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Bioengineering

Uma nova técnica de sutura tenorrhaphy com enxerto de colágeno projetado por tecido para reparar defeitos grandes do tendão

Published: December 10, 2021 doi: 10.3791/57696
Automatic Translation
1,3, 2, 1
1Division of Surgery and Interventional Science, University College London, 2Blond McIndoe Laboratories, Division of Cell Matrix and Regenerative Medicine, MAHSC, University of Manchester, 3Department of Surgical Research, Northwick Park Institute for Medical Research, Northwick Park Hospital

Summary

Neste artigo, apresentamos um protocolo in vitro e in situ para reparar uma lacuna tendinosa de até 1,5 cm, preenchendo-a com enxerto de colágeno projetado. Isso foi realizado desenvolvendo uma técnica de sutura modificada para levar a carga mecânica até que o enxerto amadurecer no tecido hospedeiro.

Abstract

O manejo cirúrgico de grandes defeitos tendinosos com enxertos tendinosos é desafiador, pois há um número finito de locais onde os doadores podem ser facilmente identificados e usados. Atualmente, essa lacuna é preenchida com enxertos automáticos, alusões, xeno-, ou artificiais, mas os métodos clínicos para protegê-los não são necessariamente traduzíveis para os animais por causa da escala. Para avaliar novos biomateriais ou estudar um enxerto tendão composto por colágeno tipo 1, desenvolvemos uma técnica de sutura modificada para ajudar a manter o tendão projetado em alinhamento com as extremidades tendinosas. As propriedades mecânicas desses enxertos são inferiores ao tendão nativo. Para incorporar o tendão projetado em modelos clinicamente relevantes de reparo carregado, foi adotada uma estratégia para descarregar o enxerto tendão projetado por tecido e permitir a maturação e integração do tendão projetado in vivo até que um neocons tendão de som mecanicamente seja formado. Descrevemos esta técnica usando a incorporação do colágeno tipo 1 construção do tendão projetado por tecido.

Introduction

A ruptura do tendão pode ocorrer devido a fatores extrínsecos, como lacerações traumáticas ou carregamento excessivo do tendão. Devido às forças de tração externas colocadas em um reparo tendinoso, uma lacuna inevitavelmente se forma com a maioria das técnicas de reparação do tendão. Atualmente, os defeitos/lacunas do tendão são preenchidos com enxertos automáticos, alusões, xenose artificiais, mas sua disponibilidade é finita, e o site do doador é uma fonte de morbidade.

A abordagem projetada por tecidos para fabricar enxerto tendão a partir de um polímero natural, como o colágeno, tem a vantagem distinta de ser biocompatível e pode fornecer componentes vitais de matriz extracelular (ECM) que facilitam a integração celular. No entanto, devido à falta de alinhamento fibrilar, as propriedades mecânicas do tendão projetado (ET) são inferiores ao tendão nativo. Para aumentar as propriedades mecânicas do colágeno mais fraco, muitos métodos têm sido utilizados, como a ligação cruzada física sob vácuo, radiação UV e tratamentos dehidrotermais1. Além disso, através da ligação química com riboflavina, métodos enzimáticos e não enzimáticos aumentaram a densidade de colágeno e o módulo do Jovem do colágeno in vitro2,3. No entanto, adicionando agentes transversais, a biocompatibilidade do colágeno está comprometida, pois estudos mostraram uma alteração de 33% nas propriedades mecânicas e perda de 40% da viabilidade celular3,4,5. O acúmulo gradual de alinhamento e força mecânica pode ser obtido através do carregamento cíclico6; no entanto, isso pode ser adquirido eficientementei n vivo7.

Para que o ET se integre in vivo e adquira força sem a necessidade de alteração química, uma abordagem seria usar uma técnica de sutura estabilizadora para manter a construção mais fraca no lugar. A maioria dos reparos tendinosos dependem do projeto da sutura para manter as extremidades do tendão juntas; portanto, a modificação dessas técnicas existentes poderia fornecer uma solução lógica8,9.

Até a década de 1980, reparos de 2 fios eram amplamente utilizados, mas a literatura cirúrgica recente descreve o uso de 4 fios, 6 fios ou até mesmo 8 fios em reparo10,11. Em 1985, Savage descreveu técnicas de sutura de 6 fios com 6 pontos de ancoragem, e foi significativamente mais forte que a técnica de sutura bunnell que usa 4 fios 12. Além disso, os reparos de 8 fios são 43% mais fortes do que outros fios nos modelos cadáver e in situ, mas esses reparos não são amplamente praticados, pois torna-se tecnicamente difícil reproduzir os reparos com precisão13,14,15,16. Portanto, um maior número de fios de sutura do núcleo refere-se a um aumento proporcional das propriedades biomecânicas do tendão reparado. No entanto, há perda de viabilidade celular em torno dos pontos de sutura, e o trauma da sutura excessiva pode ser em detrimento do tendão, o que pode comprometer a cicatrização do tendão17. As técnicas de sutura devem fornecer um forte reparo geométrico equilibrado e relativamente inelástico para minimizar o escancaramento dos tendões após o reparo. Além disso, a localização da sutura e seus nós devem ser estrategicamente colocados para que não interfiram no deslizamento, no suprimento sanguíneo e na cicatrização até que o acúmulo de força adequada tenha sido obtido10,18.

Para estabelecer a viabilidade para garantir enxerto ET mais fraco ou outro material de enxerto entre o tendão rompido, desenvolvemos uma nova técnica de sutura que pode descarregar o enxerto para que ele possa amadurecer e gradualmente se integrar ao tecido hospedeiro in vivo.

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Protocol

NOTA: O desenho do experimento e a aprovação ética foram obtidos do Conselho de Revisão Institucional da UCL (IRB). Todos os experimentos foram realizados conforme regulamentação do Home Office e diretrizes da Lei de Animais (procedimento científico) de 1986 com legislação revisada da Diretiva Europeia 2010/63/UE (2013). Os coelhos foram inspecionados por um cirurgião veterinário nomeado (NVS) periodicamente e duas vezes por dia por um oficial de assistência e bem-estar animal nomeado (NACWO) (Conforme diretrizes e regulamentos do Home office). Eles não mostraram nenhum sinal de dor até serem eutanásiados.

1. Preparação do enxerto do tendão do tendão de tecido (ET)

  1. Para fabricar o hidrogel de colágeno, adicione 4 mL de solução de colágeno de cauda de rato tipo 1 (2,15 mg/mL em ácido acético de 0,6% com 0,2% w/v de proteína total) e 500 μL de 10x Minimal Essential Medium. Neutralize isso titulando contra hidróxido de sódio de 5 M e 1 M e adicione 500 μL do DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco.
  2. Despeje 5 mL desta solução em um molde metálico retangular construído sob medida (33 mm × 22 mm × 10 mm, 120 g de peso)(Figura 1). Mantenha o molde em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5% de CO2 por 15 minutos para permitir a montagem da matriz19.

2. Fabricação do Enxerto

  1. Após a polimerização, remova o hidrogel de colágeno do molde e coloque em um conjunto de compressão plástica padrão(Figura 2A)19.
  2. Coloque o hidrogel de colágeno entre duas folhas de malha de nylon de 50 μm e aplique uma carga estática de 120 g (área total de superfície 7,4 cm2, que é uma pressão equivalente a 1,6 kPa) durante 5 minutos para remover o fluido intersticial do hidrogel(Figura 2A). Use quatro camadas de papel filtro para absorver o fluido descarregado de hidrogéis.
  3. Use quatro camadas de géis comprimidos enrolados em cima um do outro (Figura 2B) e corte em segmentos de 15 mm(Figura 2C) para fabricar o ET.
    NOTA: Novos coelhos brancos da Zelândia de 16 a 25 semanas foram usados nos experimentos.
  4. Seda animais com uma dose intramuscular (i.m.) de Hipnorm (0,3 mg/mL) e eutanásia administrando uma overdose de pentobarbitona.
  5. Imediatamente após a eutanásia, corte o cabelo em ambas as patas traseiras. Em seguida, com uma lâmina cirúrgica tamanho 20, faça uma incisão de 9 cm ao redor da área tibiofibular inferior para expor o tendão tibialis posterior (TP).
  6. Com a mesma lâmina cirúrgica de tamanho, extirpa os tendões de lapina TP com um comprimento médio de 70 mm e mantenha-se úmido em PBS durante o processo experimental para evitar a secagem.

3. Desenvolveu técnica de tenorrhaphy

NOTA: As suturas (ver Tabela de Materiais) são inconfundíveis e feitas a partir de um esteremos estereomer cristalino isotítico de polipropileno, que é um poliolefina linear sintético. As suturas de intertravamento do núcleo consistiam principalmente de 3-0 e as suturas periféricas eram 6-0. Estas foram as duas principais suturas usadas em todos os experimentos.

  1. Com uma lâmina cirúrgica, corte o tendão TP no ponto médio. Extire um segmento de 15 mm do tendão a partir do meio do tendão e substitua-o pelo enxerto de colágeno ET(Figura 2D). Entrelaça a sutura 3-0 proximally longe das extremidades do tendão nativo(Figura 3A).
  2. Passe as suturas do núcleo 3-0 acima de toda a extensão do enxerto e entrelaçadamente longe da extremidade do corte.
  3. Segure as duas extremidades do ET ao tendão nativo com 6-0 e suturas contínuas em torno da periferia, acoplando duas extremidades tendinosas(Figura 3B). Isso é feito para que o enxerto possa ser movido facilmente na sutura, colocando tensão no tendão nativo20.
  4. Depois de fixar a sutura como descrito acima, certifique-se manualmente de que a tensão nas suturas é apropriada e que não há flacidez na totalidade da sutura.

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Representative Results

Usamos enxertos de colágeno fabricados a partir do colágeno tipo I, pois esta é a proteína predominante encontrada no tendão. Constitui quase 95% do colágeno total no tendão; portanto, o colágeno expôs todas as propriedades ideais para imitar o tendão in vivo21,22.

Neste estudo, o colágeno tipo I utilizado foi extraído do tendão da cauda de rato e dissolvido no ácido acético (2,15 mg/mL). Para polimerizar este colágeno, foi neutralizado com hidróxido de sódio in vitro, que formou fibrilas anisotrópicos não transversais. Este hidrogel contém 98% de fluido e pode imitar tecido vivo in vivo dentro de 20 minutos durante a fabricação23. No entanto, este hidrogel é mecanicamente fraco; portanto, para aumentar as propriedades mecânicas, desenvolvemos um método de compressão rápida do hidrogel de colágeno por uma técnica conhecida como 'compressão plástica', onde o grau de compressão é diretamente proporcional ao peso aplicado na parte superior e liberado fluido da superfície de saída do fluido (FLS)19.

O rolamento em espiral deste enxerto aumenta suas propriedades mecânicas19,mas o enxerto permanece significativamente mais fraco que o tendão nativo. Para abordar esta questão, desenvolvemos uma nova técnica de sutura modificada colocando pontos de sutura, não na borda dos tendões rompidos, mas proximicamente e distally afastados. Assim, a força do reparo está nas suturas e pontos de sutura e não no enxerto tendão mecanicamente mais fraco.

Para demonstrar a funcionalidade da nova técnica de sutura desenvolvida, um tendão lapino TP foi extirpado. A lacuna foi preenchida com um enxerto tendão longo de 15 mm, assegurado com suturas 6-0, e suturas intertravadas de 3-0 foram colocadas a 70 mm para atuar como barreiras de carga(Figura 3A). A média de quebra de força de reparo foi de 50,62 ± 8,17 N, que foi significativamente maior(p < 0,05) do que o reparo kessler de controle de 12,49 ± 1,62 N(Figura 4A). Assim, o comprimento da sutura do núcleo e seu entrelaçamento longe do tendão terminam significativamente influenciam a resistência do tendão e os reparos de falhar em forças de maior magnitude24,25.

Essa resistência foi inadequada nos reparos de controle que causaram falha no reparo precoce e falha de tensão de mais de 20% no tendão. No entanto, trata-se de uma anomalia fisiológica, pois os tendões in vivo nunca estão sujeitos a 20% de tensão devido à não haver espaço suficiente para um tendão se estender tanto; portanto, para testar a viabilidade da técnica de sutura nos modelos in vivo, realizamos reparo in situ e calculamos uma força média de quebra de 24,60 ± 3,92 N, que é significativamente maior do que a força média de quebra de controle de 13,98 ± 2,26 N(Figura 4B).

Figure 1
Figura 1: Hidrogel de colágeno neutralizado (pH 7.4) (cor rosa) moldado no molde de aço inoxidável. O gel foi autorizado a permanecer em uma incubadora de CO2 a 37 °C durante 20 minutos para que a fibrillogênese ocorresse. A barra de escala é mostrada na parte inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Processo de compressão plástica. (A) O hidrogel de colágeno colocado entre as malhas de nylon com uma carga estática constante de 120 gramas aplicada. O fluido drenado foi absorvido por quatro camadas de papel filtro. A seta mostra a superfície de saída do fluido (FLS) para o gel. (B) Quatro camadas de folhas de colágeno comprimido foram enroladas ao longo do eixo para formar 'tendão projetado' (ET). (C) A seção de ET foi cortada em segmentos de 15 mm para imitar o tendão. (D) O defeito no tendão foi criado no tendão nativo (NT) extirndo um segmento de 15 mm do tendão tibial posterior, e o defeito foi preenchido com ET. Este painel foi modificado do trabalho anterior26. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: (A) O defeito no tendão foi preenchido com ET e assegurado com suturas de 6-0, e a técnica de sutura de quatro fios entrelaçada 3-0 foi realizada passando acima do enxerto na região de 30 mm. A seta de bloco mostra o ponto de partida para a sutura e a seta em branco mostra o ponto final da sutura. Este painel foi modificado do trabalho anterior26. (B) Viabilidade de realizar técnica de sutura desenvolvida em um espaço dentro do modelo lapino(in situ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Força mecânica. (A) Uma saída de teste mecânica do reparo e (B) na saída de teste mecânico situ (Barras de erro = SD; *p < 0,05, ANOVA unidirecional com correção de Bonferroni). Este painel foi modificado do trabalho anterior26. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste estudo, os enxertos de colágeno tipo I de engenharia de tecido foram escolhidos como enxerto tendinoso porque o colágeno é um polímero natural e usado como biomaterial para várias aplicações de engenharia de tecidos27,28. Além disso, o colágeno constitui 60% da massa seca do tendão, dos quais 95% é colágeno tipo 1 21,29,30,31,32. Para que ocorram enxertos bem-sucedidos, as propriedades mecânicas do enxerto devem corresponder idealmente ao tendão nativo33; no entanto, com as técnicas de engenharia atuais, as propriedades mecânicas de ET (4,41 N) são significativamente inferiores ao tendão nativo (NT) (261,08 N)33. Propõe-se que isso se deve ao arranjo hierárquico altamente organizado de fibril de colágeno no tendão nativo, o que continua sendo um desafio para projetar e combinar suas propriedades mecânicas34. Tentamos aumentar a densidade da matriz ET aplicando um peso estático de compressão ao hidrogel de colágeno33; no entanto, a complexidade arquitetônica a partir da qual o tendão adquire sua força é mais complexa. Métodos para acumular resistência mecânica são indiscutivelmente melhor alcançados in vivo,onde os processos biológicos do hospedeiro podem atuar na remodelagem da matriz extracelular. Portanto, neste estudo, outra estratégia foi adotada para modificar a técnica de sutura atual como reparação pós-tendão; a resistência mecânica do enxerto tendão reparado depende inteiramente da técnica de sutura8,9. Assim, modificando as técnicas de sutura existentes, podemos descarregar o enxerto tendão projetado até que a remodelação induzida por células e ECM ocorra como uma nova abordagem.

Até o momento, existem várias técnicas de sutura disponíveis para reparar o tendão, nenhum dos quais é um padrão-ouro; no entanto, a técnica modificada de sutura kessler é amplamente utilizada para reparar tendões porque é menos obstrutiva e prejudicial aos tendões35,36. O tendão muscular flexor digitorum profundus de cordeiros, quando suturado com a técnica Savage de 6 fios, foi relatado ter uma força de ruptura de 51,3 N, mas quando uma técnica de sutura kessler modificada foi usada, a força de ruptura foi 69.0 N7. No entanto, neste estudo, quando a lacuna tendinosa de 15 mm foi preenchida com ET e reparada com técnica de sutura kessler modificada, o reparo falhou em um estágio inicial com uma força de ruptura de 12,49 N(Figura 4). Esse baixo valor torna a técnica clinicamente irrelevante. Achados semelhantes foram relatados por De Wit et al. em um modelo de tendão de reparação porcina flexor, sugerindo que o reparo de Kessler falhou na ruptura da sutura, reduzindo o gapping em 15% em comparação com o reparo cruzado, onde o gapping é reduzido em 87% e o reparo falhou na retirada de sutura38. Assim, há a necessidade de outra técnica de sutura forte, que poderia manter o ET mecanicamente mais fraco no lugar.

Uma nova técnica de sutura modificada foi desenvolvida usando quatro suturas de núcleo ao longo de toda a extensão do ET e acima do tendão oposto. Estas suturas foram entrelaçadas no próprio material de sutura a alguma distância de cada extremidade tendinosa. Isso ocorre principalmente porque foi relatado que colocar nós de sutura a igual distância e igual tensão de compartilhamento de carga em todos os fios de sutura aumenta suas propriedades mecânicas39. Um reparo equilibrado também pode ser realizado mantendo uma sutura contínua, e cambaleando o reparo para permitir a compressão no local de reparo40.

Neste estudo, foram utilizadas suturas 3-0 para suturas intertravadas externas, considerando que o tendão do Coelho TP tem comprimento, largura e espessura de 62,4 mm, 5 mm e 1,5 mm, respectivamente. Suturas 6-0 foram usadas para manter o ET no lugar. Embora tenhamos tentado outros materiais de sutura absorvíveis, não seria apropriado, pois eles se tornam mais fracos durante um período in vivo41. Uma das principais razões pelas quais as suturas de polipropileno foram selecionadas é porque são um monofilamento, bem como não absorvível e não causam modificações estruturais ou tensionais sob a carga42. Testamos todas as suturas de 2-0 a 7-0, mas 3-0 e 6-0 foram considerados candidatos ideais para nossos experimentos 26.

A principal razão para o uso de 4 fios de reparação foi evitar danos excessivos às extremidades do tendão rompidas com maior número de fios de sutura, pois foi relatado que uma sutura cirúrgica normal em um tendão resulta na formação de uma região acelular43. Tem sido hipótese que isso se deve às células que migram da carga compressiva que é colocada no tendão, e normalmente essas células estão sujeitas ao carregamentode tração 17. Essa migração de células para longe da sutura poderia, então, causar enfraquecimento da matriz, pois há uma escassez de células para manter e rotatividade da matriz, o que poderia causar falha no tendão precoce17. Podemos usar mais fios de suturas que são biomecanicamente duas vezes mais fortes(ex vivo) do que suturas de 4 fios11,12,44,45; no entanto, esses reparos não são amplamente praticados e suas limitações clínicas estão sendo avaliadas atualmente13,14,15,16.

A colocação do nó de sutura é importante, mas há argumentos a favor e contra a externalização da sutura. Ter a sutura na superfície externa pode potencialmente travar contra estruturas como polias tendinosas e reduzir o deslizamento. Em um estudo, as áreas onde nós de sutura são colocados dentro ilustraram uma diminuição na resistência ao deslizamento em comparação com o reparo de Kessler, que tem nós de sutura forade 46. Estudos realizados no modelo canino concluíram que, em maior magnitude da força, menos nós de sutura localizados fora do reparo e longe das extremidades do tendão sobreviveram em comparação com aqueles localizados dentro do reparo47,48. No entanto, internalizar o nó potencialmente reduz a superfície de contato do tendão curativo. Há também a consideração de que os danos teciduais decorrem da agulha de sutura perfurando o tendão e o maior número de passes está relacionado ao aumento do trauma tendinoso49.

Para garantir o ET entre a lacuna tendinosa, foi realizado um padrão de suturas de corrida50 ao longo da borda do tendão e ET. Isso foi feito porque havia necessidade de suturas periféricas fortes o suficiente para manter o ET no lugar na fase inicial de cicatrização até que a remodelação induzida por células e ECM pudesse ocorrer50. O maior problema foi a variação das propriedades mecânicas do NT e ET, o que poderia resultar na formação precoce de lacunas, embora o ET tenha sido protegido por estresse. Por outro lado, aplicando uma técnica mais segura, como as suturas de intrafibra de colchão horizontal51,suturas contínuas de colchão52,53,técnicas de reparo epitendiosas de ponto cruzado54,55,56,57 ou suturas de bloqueio de corrida58,59 teria rompido ET como é frágil. Assim, escolhemos a execução de suturas como uma técnica de sutura periférica que é simples e mantém o ET intacto em todas as direções.

Do ponto de vista da engenharia de tecidos, precisamos estudar se esse método pode ser usado para preencher uma lacuna tendinosa superior a 1,5 cm. Para usar este enxerto em ensaios clínicos em humanos, precisamos investigar melhor a resposta imunológica à fonte xenogênica do colágeno, embora isso possa ser alcançado desenvolvendo colágeno de grau clínico. O protocolo aqui descrito estabelece a viabilidade da técnica de sutura desenvolvida dentro de espaços anatômicos disponíveis em um modelo de lapino suíno. Esta técnica de sutura desenvolvida tem pontos de sutura proximicamente e distally equidistance longe das extremidades tendinosas rompidas para que o enxerto tendão projetado pudesse ser descarregado. Assim, poderia amadurecer e integrar in vivo.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer a UCL por financiar este projeto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat tail type 1 Collagen  First Link, Birmingham, UK 60-30-810
prolene sutures 6-0 Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K. EP8726H
prolene sutures 3-0 Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K. D8911
Whatman filter paper SIGMA-ALDRICH  WHA10010155
Gibco DMEM, high glucose Thermo Fisher Scientific  11574486
Nylon mesh  Plastok (Meshes and Filtration) Ltd. NA

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Bioengenharia Edição 178 Reparação do Tendão engenharia de tecidos colágeno enxerto tendinoso técnica de sutura tendão
Uma nova técnica de sutura tenorrhaphy com enxerto de colágeno projetado por tecido para reparar defeitos grandes do tendão
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Sawadkar, P., Wong, J., Mudera, V. A … More

Sawadkar, P., Wong, J., Mudera, V. A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects. J. Vis. Exp. (178), e57696, doi:10.3791/57696 (2021).

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