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Bioengineering

Una nueva técnica de sutura de tenorrafia con injerto de colágeno de ingeniería tisular para reparar defectos grandes del tendón

Published: December 10, 2021 doi: 10.3791/57696
Automatic Translation
1,3, 2, 1
1Division of Surgery and Interventional Science, University College London, 2Blond McIndoe Laboratories, Division of Cell Matrix and Regenerative Medicine, MAHSC, University of Manchester, 3Department of Surgical Research, Northwick Park Institute for Medical Research, Northwick Park Hospital

Summary

En este trabajo, presentamos un protocolo in vitro e in situ para reparar un hueco tendinoso de hasta 1,5 cm llenándolo con injerto de colágeno modificado. Esto se realizó mediante el desarrollo de una técnica de sutura modificada para tomar la carga mecánica hasta que el injerto madure en el tejido huésped.

Abstract

El manejo quirúrgico de defectos tendinosos grandes con injertos de tendón es un desafío, ya que hay un número finito de sitios donde los donantes pueden identificarse y usarse fácilmente. Actualmente, este vacío se llena con injertos de tendones auto, aloo, xeno o artificiales, pero los métodos clínicos para asegurarlos no son necesariamente traducibles a animales debido a la escala. Con el fin de evaluar nuevos biomateriales o estudiar un injerto de tendón compuesto de colágeno tipo 1, hemos desarrollado una técnica de sutura modificada para ayudar a mantener el tendón diseñado en alineación con los extremos del tendón. Las propiedades mecánicas de estos injertos son inferiores al tendón nativo. Para incorporar el tendón diseñado en modelos clínicamente relevantes de reparación cargada, se adoptó una estrategia para descargar el injerto de tendón de ingeniería tisular y permitir la maduración e integración del tendón diseñado in vivo hasta que se formó un neoten tendón mecánicamente sólido. Describimos esta técnica utilizando la incorporación de la construcción del tendón de ingeniería tisular de colágeno tipo 1.

Introduction

La ruptura del tendón puede ocurrir debido a factores extrínsecos como laceraciones traumáticas o carga excesiva del tendón. Debido a las fuerzas de tracción externas colocadas en una reparación del tendón, inevitablemente se forma una brecha con la mayoría de las técnicas de reparación del tendón. Actualmente, los defectos / huecos tendinosos se llenan con injertos automáticos, aloo, xeno o artificiales, pero su disponibilidad es finita y el sitio donante es una fuente de morbilidad.

El enfoque de ingeniería tisular para fabricar injerto de tendón a partir de un polímero natural como el colágeno tiene la ventaja distintiva de ser biocompatible y puede proporcionar componentes vitales de matriz extracelular (ECM) que facilitan la integración celular. Sin embargo, debido a la falta de alineación fibrilar, las propiedades mecánicas del tendón diseñado (ET) son inferiores al tendón nativo. Para aumentar las propiedades mecánicas del colágeno más débil, se han utilizado muchos métodos, como la reticulación física al vacío, la radiación UV y los tratamientos dehidrotérmicos1. Asimismo, a través de la reticulación química con riboflavina, los métodos enzimáticos y no enzimáticos aumentaron la densidad del colágeno y el módulo de Young del colágeno in vitro2,3. Sin embargo, al añadir agentes reticulantes, la biocompatibilidad del colágeno se ve comprometida, ya que los estudios han demostrado una alteración del 33% en las propiedades mecánicas y una pérdida del 40% de la viabilidad celular3,4,5. La acumulación gradual de alineación y resistencia mecánica se puede obtener a través de la carga cíclica6; sin embargo, esto se puede adquirir de manera eficiente in vivo7.

Para que ET se integre in vivo y adquiera resistencia sin la necesidad de alteración química, un enfoque sería utilizar una técnica de sutura estabilizadora para mantener la construcción más débil en su lugar. La mayoría de las reparaciones del tendón se basan en el diseño de la sutura para mantener unidos los extremos del tendón; por lo tanto, la modificación de estas técnicas existentes podría proporcionar una solución lógica8,9.

Hasta la década de 1980, las reparaciones de 2 hebras eran ampliamente utilizadas, pero la literatura quirúrgica reciente describe el uso de 4 hebras, 6 hebras o incluso 8 hebras en la reparación10,11. En 1985, Savage describió técnicas de sutura de 6 hebras con 6 puntos de anclaje, y fue significativamente más fuerte que la técnica de sutura de Bunnell que utiliza 4 hebras 12. Además, las reparaciones de 8 hebras son un 43% más fuertes que otras hebras en modelos de cadáveres e in situ, pero estas reparaciones no se practican ampliamente ya que se vuelve técnicamente difícil reproducir las reparaciones con precisión13,14,15,16. Por lo tanto, un mayor número de hebras de sutura del núcleo se relaciona con un aumento proporcional de las propiedades biomecánicas del tendón reparado. Sin embargo, hay una pérdida de viabilidad celular alrededor de los puntos de sutura, y el trauma de la sutura excesiva puede ser en detrimento del tendón, lo que puede comprometer la curación del tendón17. Las técnicas de sutura deben proporcionar una reparación geométrica fuerte que sea equilibrada y relativamente inelástica para minimizar la rotura del tendón después de la reparación. Además, la ubicación de la sutura y sus nudos deben colocarse estratégicamente para que no interfieran con el deslizamiento, el suministro de sangre y la curación hasta que se haya obtenido la acumulación de la fuerza adecuada10,18.

Para establecer la viabilidad de asegurar un injerto ET más débil u otro material de injerto entre el tendón roto, hemos desarrollado una nueva técnica de sutura que puede descargar el injerto para que pueda madurar e integrarse gradualmente en el tejido huésped in vivo.

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Protocol

NOTA: El diseño del experimento y la aprobación ética se obtuvieron de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de UCL. Todos los experimentos se llevaron a cabo según la regulación del Ministerio del Interior y las directrices de la Ley de Animales (procedimiento científico) de 1986 con la legislación revisada de la Directiva Europea 2010/63/UE (2013). Los conejos fueron inspeccionados por un cirujano veterinario nombrado (NVS) periódicamente y dos veces al día por un oficial de cuidado y bienestar animal nombrado (NACWO) (según las pautas y regulaciones del Ministerio del Interior). No mostraron ningún signo de dolor hasta que fueron sacrificados.

1. Preparación del injerto de tendón de ingeniería tisular (ET)

  1. Para fabricar el hidrogel de colágeno, agregue 4 ml de solución de colágeno monomérico tipo 1 de cola de rata (2.15 mg / ml en ácido acético al 0.6% con 0.2% p / v de proteína total) y 500 μL de 10x Medium Esencial Mínimo. Neutralice esto titulando contra hidróxido de sodio de 5 M y 1 M y agregue 500 μL de Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco.
  2. Vierta 5 ml de esta solución en un molde de metal rectangular hecho a medida (33 mm × 22 mm × 10 mm, 120 g de peso) (Figura 1). Mantenga el molde en una incubadora de CO2 a 37 °C y 5% de CO2 durante 15 minutos para permitir el montaje de la matriz19.

2. Fabricación del injerto

  1. Después de la polimerización, retire el hidrogel de colágeno del molde y colóquelo en un conjunto de compresión de plástico estándar (Figura 2A)19.
  2. Coloque el hidrogel de colágeno entre dos láminas de malla de nylon de 50 μm y aplique una carga estática de 120 g (área de superficie total 7.4 cm2,que es una presión equivalente a 1.6 kPa) durante 5 minutos para eliminar el líquido intersticial del hidrogel (Figura 2A). Use cuatro capas de papel de filtro para absorber el líquido descargado de los hidrogeles.
  3. Utilice cuatro capas de geles comprimidos enrollados uno encima del otro (Figura 2B) y corte en segmentos de 15 mm (Figura 2C) para fabricar el ET.
    NOTA: En los experimentos se utilizaron conejos machos blancos de Nueva Zelanda de 16 a 25 semanas de edad.
  4. Sedar animales con una dosis intramuscular (i.m.) de Hypnorm (0,3 mg/ml) y practicar la eutanasia administrando una sobredosis de pentobarbitona.
  5. Inmediatamente después de la eutanasia, recorte el cabello en ambas patas traseras. Luego, con una cuchilla quirúrgica de tamaño 20, haga una incisión de 9 cm alrededor del área tibiofibular inferior para exponer el tendón tibial posterior (TP).
  6. Con la cuchilla quirúrgica del mismo tamaño, extirpa los tendones TP lapina con una longitud promedio de 70 mm y manténgalos húmedos en PBS durante el proceso experimental para evitar el secado.

3. Desarrolló una nueva técnica de tenorrafia

NOTA: Las suturas (ver Tabla de Materiales)son no absorbibles y están hechas de un estereoisómero cristalino isotáctico de polipropileno, que es una poliolefina lineal sintética. Las suturas de enclavamiento del núcleo consistían principalmente en 3-0 y las suturas periféricas eran 6-0. Estas fueron las dos suturas principales utilizadas en todos los experimentos.

  1. Con una cuchilla quirúrgica, corte el tendón TP en el punto medio. Extirpar un segmento de 15 mm del tendón desde la mitad del tendón y reemplazarlo con el injerto de colágeno ET(Figura 2D). Entrelazar la sutura 3-0 proximalmente lejos de los extremos del tendón nativo(Figura 3A).
  2. Pase las suturas de núcleo 3-0 por encima de toda la longitud del injerto y enclave distalmente lejos del extremo cortado.
  3. Asegure ambos extremos del ET al tendón nativo con 6-0 y suturas de funcionamiento continuo alrededor de la periferia acoplando dos extremos del tendón(Figura 3B). Esto se hace para que el injerto se pueda mover fácilmente sobre la sutura colocando tensión sobre el tendón nativo20.
  4. Después de asegurar la sutura como se describió anteriormente, asegúrese manualmente de que la tensión en las suturas sea adecuada y que no haya flacidez en la totalidad de la sutura.

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Representative Results

Hemos utilizado injertos de colágeno fabricados a partir de colágeno tipo I, ya que esta es la proteína predominante que se encuentra en el tendón. Constituye casi el 95% del colágeno total en el tendón; por lo tanto, el colágeno ha exhibido todas las propiedades ideales para imitar el tendón in vivo21,22.

En este estudio, el colágeno tipo I utilizado se extrajo del tendón de la cola de rata y se disolvió en el ácido acético (2,15 mg / ml). Para polimerizar este colágeno, se neutralizó con hidróxido de sodio in vitro, que formó fibrillas de colágeno anisotrópico no reticulado. Este hidrogel contiene un 98% de líquido y podría imitar el tejido vivo in vivo en 20 minutos durante la fabricación23. Sin embargo, este hidrogel es mecánicamente débil; por lo tanto, para aumentar las propiedades mecánicas, hemos desarrollado un método para la compresión rápida del hidrogel de colágeno mediante una técnica conocida como 'compresión plástica', donde el grado de compresión es directamente proporcional al peso aplicado en la parte superior y al fluido liberado de la superficie de salida del fluido (FLS)19.

El laminado en espiral de este injerto aumenta sus propiedades mecánicas19, pero el injerto sigue siendo significativamente más débil que el tendón nativo. Para abordar este problema, hemos desarrollado una novedosa técnica de sutura modificada colocando puntos de sutura, no en el borde de los tendones rotos, sino proximal y distalmente. Por lo tanto, la fuerza de la reparación está en las suturas y los puntos de sutura y no en el injerto de tendón mecánicamente más débil.

Para demostrar la funcionalidad de la novedosa técnica de sutura desarrollada, se extirpó un tendón TP lapinado. El hueco se llenó con un injerto de tendón de 15 mm de largo asegurado con suturas 6-0, y se colocaron suturas entrelazadas 3-0 a 70 mm para actuar como barreras de carga(Figura 3A). La resistencia media a la rotura de la reparación fue de 50,62 ± 8,17 N, que fue significativamente mayor(p < 0,05) que la de la reparación de Kessler de control de 12,49 ± 1,62 N (Figura 4A). Por lo tanto, la longitud de la sutura del núcleo y su enclavamiento lejos de los extremos del tendón influyen significativamente en la resistencia del tendón y las reparaciones de fallar a fuerzas de mayor magnitud24,25.

Esta resistencia fue inadecuada en las reparaciones de control, lo que causó fallas de reparación tempranas y fallas de tensión de más del 20% en el tendón. Sin embargo, esta es una anomalía fisiológica, ya que los tendones in vivo nunca están sujetos a una tensión del 20% debido a que no hay suficiente espacio para que un tendón se extienda tanto; por lo tanto, para probar la viabilidad de los modelos de la técnica de sutura in vivo, hemos realizado la reparación in situ y calculado una resistencia media a la rotura de 24,60 ± 3,92 N, que es significativamente mayor que la resistencia media de rotura de control de 13,98 ± 2,26 N(Figura 4B).

Figure 1
Figura 1: Hidrogel de colágeno neutralizado (pH 7.4) (color rosa) fundido en el molde de acero inoxidable. Se permitió que el gel permaneciera en una incubadora de CO2 a 37 ° C durante 20 minutos para que ocurriera la fibrilogénesis. La barra de escala se muestra en la parte inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Proceso de compresión plástica. (A) El hidrogel de colágeno colocado entre mallas de nylon con una carga estática constante de 120 gramos aplicados. El líquido drenado fue absorbido por cuatro capas de papel de filtro. La flecha muestra la superficie de salida de líquido (FLS) para el gel. (B) Se rodaron cuatro capas de láminas de colágeno comprimido a lo largo del eje para formar un "tendón de ingeniería" (ET). (C) La sección de ET se cortó en segmentos de 15 mm para imitar el tendón. (D) El defecto tendinoso se creó en el tendón nativo (NT) mediante la extirpación de un segmento de 15 mm del tendón tibial posterior, y el defecto se rellenó con ET. Este panel fue modificado del trabajo anterior26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3:(A) El defecto tendinoso se rellenó con ET y se aseguró con suturas 6-0, y la técnica de sutura de cuatro hebras entrelazadas 3-0 se realizó pasando por encima del injerto en la región de 30 mm. La flecha de bloque muestra el punto de partida de la sutura y la flecha en blanco muestra el punto final de la sutura. Este panel fue modificado del trabajo anterior26. (B) Viabilidad de realizar la técnica de sutura desarrollada en un espacio dentro del modelo lapin (in situ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Resistencia mecánica. (A) Una salida de prueba mecánica de la reparación y (B) salida de prueba mecánica in situ (Barras de error = SD; *p < 0.05, ANOVA unidireccional con corrección de Bonferroni). Este panel fue modificado del trabajo anterior26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este estudio, se eligieron injertos de colágeno tipo I de ingeniería tisular como injerto de tendón porque el colágeno es un polímero natural y se utiliza como biomaterial para diversas aplicaciones de ingeniería de tejidos27,28. Además, el colágeno constituye el 60% de la masa seca del tendón, de la cual el 95% es colágeno tipo 1 21,29,30,31,32. Para que se produzca un injerto exitoso, las propiedades mecánicas del injerto idealmente deben coincidir con el tendón nativo33; sin embargo, con las técnicas de ingeniería actuales, las propiedades mecánicas de ET (4.41 N) son significativamente inferiores al tendón nativo (NT) (261.08 N)33. Se propone que esto se debe a la disposición jerárquica altamente organizada de la fibrilla de colágeno en el tendón nativo, que sigue siendo un desafío para diseñar y coincidir con sus propiedades mecánicas34. Hemos intentado aumentar la densidad de la matriz ET aplicando un peso estático de compresión al hidrogel de colágeno33; sin embargo, la complejidad arquitectónica a partir de la cual el tendón adquiere su fuerza es más intrincada. Podría decirse que los métodos para acumular resistencia mecánica se logran mejor in vivo,donde los procesos biológicos del huésped pueden actuar sobre la remodelación de la matriz extracelular. Por lo tanto, en este estudio, se adoptó otra estrategia para modificar la técnica de sutura actual como reparación post tendón; la resistencia mecánica del injerto tendinoso reparado depende totalmente de la técnica de sutura8,9. Por lo tanto, al modificar las técnicas de sutura existentes, podemos descargar el injerto de tendón diseñado hasta que se produzca la remodelación inducida por células y ECM como un nuevo enfoque.

Hasta la fecha, hay varias técnicas de sutura disponibles para reparar el tendón, ninguna de las cuales es un estándar de oro; sin embargo, la técnica de sutura kessler modificada es ampliamente utilizada para reparar tendones porque es menos obstructiva y dañina para los tendones35,36. Se informó que el tendón muscular flexor digitorum profundus de corderos, cuando se suturaba con la técnica Savage de 6 hebras, tenía una fuerza de rotura de 51.3 N, pero cuando se utilizó una técnica de sutura Kessler modificada, la fuerza de rotura fue de 69.0 N7. Sin embargo, en este estudio, cuando el espacio tendinoso de 15 mm se llenó con ET y se reparó con la técnica de sutura Kessler modificada, la reparación falló en una etapa temprana con una resistencia a la rotura de 12.49 N(Figura 4). Este bajo valor hace que la técnica sea clínicamente irrelevante. Hallazgos similares han sido reportados por De Wit et al. en un modelo de tendón de reparación flexora porcina, lo que sugiere que la reparación de Kessler falló en la ruptura de la sutura al reducir el gapping en un 15% en comparación con la reparación del cruzado, donde el gapping se reduce en un 87% y la reparación falló en la extracción de la sutura38. Por lo tanto, existe la necesidad de otra técnica de sutura fuerte, que podría mantener un ET mecánicamente más débil en su lugar.

Se desarrolló una novedosa técnica de sutura modificada mediante el uso de cuatro suturas de núcleo en toda la longitud del ET y por encima del tendón opuesto. Estas suturas estaban entrelazadas en el propio material de sutura a cierta distancia de cada extremo del tendón. Esto se debe principalmente a que se ha informado que poner nudos de sutura a igual distancia e igual tensión de reparto de carga en todas las hebras de sutura aumenta sus propiedades mecánicas39. También se puede lograr una reparación equilibrada manteniendo una sutura continua y escalonando la reparación para permitir la compresión en el sitio de reparación40.

En este estudio, se utilizaron suturas 3-0 para suturas externas entrelazadas considerando que el tendón TP de conejo tiene una longitud, anchura y grosor de 62,4 mm, 5 mm y 1,5 mm, respectivamente. Se utilizaron suturas 6-0 para mantener el ET en su lugar. Aunque hemos probado otros materiales de sutura absorbibles, no sería apropiado ya que se debilitan durante un período in vivo41. Una razón principal por la que se seleccionaron las suturas de polipropileno es porque son un monofilamento y no absorbibles y no causan modificaciones estructurales o tensionales bajo carga42. Probamos todas las suturas de 2-0 a 7-0, pero se encontró que 3-0 y 6-0 eran candidatos ideales para nuestros experimentos 26.

La razón principal para usar la reparación de 4 hebras fue evitar un daño excesivo a los extremos del tendón roto con un mayor número de hebras de sutura, ya que se ha informado que una sutura quirúrgica normal en un tendón resulta en la formación de una región acelular43. Se ha planteado la hipótesis de que esto se debe a que las células migran fuera de la carga compresiva que se pone en el tendón, y normalmente estas células están sujetas a carga de tracción17. Esta migración de células lejos de la sutura podría causar un debilitamiento de la matriz, ya que hay una escasez de células para mantener y rehacer la matriz, lo que podría causar una falla temprana del tendón17. Podemos usar más hebras de suturas que son biomecánicamente dos veces más fuertes(ex vivo) que las suturas de 4 hebras11,12,44,45; sin embargo, estas reparaciones no se practican ampliamente y actualmente se están evaluando sus limitaciones clínicas13,14,15,16.

La colocación del nudo de sutura es importante, pero hay argumentos a favor y en contra de externalizar la sutura. Tener la sutura en la superficie exterior puede potencialmente engancharse contra estructuras como las poleas de los tendones y reducir el deslizamiento. En un estudio, las áreas donde se colocan los nudos de sutura en el interior ilustraron una disminución en la resistencia al deslizamiento en comparación con la reparación de Kessler, que tiene nudos de sutura fuera46. Los estudios realizados en el modelo canino concluyeron que a una mayor magnitud de la fuerza, menos nudos de sutura ubicados fuera de la reparación y lejos de los extremos tendinosos habían sobrevivido en comparación con los ubicados dentro de la reparación47,48. Sin embargo, internalizar el nudo reduce potencialmente la superficie de contacto del tendón de curación. También existe la consideración de que el daño tisular surge de la aguja de sutura que perfora el tendón y el mayor número de pasadas se relaciona con el aumento del traumatismo tendinoso49.

Para asegurar et entre el espacio tendinoso, se realizó un estándar de suturas de carrera50 a lo largo del borde del tendón y ET. Esto se hizo porque había una necesidad de suturas periféricas que son lo suficientemente fuertes como para mantener el ET en su lugar en la fase inicial de curación hasta que la remodelación inducida por la célula y la ECM pudiera ocurrir50. El principal problema fue la variación en las propiedades mecánicas del NT y et, lo que podría resultar en la formación temprana de brechas aunque el ET estaba protegido contra tensiones. Por otro lado, aplicando una técnica más segura como las suturas horizontales de colchón intrafibra51,las suturas de colchón horizontal continua Halsted52,53,las técnicas de reparación epitendinosa de punto de cruz54,55,56,57 o las suturas de bloqueo de carrera58,59 habría roto ET ya que es frágil. Por lo tanto, elegimos las suturas de ejecución como una técnica de sutura periférica que es simple y mantiene el ET intacto en todas las direcciones.

Desde una perspectiva de ingeniería de tejidos, necesitamos estudiar si este método se puede utilizar para llenar un espacio tendinoso mayor de 1,5 cm. Para utilizar este injerto en ensayos clínicos en humanos, necesitamos investigar más a fondo la respuesta inmunológica a la fuente xenogénica de colágeno, aunque esto se puede lograr mediante el desarrollo de colágeno de grado clínico. El protocolo aquí descrito establece la viabilidad de la técnica de sutura desarrollada dentro de los espacios anatómicos disponibles en un modelo lapina porcino. Esta técnica de sutura desarrollada tiene puntos de sutura proximal y distales equidistancia lejos de los extremos del tendón roto para que el injerto de tendón diseñado pueda descargarse. Por lo tanto, podría madurar e integrarse in vivo.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a UCL por financiar este proyecto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat tail type 1 Collagen  First Link, Birmingham, UK 60-30-810
prolene sutures 6-0 Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K. EP8726H
prolene sutures 3-0 Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K. D8911
Whatman filter paper SIGMA-ALDRICH  WHA10010155
Gibco DMEM, high glucose Thermo Fisher Scientific  11574486
Nylon mesh  Plastok (Meshes and Filtration) Ltd. NA

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Una nueva técnica de sutura de tenorrafia con injerto de colágeno de ingeniería tisular para reparar defectos grandes del tendón
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Sawadkar, P., Wong, J., Mudera, V. A … More

Sawadkar, P., Wong, J., Mudera, V. A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects. J. Vis. Exp. (178), e57696, doi:10.3791/57696 (2021).

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