大きな腱欠損を修復する組織設計されたコラーゲン移植片を用いた新規テノルラフィー縫合技術

Summary

本論文では、工学的コラーゲン移植片で満たすことにより、最大1.5cmの腱ギャップを修復するための in vitro および in in in これは、移植片が宿主組織に成熟するまで機械的負荷を取る改変縫合技術を開発することによって行われた。

Abstract

ドナーを容易に同定して使用できる部位は有限数であるため、腱移植片を有する大きな腱欠損の外科的管理は困難である。現在、このギャップは腱自動、アロ、ゼノ、または人工移植片で満たされていますが、それらを確保するための臨床的方法は、スケールのために動物に翻訳可能であるとは限りません。新しい生体材料を評価したり、コラーゲン1で構成される腱移植片を研究するために、腱端に合わせて操作された腱を維持するのに役立つ改変縫合技術を開発しました。これらの移植片の機械的特性は、天然腱より劣る。操作された腱を装填された修復の臨床的に関連するモデルに組み込むために、組織で設計された腱移植片をオフロードし、機械的に健全なネオ腱が形成されるまで 、生体内で の操作された腱の成熟と統合を可能にする戦略が採用されました。この手法は、コラーゲン1型組織を組み込んで腱構築物を作製した方法を用いて説明する。

Introduction

腱断裂は、外傷性裂傷や腱の過度の負荷などの外因性要因のために起こることがある。腱修復に置かれた外部引張力のために、ほとんどの腱修復技術で必然的にギャップが形成されます。現在、腱欠損/ギャップは、オート、アロ、ゼノ、または人工移植片で満たされていますが、その可用性は有限であり、ドナー部位は罹患率の源です。

コラーゲンなどの天然ポリマーから腱移植片を作製する組織工学的アプローチは、生体適合性であるという独特の利点を有し、細胞統合を容易にする重要な細胞外マトリックス(ECM)成分を提供することができる。しかし、フィブリラアライメントの欠如のために、工学的腱(ET)の機械的特性は、ネイティブ腱に劣っています。弱いコラーゲンの機械的特性を高めるために、真空下での物理的架橋、紫外線照射、および脱熱熱処理¹などの多くの方法が用いられている。また、リボフラビンとの化学的架橋を通じて、酵素的および非酵素的な方法は、インビトロ^2,3におけるコラーゲン密度およびヤング率を増加させた。しかしながら、架橋剤を添加することにより、コラーゲンの生体適合性が損なわれ、研究により、細胞生存率^3、4、5の33%の変化および40%の細胞生存率の損失が示されている。線形と機械的強度の漸進的な発生は、環状負荷⁶を介して得ることができる。しかし、これは効率的に取得することができます in vivo⁷.

ETが 生体内で 統合し、化学改変を必要とせずに強度を獲得するためには、安定化縫合技術を使用して弱い構造を所定の位置に保持する方法があります。ほとんどの腱の修復は、腱の端を一緒に保持するために縫合線の設計に依存しています。したがって、これらの既存の手法を変更すると、論理的なソリューション^8,9を提供できます。

1980年代までは、2本鎖の修復が広く使用されていましたが、最近の外科文献では、修復^10、11で4本のストランド、6本のストランド、あるいは8本のストランドの使用について記述されています。1985年、サベージは6つのアンカーポイントを持つ6本鎖縫合糸技術を説明し、4本のストランド¹²を使用するバネル縫合技術よりも有意に強かった。また、8本鎖の修理は、死体や車体の他のストランドよりも43%強いが、修理を正確に^{13、14、15、16}に再現することが技術的に困難になるため^、これらの修理は広く行われていない。したがって、より多くのコア縫合糸鎖は、修復された腱の生体力学的特性の比例的増加に関連する。しかし、縫合点の周囲に細胞生存率の喪失があり、過度の縫合による外傷は腱の障害にすることができ、腱治癒¹⁷を損なう可能性がある。縫合技術は、修復後の腱のパッピングを最小限に抑えるために、バランスがとれて比較的非弾性な強力な幾何学的修復を提供する必要があります。また、縫合糸の位置及び結び目の位置は、十分な強度の発生^{が得られる}まで、滑空、血液供給および治癒を妨げないように戦略的に配置^{されなければならない。}

破裂した腱の間に弱いET移植片または他の移植材料を確保するための実現可能性を確立するために、我々はそれが成熟し、徐々に生体内の宿主組織に統合できるように移植片をオフロードすることができる新しい縫合技術を開発した。

Protocol

注:実験設計と倫理的承認は、UCL機関審査委員会(IRB)から得られました。すべての実験は、欧州指令2010/63/EU(2013)の改正法を用いて、1986年の内務省の規制と動物のガイドライン(科学的手続き)法に従って行われました。ウサギは、名前の付いた獣医(NVS)によって定期的に、そして名前付き動物福祉官(NACWO)によって1日に2回検査されました(内務省のガイドラインと規制に従って)。彼らは安楽死するまで痛みの兆候を示さなかった。

1. 組織設計腱(ET)移植片の調製

1. コラーゲンヒドロゲルを作製するには、ラットテールコラーゲンタイプ1モノマーコラーゲン溶液(0.6%の酢酸2.15mg/mL、総タンパク質0.2%w/v)と10倍のミニマルエッセンシャル培地500μLを加えます。5 Mおよび1 M水酸化ナトリウムに対して、500 μLを加えて中和し、500 μLのダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)を加えます。
2. この溶液の5mLをカスタム構築された長方形の金型(33mm×22mm×10mm、120g重量)に注ぎます(図1)。マトリックスアセンブリ¹⁹を可能にするために、37 °CでCO₂インキュベーターに金型を保管し、5%CO2を15分間保持します。

2. 移植片の作製

1. 重合後、コラーゲンヒドロゲルを金型から取り出し、標準のプラスチック圧縮アセンブリに入れる(図2^A)19。
2. コラーゲンヒドロゲルを2枚の50μmナイロンメッシュシートの間に入れ、120g(全表面積^7.4cm2、これは1.6kPaに相当する圧力)の静的負荷を5分間塗布し、ヒドロゲルから間質流体を除去する(図2A)。ヒドロゲルから排出された流体を吸収するために、4層の濾紙を使用します。
3. 4層の圧縮ゲルを互いに重ねて巻き、15 mmセグメント(図2C)に切り分け、ETを製造します。
   注:16〜25週の新しいゼランドの白人男性ウサギが実験に使用されました。
4. ヒプノルム(0.3 mg/mL)の筋肉内(i.m)用量で動物を鎮静し、ペントバルビトンの過剰摂取を投与することによって安楽死させる。
5. 安楽死の直後に、両後足の毛を整えます。次いで、サイズ20の外科用ブレードで、脛骨後部(TP)腱を露出させるために、下脛骨領域の周りに9cmの切開を行う。
6. 同じ大きさの外科用ブレードを使用して、平均長さ70mmのラピンTP腱を物品化し、乾燥を避けるために実験プロセス中にPBSで湿潤を保ちます。

3. 新しいテノルラフィー技術の開発

注:縫合線( 材料表を参照)は非吸収性であり、合成線形ポリオレフィンであるポリプロピレンの等方晶晶性立体から作られています。コア連動縫合糸は主に3-0で構成され、末梢縫合糸は6-0であった。これらは、すべての実験で使用される2つの主な縫合糸でした。

1. 外科用ブレードで、中点でTP腱を切断します。腱の中央から腱の15mmセグメントを物品切り、ETコラーゲン移植片に置き換える(図2D)。3-0縫合糸をネイティブ腱端から近位に近くへ連動する(図3A)。
2. 3-0コア縫合糸を移植片の全長以上に渡し、切り取り端から遠ざかってインターロックします。
3. ETの両端をネイティブ腱に固定し、2本の腱端をカップリングすることで、周囲に6-0と連続して走る縫合糸を持つ(図3B)。これは、移植片がネイティブ腱²⁰に張力を置くことによって縫合糸上で容易に移動できるように行われる。
4. 上述のように縫合糸を確保した後、縫合糸の張力が適切であり、縫合糸全体にフラクシディ性がないことを手動で確認してください。

Representative Results

これは腱に見られる主要なタンパク質であるため、I型コラーゲンから作られたコラーゲン移植片を使用しました。これは、腱の総コラーゲンのほぼ95%を構成します;したがって、コラーゲンは、生体内腱を模倣するための理想的な特性をすべて示した^21,22.

本研究では、使用したI型コラーゲンをラット尾腱から抽出し、酢酸(2.15mg/mL)に溶解した。このコラーゲンを重合させるために、インビトロで水酸化ナトリウムで中和し、非架橋性異方性コラーゲン線維を形成した。このヒドロゲルは98%の流体を含み、製造中20分以内に生体内の生体組織を模倣することができます²³.しかし、このヒドロゲルは機械的に弱い。したがって、機械的特性を高めるために、我々は、圧縮度が上に加えられた重量に直接比例し、流体離脱表面(FLS)19から流体を放出する「プラスチック圧縮」と呼ばれる技術によってコラーゲンヒドロゲルの迅速な圧縮方法を開発した。

この移植片の螺旋転動は、その機械的特性^を19に増加させるが、移植片は、ネイティブ腱よりも著しく弱いままである。この問題に対処するために、我々は破裂した腱の端ではなく、近位的かつ遠位離れた縫合点を配置することによって、新しい改変縫合技術を開発した。したがって、修復の強度は縫合糸と縫合点上にあり、機械的に弱い腱移植片上ではありません。

開発された新規縫合技術の機能性を実証するために、ラピンTP腱を切除した。隙間は、6-0縫合糸で固定された長さ15mmの腱移植片で埋め、3-0のインターロックされた縫合糸を70mmに配置して負荷バリアとして機能させた(図3A)。修復の平均ブレーク強度は50.62±8.17 Nで、12.49±1.62 Nのコントロールケスラー修復のそれよりも有意に高かった(p<0.05)。 したがって、コア縫合糸長さと腱からの連動は腱からの抵抗に大きく影響し、より大きな力^24、25で故障することからの修理。

この抵抗は、早期の修復障害を引き起こした制御修復では不十分であり、腱上の20%以上のひずみ故障を引き起こしました。しかし、これは生理学的異常であり、生体内の腱は腱がそれほど伸びるのに十分なスペースがないために20%の緊張を受けることはありません。したがって、生体内モデルで縫合技術の実現可能性をテストするために、我々は、その時点で修復を行い、24.60±3.92 Nの平均ブレーク強度 ±を計算した。

図1:中和コラーゲンヒドロゲル(pH 7.4)(ピンク色)をステンレス金型に鋳造 ゲルを37°Cで20分間_CO2 インキュベーターに留めてフィブリロ生成を起こさせた。スケール バーは下部に表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:プラスチック圧縮工程(A) ナイロンメッシュの間に入れたコラーゲンヒドロゲルで、一定の静的負荷が120グラムに及ぶ。排水された流体を4層の濾紙で吸収した。矢印はゲルの流体離脱面(FLS)を示しています。 (B) 圧縮されたコラーゲンシートの4つの層を軸に沿って転がし、「操作された腱」(ET)を形成した。 (C)ET のセクションは腱を模倣するために15mmのセグメントに切断された。 (D) 腱欠損は、後脛腱の15mmセグメントを切除してネイティブ腱(NT)に作成され、その欠陥をETで満たした。このパネルは前の作品²⁶から変更されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:(A) 腱欠陥をETで充填し、6-0縫合糸で固定し、3-0連動4本の鎖縫合技術を30mm領域において移植片上に通過させた。ブロック矢印は縫合線の始点を示し、空白の矢印は縫合糸の終点を示します。このパネルは前の作品²⁶から変更されました。 (B) ラピンモデル内の空間で開発された縫合技術を行う可能性(inin) この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:機械的強度。(A) (B)機械式テスト出力 (エラーバー = SD; *p < 0.05, ボンフェローニ補正を伴う一方の ANOVA) の機械的テスト出力。このパネルは前の作品²⁶から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

本研究では、コラーゲンが天然ポリマーであるため、組織工学的I型コラーゲン移植片が腱移植片として選ばれ、様々な組織工学用途^27,28の生体材料として使用された_。また、コラーゲンは、腱の乾燥質量の60%を構成し、そのうち95%が1型コラーゲン^{21、29、30、31、32}である。 生着が成功するためには、移植片の機械的特性は、天然腱³³と理想的に一致する必要があります。しかし、現在の工学的手法では、ET(4.41 N)の機械的特性は、ネイティブ腱(NT)(261.08^N)33に対して著しく劣っている。これは、ネイティブ腱におけるコラーゲン線維の高度に組織化された階層的配置によるものとすることが提案され、これは、その機械的特性³⁴を設計し、一致させる課題であり続ける。我々は、コラーゲンヒドロゲル³³に圧縮の静的重量を適用することによって、ETマトリックスの密度を高めようとしました。しかし、腱の強度を獲得する建築の複雑さは、より複雑です。機械的強度を得る方法は、宿主の生物学的プロセスが細胞外マトリックスのリモデリングに作用することができるin vivoで最もよく達成されるのが間違いにあります。したがって、本研究では、現在の縫合技術を腱後修復として修正する別の戦略が採用されました。修復された腱移植片の機械的強度は、縫合技術^8,9に完全に依存する。したがって、既存の縫合技術を変更することで、細胞およびECM誘導リモデリングが新しいアプローチとして起こるまで、設計された腱移植片をオフロードすることができます。

現在までに腱を修復するために利用できる様々な縫合技術があり、どれもゴールドスタンダードではありません。しかし、変更されたケスラー縫合技術は、腱^35,36に対する閉塞性が低く、損傷を受けるため、腱の修復に広く使用されています。子羊の屈筋ジテナムプロファンダス筋腱は、6本鎖サベージ法で縫合した際に、ブレーク強度が51.3Nであると報告されたが、修正ケスラー縫合技術を用いた場合、ブレーク強度は69.0^N7であった。しかし、本研究では、15mmの腱ギャップをETで満たして修正ケスラー縫合技術で修復した場合、修復は12.49Nの破断強度で早期に失敗した(図4)。この低い値は、技術を臨床的に無関係にします。同様の知見は、ブタ屈筋修復腱モデルにおいてDe Witらによって報告されており、ケスラーの修復は、ガッピングが87%減少し、縫合プルアウト³⁸で修復が失敗した十字形修復と比較して15%のガッピングを減らすことによって縫合破で失敗したことを示唆している。したがって、機械的に弱いETを所定の位置に保持することができる別の強力な縫合技術が必要です。

ETの全長にわたって、反対側の腱の上に4つのコア縫合糸を使用して、新しい改変縫合技術が開発されました。これらの縫合糸は、各腱端から離れた距離で縫合材自体に連結された。これは主に、縫合糸結び目を等距離に置き、全ての縫合糸鎖に等しい負荷共有張力を置くことで、その機械的特性が³⁹に増加することが報告されているからである。バランスのとれた修復は、連続縫合糸を維持し、修理現場⁴⁰での圧縮を可能にするために修理をずらすことによって達成することができます。

本研究では、ウサギTP腱の長さ、幅、厚さはそれぞれ62.4mm、5mm、1.5mmであることを考慮して、外側のインターロックされた縫合糸に3-0の縫合糸を使用しました。6-0縫合糸はETを所定の位置に保持するために使用されました。我々は他の吸収性縫合材料を試したが、 それらはインビボ⁴¹の期間にわたって弱くなるので、それは適切ではないだろう。ポリプロピレン縫合糸が選択された主な理由は、モノフィラメントであり、非吸収性であり、負荷⁴²の下で構造的または緊張性の改変を引き起こさないからである。2-0から7-0まで全ての縫合糸をテストしましたが、3-0と6-0は実験 ²⁶の理想的な候補であることが判明しました。

4本鎖修復を用いた主な理由は、腱の正常な外科的縫合糸が細胞領域⁴³の形成をもたらすと報告されているので、破裂した腱の端部に過度の損傷を避けることであった。これは、腱に置かれた圧縮負荷から細胞が移行し、通常はこれらの細胞が引張負荷¹⁷の対象となることが原因であると仮定されている。縫合糸から離れた細胞のこの移行は、マトリックスを維持およびターンオーバーする細胞の貧弱さがあり、早期腱破壊¹⁷を引き起こす可能性があるので、マトリックスの弱体化を引き起こす可能性がある。我々は、4本鎖縫合糸11、12、44、45よりも2倍の強さのバイオメカニカルな縫合糸のストランドを使用することができます。 しかし、これらの修理は広く実施されておらず、その臨床的限界は現在^{13、14、15、16}で評価されている。

縫合糸結び目の配置は重要ですが、縫合糸を外部化することに対して、反対の議論があります。外表面に縫合糸を持つことは、腱滑車のような構造に対して潜在的にスナッグし、滑空を減らすことができます。研究では、縫合糸結び目が内部に配置されている領域は^、46の外側に縫合結ノットを有するケスラー修復と比較して滑空抵抗の減少を示した。イヌモデルで行われた研究は、力のより高い大きさで、修復の外側に位置し、腱の端から離れて位置する縫合糸結び目が、修復^47、48の中に位置するものと比較して生存していたと結論付けました。しかし、結び目を内部化すると、治癒腱の接触面が減少する可能性があります。腱を突き刺す縫合針から組織の損傷が生じるという考察もあり、より多くのパスが腱外傷⁴⁹の増加に関連する。

腱隙間の間にETを確保するために、腱およびETの縁に沿って縫合糸⁵⁰を走る標準が行われた。これは、細胞およびECM誘導再モデリングが⁵⁰に起こりうるまで、治癒の初期段階でETを所定の位置に保持するのに十分な強度の末梢縫合糸が必要であったために行われた。大きな問題は、NTとETの機械的特性の変動であり、ETはストレスシールドを受けましたが、早期ギャップ形成につながる可能性がありました。一方、水平マットレスイントラファイバー縫合糸^51、ハルステッド連続水平マットレス縫合糸^52、53、クロスステッチエピテンド修復技術^{54、55、56、57}またはランニングロック縫合糸58、59などのより安全な技術を適用^する それは壊れやすいのでETを破裂させたでしょう。このように、我々は、シンプルで、ETを全方向にそのまま保持する末梢縫合糸技術として、縫合糸を実行することを選択しました。

組織工学の観点から、この方法が1.5cmを超える腱隙間を埋めるのに使用できるかどうかを研究する必要があります。この移植片をヒト臨床試験で使用するには、臨床グレードのコラーゲンを開発することによって達成できるが、コラーゲンの異種源に対する免疫学的反応をさらに調査する必要がある。本明細書に記載されたプロトコルは、ブタラピンモデルで利用可能な解剖学的空間内で開発された縫合技術の実現可能性を確立する。この開発された縫合技術は、縫合点が近位的に、そして破裂した腱端から遠く離れて遠位距離を有するので、設計された腱移植片は負荷を取り除くことができる。したがって、それは成熟し、 インビボに統合することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat tail type 1 Collagen	First Link, Birmingham, UK	60-30-810
prolene sutures 6-0	Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.	EP8726H
prolene sutures 3-0	Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.	D8911
Whatman filter paper	SIGMA-ALDRICH	WHA10010155
Gibco DMEM, high glucose	Thermo Fisher Scientific	11574486
Nylon mesh	Plastok (Meshes and Filtration) Ltd.	NA