differenti e una netta separazione delle componenti solubili per escludere contaminazione incrociata.

Supplementare Video 1: filmati di singola molecola registrazione, 100 fotogrammi, CV-HaloTag/TMR HTL. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare Video 2: dati localizzati. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

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Qui, una tecnica per la localizzazione di singola molecola di colore doppio delle proteine della membrana cellulare è stata presentata. Seguendo il protocollo, le proteine di membrana sono fuse a proteine che reagiscono con le tinture della rodamina TMR e SiR coniugato ai loro rispettivi substrati con etichetta automatica. Rodamina coloranti sono luminose e fotostabili e pertanto consentono di imaging ripetitivo1. Per performance di successo, alcuni condizioni e argomenti critici devono essere tenuti a mente.

In primo luogo, è importante scegliere filtri appropriati e divisori per separare i segnali da TMR e SiR chiaramente. Per ridurre il background di all'esterno della cella, era disponibile una Prepulitura e rivestimento del coprivetrino con PLL-PEG-RGD. La concentrazione finale del colorante-substrato deve essere testata da considerando l'affinità dell'enzima self-etichettatura per il substrato e l'accessibilità dell'enzima all'interno della cellula. Nano-ad picomolare concentrazioni erano sufficienti per proteine mitocondriali17 e stress granuli13. Per altri organelli, le concentrazioni necessarie devono essere testati. Se la colorazione è troppo forte all'inizio della registrazione e non singole molecole sono distinguibili, si consiglia di attendere fino a quando lo sbiancamento ha ridotto la quantità di coloranti fluorescenti affinché si possono distinguere singole particelle (SP). Abbiamo trovato che le concentrazioni dei coloranti più superiore 30 nM per BG-substrati e 1 nM per substrati HTL durante la procedura di colorazione, o più lunghi tempi di trattamento al fine di aumentare il numero di molecole con etichettate, non sono realizzabili. Per ogni esperimento, l'intensità del laser di eccitazione deve essere adeguata, poiché la posizione subcellulare della tintura influenza il suo comportamento di fluorescenza (rendimento quantico, sbianca, lampeggiante)5 a causa di diverse condizioni ambientali, quali pH e redox stato3. Inoltre va detto che lo sfondo è più elevato negli esperimenti di doppio-colore rispetto all'imaging di singolo colore. Questo influenza la precisione della localizzazione. Pertanto, è fondamentale per ottimizzare la potenza del laser per ottenere buon segnale/rumore rapporti (S/N) ma prezzo basso photobleaching. Densità di potenza tipico laser in microscopia HILO sono nella gamma di 25 ± 8 kW/cm2. Per la regolazione fine del potere di eccitazione, diversi set di filtri a densità neutra può essere utilizzato se non direttamente modulati e non modulati tramite un modulatore acusto-ottico diodi laser. È consigliabile utilizzare specchi spessore 2mm speciale per TIRF per ridurre le distorsioni del fascio. Soprattutto in condizioni di TIR e HILO, blocco molto efficiente della luce di eccitazione è necessaria. Per l'imaging di singola molecola e localizzazione con precisione dei subpixel, è necessaria una corretta frequenza di campionamento spaziale (teorema del campionamento di Nyquist-Shannon). Questo dovrebbe essere due volte alto come la massima frequenza spaziale definita dal limite di risoluzione del sistema imaging37. Usando un obiettivo a immersione in olio con un'alta apertura numerica (NA > 1.4), la risoluzione, d = λ / (2 × NA), è in genere a 200-250 nm per orange da' azocoloranti. Così, considerando le dimensioni di pixel fisici del rivelatore, l'ingrandimento dell'immagine ottica dovrebbe comportare una dimensione di pixel di immagine di circa 100 nm. Per una fotocamera EMCCD con una dimensione di pixel di 16 x 16 µm2 in combinazione con un obiettivo X 150, la dimensione dei pixel è 106.7 nm e quindi adeguata.

In genere, è suggerito per uso stabile transfettata le cellule perché questo ha il vantaggio che una quantità costante di etichetta proteine è espresso nella maggior parte delle cellule24. Tuttavia, per la localizzazione di doppio-colore ed esperimenti di rilevamento, ciò richiederebbe una doppia transfezione e doppia selezione con diversi antibiotici. Di conseguenza, risulta spesso più fattibile a transfect transitoriamente una linea cellulare già stabile con un plasmide secondo codifica l'ulteriore etichetta della proteina di interesse.

Per i mitocondri, il movimento e la frammentazione è una questione critica. Frammentato o organelli in movimento non deve essere registrato o analizzato. Movimento può essere controllato dagli sovrapposizione immagini di molecole localizzate dall'inizio e la fine dell'esperimento, con due colori diversi (false). Una distribuzione omogenea dei segnali da organelli nella sovrimpressione indica che gli organelli non sono spostati. In genere, temperatura ambiente riduce il movimento dei composti cellulari e strutture.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrei ringraziare il gruppo di biofisica e Jacob Piehler presso l'Università di Osnabrück per supporto continuo, Wladislaw Kohl per assistenza tecnica e preparazione del materiale e il Consiglio di CellNanOs per la fornitura di microscopi per l'uso. Il progetto è stato finanziato il 944 SFB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) Biochrom #1104E
DC1: Dichroid beam splitter  Chroma 640 dcxr NC506031
DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter Chroma zt405/488/561/640rpc discontinued
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) Sigma-Aldrich & Co. #RNBF8311
Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) Imaging medium
Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) Growth medium
EF: Emission filter quadbandpass AHF analysentechnik F72-866 Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
EMCCD camera Andor Andor iXON 897 EMCCD camera
Emission filter QuadView filter cubes, orange AHF analysentechnik F39-637 bandpass 582 - 619 nm
Emission filter QuadView filter cubes, red Chroma bandpass 655 - 725 nm (HQ 690/70)
FBS (Fetal bovine serum) superior Biochrom S0615
Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Thermo Fisher Scientific T7279 fluorescent microspheres
Glutamine Biochrom #0951C
HeLa cells  DSMZ ACC-57 Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks
Hela cells CI::paGFP, stable Muster et al., PLOSOne 2010
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Image splitter Photometrics Dual-View QV2 image splitter emission
Imaging processing software  ImageJ2 / Fiji freeware
Immersion Oil - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) Carl Zeiss Jena GmbH 444960-0000-000
Inverted epifluorescence microscope Olympus IX-71/73/83
Laser 561 nm, 200 mW CrystaLaser CL-561-200 561 nm emission
Laser 642 nm, 140 mW Omicron Luxx-642-140 642 nm emission
MATLAB MathWorks version R2013a
MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR Biochrom FG-0385
MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred Biochrom FG-0325
MitoTracker® Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 dye
MitoTracker® Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 dye
Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber Pointsource/Qioptiq KineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer  Rapp Polymere GmbH Tübingen coverslip coating
non-essential amino acids (NEAA) Biochrom #0802E
PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % Carl Roth GmbH Art No. 0263.1 coverslip coating
Penicillin/Streptomycin Biochrom #0122E
Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015
Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) Sigma-Aldrich & Co. Cat. No.P9155 coverslip coating
RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim coverslip coating / Intergrin receptor motif
Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL)  personal gift from Kai Johnson dye
Software analysis plugin self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück SLIMFAST 16g
Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar)  New England Biolab® S9105S dye
Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL)  Promega G8251 dye
TIRF condensor Olympus Cell^TIRF MITICO System TIRF condensor
TIRF microscope controlling software Olympus cellSens 1.12
TIRF objective Olympus 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO)
Trypsin/EDTA 10x Biochrom #0266
Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic  Carl Roth GmbH Art. No. HN57.1

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References

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Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo
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Appelhans, T., Beinlich, F. R. M., Richter, C. P., Kurre, R., Busch, K. B. Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57690, doi:10.3791/57690 (2018).More

Appelhans, T., Beinlich, F. R. M., Richter, C. P., Kurre, R., Busch, K. B. Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57690, doi:10.3791/57690 (2018).

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