Summary
우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.
Abstract
꼬마 선 충 (C. 선 충) 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 및 염색체 역학을 포함 하 여 몇몇 생물학으로 중요 한 과정을 공부 하는 데 사용 됩니다. 동안에 생식은 우수한 모델, 분석은 종종 2 시간 및 3 차원 분석에 필요한 노동 차원. 이러한 연구에 주요 정보는 핵 및 단백질 분포는 생식 내 번호/위치. 여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 전산 접근을 사용 하 여 수는 생식의 각 지역에서 핵의 위치를 결정 하는 생식의 자동화 된 분석을 수행 하는 방법을 제시. 우리의 방법은 또한 다른 유전 배경의 단백질 식의 3 차원 검사를 가능 하 게 생식 단백질 분포를 분석 합니다. 또한, 우리의 연구는 특정 공간 발달 요구를 수용할 수 있는 생식의 고유 영역에서 cytoskeletal 건축에 변화를 보여줍니다. 마지막으로, 우리의 메서드는 각 생식의 spermatheca에 정자의 자동화 된 계산 수 있습니다. 함께 찍은, 우리의 메서드는 C. 선 충 생식의 신속 하 고 재현성 phenotypic 분석을 수 있습니다.
Introduction
포유류와 경로 신호의 보존은 C. 선 충 여러 생물 학적 과정1,2를 공부 하는 우수한 모델. 우리의 실험실 사용 하 여 선 충 C. 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 유전자 발현 연구. 생식은 3 차원 구조, 많은 학문은 2 차원 3 차원 분석의 시간과 노동 집약적인 특성상. 2 차원 분석 vivo에서 이벤트는 생식에 허위로 수 있습니다 매우 높습니다. C. 선 충 성인 남녀 추 니 두 생식 팔, 각각의 집 체세포 원심 끝 셀 (DTC)는 미 분화 상태3,4원심 세균 세포를 유지 하는. 이 세균 세포 차별화 영향력, 탈출 DTC에서 이동 하는 시작 되 고 해지고 oocytes 정자로는 생식의 근 위 끝에 도달. 이 과정 동안, 생식 세포 핵 유사 분열, 감수 분열5,6에 전환 하기 전에 받아야. 정자 생산 후 oocytes는 성인 기 동안 생산 개발의 애벌레 단계 4 (L4)에 의해 완료 된다. 정자는 어디 그들은 비 옥 하 게 배아를 생성 하기 위해 oocytes spermatheca에 저장 됩니다.
핵의 수, apoptotic 이벤트, 염색체 역학, 고 단백질 식 및 지역화7 수에 변화 결과로 C. 선 충 에서 생식 개발에 영향을 미칠 수 있는 여러 유전과 환경 요인이 있다 ,,89,,1011. 이러한 이벤트의 분석 핵 형태와 분포에 따라 차별화의 각 단계의 식별을 해야 합니다. 큰 샘플 크기와 수동으로 이러한 매개 변수를 정확 하 게 분석 이며 노동 집약적인 시간이 걸리는. 이러한 단점을 우회 하 고 분석의 일관성 있도록, 우리 세 핵, 핵 배포, 단백질 표정, 선 충 C. 생식의 3 차원 검사를 위한 자동화 된 방법을 개발 및 cytoskeletal 구조입니다. 3 차원 렌더링 confocal 현미경 검사 법을 결합 하 여 세균 세포 분화의 단계 각의 식별에 대 한 크기와 모양 매개 변수를 생성 했습니다. 또한,이 메서드는 생식 세포 핵과 정자의 세 플러스 각 oocyte에서 염색체 수의 득점 수 있습니다.
1 개의 중요 한 구조는 생식 생식 구획, 에이즈 세포질 스트리밍 및 생식 핵12보호 안정성을 제공 하는 골격 이다. 전산 렌더링을 사용 하 여, 우리는 생식 세포 골격의 3 차원 재구성을 수행 하 고 뚜렷한 cytoskeletal는 생식 기능을 식별. 여기, 우리가 어떻게 계산 분석 confocal 이미징 수 있도록 포괄적인 분석 C. 선 충 생식의 결합을 설명 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.
C. 선 충 의 생식 (그림 1)의 3 차원 분석을 위한 빠른 방법을 제안 한다. 3 차원 분석을 사용 하 여, 그것은 셀 (그림 2), 생식 세포 골격 ( 의 개조의 자동화 (그림 2 및 그림 3), 생식 핵의 3 차원 분포 계산 공부 가능 그림 3), 단백질 (그림 4), 그리고 점수는 spermatheca에 정자와 oocytes (그림 5)에서 염색체의 수의. 메서드는 생식의 쉽고 정확한 정량화를 가능 하 게 뿐만 아니라 생리 적으로 관련 된 고기를 식별.
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Protocol
1. 준비 및 웜 농업
참고: 모든 제품 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
- OP50 대장균 문화: Lysogeny 국물 (파운드) (1% tryptone 0.5% 효 모, 0.5 %NaCl, pH 7.0) 항생제 없이 37 ° C에서 하룻밤에 OP50 박테리아 문화.
- 선 충 류 성장 미디어 (NGM) 판 (1.5 g의 NaCl, 한 천, 펩, 1 M CaCl2, 에탄올, 1 M MgSO4 의 1 mL에에서 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1.25 g의 8.5 g OP50 박테리아의 400 µ L 씨 고 1 M KPO4 버퍼의 25 mL)와 공기 건조 48 h에 대 한 박테리아.
- 시드 NGM 접시에 벌레를 선택 하 고 15 ° C 또는 20 ° C에서 품 어
- 성인 자웅 동체 생식의 분석을 위해 잘 먹이 L4 벌레 세균 잔디를 선택 하 고 20 ° c.에서 밤새 품 어
- 광고에 나온 것에 정자 수를 점수, 12 h 20 ° C에서 L4 벌레 벌레 L4/성인 탈피에 도달할 때까지 품 어. 동기화 하려면 L4 단계에 벌레, 표 백제 솔루션 (1 M NaOH와 1:1 비율에서 표 백제) 계란의 많은 성인 벌레를 수확 하 여 계란을 준비 합니다. 계란 해치 고 L4 동물 실험에 대 한 선택 수 있습니다.
- 슬라이드에서 폴 리-L-리 신 솔루션의 25 µ L를 놓고 피 펫 팁을 사용 하 여 솔루션 잘, 확산 테 플 론 현미경 슬라이드를 준비 합니다. 초과 폴 리-L-리 신 종이 타월로 제거 후 건조 한 공기를 품 어 15-20 분 동안 65 ° C에서 슬라이드 슬라이드 수 있습니다.
2. 생식 해 부와 얼룩6,13
- 10 µ L 22 × 22mm coverslip에 0.01 %tetramisole (마 취)의 자리 고 그것으로 한-하루 오래 된 성인 벌레를 선택 합니다.
- (5 mL) 주사기 및 바늘 (24 "x 1")를 사용 하 여 진정 된다 그것으로 꼬리에 벌레를 해 부하 고는 생식 손상 되지 않은 확인 합니다.
주: 해 부 웜은 웜 및 웜 움직임에 부정적인 압력은 생식의 방출 원조를 마비 완전히 된다 전에 밖으로 실행 되어야 한다. 정자, 득점을 위한 해야 합니다 주의 spermatheca 손상 않기로 바늘에 의해 해 부 동안. spermatheca 후 절 개 포인트를 제외 하 고 바늘으로는 생식을 만지지 마십시오. 생식 구획에 휴식 또는 어떤 방전은 생식에서 관찰, 경우는 생식 분석을 위해 사용할 수 없습니다 한다. - 폴 리-L-리 신 코팅된 슬라이드, 슬라이드에 해 부 생식 유지에 거꾸로 coverslip를 놓습니다.
- 1 분 빠르게 바늘을 사용 하 여 슬라이드에 germlines와 함께 하는 coverslip 제거 위해 액체 질소에 coverslip, 다음 장소 슬라이드의 모서리에 종이 타워를 배치 하 여는 coverslip에서 과잉 액체를 제거 합니다.
- 슬라이드는 챔버에 30-60 s-20 ° C 메탄올으로 전송 다음 갓된 고정 솔루션 (버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 포함 0.08 M HEPES pH 6.9, 1.6 m m MgSO4, 0.8 m m 에틸렌 글리콜-bis(beta-aminoethyl x 1에서에서 30 분 동안 품 어 에테르)-N, N, N', N'-tetraacetic (EGTA), 산과 3.7 %paraformaldehyde) 실내 온도에.
- 1 x PBS, pH 7.4 포함 된 챔버에 배치 하 여 슬라이드를 씻어 0.1 %10 분에 대 한 트윈-20이 단계를 반복이 한 번.
- 차단 솔루션 차단 30 µ L로 germlines (염소 혈 청의 1700 µ L에서 염소 혈 청의 900 µ L을 추가 하 여 준비의 30 %h 조2O를 증 류와 10 x PBS의 300 µ L) 30 분 동안 실내 온도에 플라스틱 상자에 젖은 종이 수건을 배치 하 여 준비 하는 습 한 실에.
- REC-8 항 체 솔루션 각 샘플 비율 1:300에 30% 염소 혈 청에서 준비의 50 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에서 밤새 품 어
- 슬라이드를 씻어 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 단계를 한 번 반복 하 고 슬라이드의 모서리에 종이 타월을 배치 하 여 과잉 액체를 제거.
- 30% 정상 염소 혈 청에서 녹색 fluorophore (488 nm 방출 파장) 활용된 2 차 항 체 (1:1000), phalloidin (말라 얼룩, 1:4000), 및 (DNA 얼룩, 1:4000) DAPI를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다.
- 슬라이드에 이차 항 체 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.
- 실 온에서 1 h에 품 어.
- 슬라이드를 씻어 두 번 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 초과 액체 닦아.
- 고정 슬라이드에 시 약 30 µ L을 추가 하 고 1.5 µ m coverslip x 12 m m2 위에 놓고 하룻밤 4 ° C에서 슬라이드를 건조.
3. confocal 현미경 검사 법
- Confocal 현미경, 레이저, 공명 스캐너 및 confocal 현미경 소프트웨어 설정. 63 X 목표 위에 슬라이드 홀더에 얼룩진된 germlines와 슬라이드를 놓습니다.
- 생식, 포커스는 생식 상단 찾아서 confocal 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 표시 합니다. 비슷하게는 생식의 하단에 집중 하 고 총 생식 두께 설정 표시.
- 0.5 µ m. 마크 완전 한 생식 그리고 시작 인수까지 각 슬라이스의 두께 정의 하 여 전체 생식 이미지. 각 슬라이스 8 번 스캔 하 고 이미지 품질을 개선 하기 위해 값을 평균. 공명 스캐너 이미징 동안 표백 방지 하려면 빠른 검색 허용 됩니다. 만약 현미경 공명 스캐너, 표백을 피하기 위해 4 검사의 수를 줄일 수는 없습니다.
4. 게시물 이미징 분석 핵의 수와 분포
참고: 소프트웨어 도구와 사용 하는 버튼의 스크린샷을 위한 보충 그림 1 을 참조 하십시오.
- 8.4.1 Imaris 또는 소프트웨어의 이미지를 가져옵니다.
- 각 지역에서 핵 형태를 식별 하 여 mitotic 지역, 전이 영역, meiotic 지역, oocyte 지역, 그리고 spermatheca는 생식의 정의.
- 소프트웨어의 표면 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 관심 영역을 선택 합니다.
- 자동 표면 생성 마법사를 취소 하 고 수동으로 3 차원 스택에서 이미지의 첫 번째 및 마지막 조각에서 관심 영역을 그립니다.
- 만들기 화면을 클릭 합니다.
참고: 소프트웨어를 자동으로 첫 번째 및 마지막 스택 간의 스택을 개발할 것입니다. - DAPI 제외 하 고 모든 채널 마스크 채널 버튼 (보충 그림 1B-C)를 클릭 하 여 마스크.
- 자리 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 핵 크기 매개 변수를 정의 합니다. Mitotic 지역에 대 한 Z 직경 정의 하면서 2 µ m의 XY 직경을 정의 합니다. 전환 영역에 대 한로 1.5 µ m. (보충 그림 1D) 2 µ m의 XY 직경 및 Z 직경을 정의 합니다.
참고: 확대 및 현미경의 사양에 따라 직경을 해결 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 사용 하는 목적은 63 X 되었고 추가 이미징 동안 1.70 배 확대를 제공. 목표 변경, 예를 들어 40 X, 직경 적절 하 게 변경 한다. 올바른 매개 변수를 설정 하려면 wildtype germlines와 문제 해결을 수행 합니다. 야생 유형 생식 팔의 mitotic 지역은 약 250 핵 있다. 지름이이 값을 달성 하도록 수정 한다. 적어도 15 germlines를 사용 하 여 직경에 대 한 최적의 값을 확인 하. 이와 비슷한 방식은 전환 영역 (150-170 핵)와 meiotic 지역 (600-700 핵) 보정을 위해 사용 되어야 한다. - 최소 임계값 (보충 그림 1E)를 정의 하 여 관광 명소의 검색을 제한 합니다. DAPI를 사용 하 여 첫 번째 자리는 생식 외부 표시 될 때까지 최소 3 차원 렌더링 임계값을 늘려 최소 임계값을 설정 하는 야생 타입 germlines 스테인드.
- 이미지를 저장 하 고 소프트웨어에 의해 자동으로 생성 하는 테이블에서 핵의 수를 얻을. TIF 파일로 이미지를 내보냅니다.
5. 게시물 점수 정자 염색체 수에 대 한 분석 영상
- 관심 영역으로는 spermatheca를 선택 하 여 3 차원 렌더링을 수행 합니다. 각 정자를 감지, 0.75-사이 반점 직경 정의 1.0 µ m x 및 Y 축, Z 지름은 정의 되지 않은 유지 하는 동안. 관광 명소 기능 버튼을 사용 하 여 보충 그림 1에서 보듯이.
- 백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여.
참고: Imaris 소프트웨어 추천 강도 높은 포인트 먼저, 따라서 배경 효과 최소한의 상당한 차이가 관심 영역 및 배경으로. 두 번째 방법은 이다 배경에 대 한 배경 보정을 수동으로 정의 적절 한 값을 지정할 수 있습니다. 수동 배경 교정 독립적인 샘플의 강도 비교를 요구 하는 경우 적절 한 될 것입니다. - Spermatheca (보충 그림 1E)에서 모든 DAPI 스테인드 정자를 검출 하기 위하여 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.
- 염색체, 계산에 대 한 정의 자리 직경 < x 0.75 µ m 및 Y-축 3 차원 모델을 개발 하기 전에.
- 이미지를 저장 하 고 TIF 파일로 내보내기.
6. 포스트는 생식의 Cytoskeletal 재건에 대 한 분석 영상
- 생식에 관심 영역을 식별 하 고 phalloidin 제외 하 고 모든 채널을 채널 마스크 버튼을 클릭 하 여 마스크.
- 표면 기능 버튼 (보충 그림 1)를 사용 하 여 0.25 µ m의 표면 세부 정보를 정의 합니다.
참고:이 모든 0.25 µ m으로 3 차원 모델 렌더링 됩니다 의미 합니다. 표면 디테일 3 차원 표면 모델 마다 0.25 µ m에 대 한 생성 하는 것입니다 어디는 생식의 모든 지역에 대 한 일정 수 있습니다. 그러나, oocyte 지역에 대 한 표면 세부 수 수 증가 0.35-0.5 µ m이이 지역에서 잘 정의 된 걸 섬유의 존재 때문. - 백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여.
- 분석 (보충 그림 1E)을 필요로 하는 구조에 따라 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.
- 개발 된 3 차원 이미지를 저장 하 고는 TIF 파일로 내보내기.
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Representative Results
그림 1 3 차원 생식 분석에 필요한 시간을 나타냅니다. 20 ° C에서 incubated L4 광고에 나온 것 germlines를 분리 해 부 되었고 DAPI, phalloidin, 및 생식 단백질에 대 한 항 체와 스테인드. Germlines는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 얼룩 그리고 confocal 현미경 검사 법 완전 한 생식 필요 수 핵의 위치를 계산, 단백질 분포를 식별, 분석 cytoskeletal 구조와 점수를 10-15 분 약 24 h. 전산 분석 필요는 정자의 수입니다. 완전 한 수동 분석 생식 당 2 시간 이상 필요 연산자 영향에 따라, 따라서, 자동화 된 우리의 높은 처리량 방법 분석 시간 단축 및 재현성을 향상 시킵니다.
자동 핵 생식 팔 집 약 1000-1200 핵 (그림 2C) 수동으로 이전 게시 데이터1점수 잘 대응 밝혀 득점. 득점의 정확도, 여러 돌연변이 다른 조건 확인 (그림 2D-G)을 사용 합니다. 예를 들어, 우리는 rnp-8(tm435), cpb-3(bt17), 및 glp-1(e2141) 돌연변이 웜 야생 타입 동물에 비교. 자동 계산 cpb 3 및 glp-1 돌연변이 germlines14,15,,1617핵의 수의 알려진된 감소 재현. 핵 수에 심각한 감소 또한 25 ° c.에서 알을 품을 때 glp-1(e2141) 온도 민감한 돌연변이에서 관찰 되었다 핵의 분포는 분화의 단계에 따라. 야생 타입에 약 250 핵 포함, mitotic 지역 핵 생식 (그림 3)1의 나머지 부분에 비해로 단단히 포장입니다. Mitotic 핵 사이의 간격이 최소 이며 핵 mitotic 지역에 걸쳐 위치 하 고 있습니다. 그러나, 핵 원심 끝에서 이동, 그들은 생식 (그림 3)의 원주 쪽으로 더 많은 나타납니다. 유통에서 변화 전환 영역에서 시작 하 고 핵 감수 분열/pachytene를 입력 완료.
생식 차별화의 여러 단계에서 특정 cytoskeletal 구조를 하고있다. 우리는 phalloidin와 생식을 얼룩에 의해 F-말라 시각. 생식의 근 위 끝에는 원심에서 F-말라의 분포 (그림 3 과 그림 5) 각 지역에서 별개 했다. 일반적으로, 두 개의 별도 구조 '실린더 내의 실린더.'로 표시 되는 Mitotic 지역에서 내부 걸 특정 모양 (그림 3)와 단단한 질량으로 나타납니다. 생식 전환 영역에 도달, 안 걸 더 원통형 구조를 가정 하 고 늦은 pachytene에 도달 하면 빈 실린더 된다. 걸의 두 번째 레이어는 생식에 모양을 주는 내부 레이어를 다루고 있습니다. 이 '실린더 내의 실린더' 말라 구조 oocyte 지역 (그림 5) 쪽으로 사라집니다. Oocyte 지역에서 말라 두꺼운 섬유도 나타납니다. oocytes는 spermatheca에 oocytes의 움직임을 허용 하도록 동적 것 처럼만 걸 rachis로 구분 됩니다. 마지막으로,는 spermatheca에 말라도 말라 섬유의 두꺼운 뭉치를 형성 한다. 그러나 섬유 포장에 표시 하는, oocyte 영역에 보다 가까이. Cytoskeletal 구조는 (그림 3) 핵의 분포 패턴을 보완 하기 위해 나타납니다. Mitotic 지역에서 핵 내부 말라 구조 배치를 나타납니다. 그들은 감수 분열/pachytene 도달, 생식 핵 (그림 3) 없는 대부분의 중간을 떠나 두 걸 실린더 사이 핵 구성 합니다. 이 생식에 중단 세포질 스트리밍 지원 아마 수 있습니다. Germlines는 REC-8 단백질에 대 한 항 체로 얼룩진 고 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석. REC-8는 생식의 초기 핵 주위 균질 분산 그리고 나중 죽 습 이며 감수 분열18동안 저하. 생식의 3 차원 횡단면 분석에서 REC-8 배포 mitotic 지역 (그림 4)에 단백질의 분포를 보여 줍니다.
생식의 근 위 끝의 3 차원 렌더링에 spermatheca 처음 세 oocytes는 spermatheca 원심 포함 됩니다. 우리의 분석 인식 각 spermatheca 151 정자의 평균 (n = 18). 이 방법 (그림 5F)19의 신뢰성을 나타내는 게시 된 문학에 해당 합니다. 이 분석은 cytoskeletal 함께 수행할 수 있습니다 또는 단백질 분포 연구. C. 선 충 게놈 6 염색체 분산 됩니다. 완전 개발된 야생 타입 oocytes에서 이러한 염색체 표시 되 고 계산 하실 수 있습니다. 이 염색체 분리 염색체 안정성 또는 다른 결함 oocyte 개발과 관련 된 연구를 사용할 수 있습니다. 3 차원 렌더링, 염색체의 수는 구상 될 수 있다, 그리고 염색체가 제대로 분리 되어, 경우 수 정확 하 게는 얻어질 수 있다 (그림 5).
그림 1 . 자동화 된 분석에 대 한 타임 라인. C. 선 충 생식의 수동 및 전산 분석 사이 시간 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 핵은 생식에 분포. (A) DAPI 스테인드 mitotic 보여주는 생식, 전환, 및 pachytene/meiotic 지역. (B) 계산는 생식의 3 차원 모델. (C) 야생 타입 germlines에서 핵의 총 수에 대 한 점수. (D-F) 핵의 수에 대 한 점수 mitotic, 전환, 및 야생 유형, rnp-8, cpb-3, 및 glp-1 돌연변이 germlines의 meiotic 지역. (G) 20 ° C와 25 ° C에서 glp-1 돌연변이에 핵의 총 수에 비교 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 학생의 테스트입니다. n < 0.0001, * * *n < 0.001, * *n < 0.01, *n < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . Cytoskeletal 구조는 생식의. (A-B) Mitotic 지역에 생식의 내부 걸 (레드) 골격의 조직. 안 말라 mitotic 지역에서 외부 걸에 비해 확산 구조를 하고있다. (C-D) Pachytene 지역에서 골격 (파란색) 핵 구성 되는 2 개의 실린더를 형성 하 여 원통형 구조를 가정 합니다. (E-F) 생식 핵 mitotic 그리고 pachytene 지역에서의 조직. 핵의 분포는 더 mitotic 지역 (녹색)에 비해 pachytene 지역에서 'germtube'의 둘레는 생식의 중간 핵 없는 되 고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . REC-8 식 mitotic 지역에서. (A) 현미경 사진 REC 8 스테인드 생식의 선단부를 보여주는. (B-C) REC-8 얼룩 (파란색으로 표시)와 mitotic 핵 (녹색) 사이 단백질의 3 차원 렌더링. REC-8 착 색이 덜 풍부 (핵을 대표 하는 하얀 점으로 표시) mitotic 지역에 인접. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 근 위 끝에 생식 구조. (A) DAPI 인접 끝에 생식의 얼룩. (B) 3 차원 렌더링 DAPI spermatheca (노란색)에서 보여주는 정자와 oocytes (흰색)에서 염색체 얼룩이 지기. (C-E) 3 차원 cytoskeletal 구조는 생식의 근 위 끝에. 레드 완전 한 근 위 끝을 표시 하 고 녹색 표시는 spermatheca. 교차 단면 분석 골격 뿐만 아니라의 oocytes, 주위 걸 filamentous 구조를 형성 하지만 oocytes 사이 분리도 보여줍니다. (F) 각 spermatheca에 여러 spermatheca에서 얻은 평균 정자의 수를 보여주는 그래프 (n = 18). 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1 . 소프트웨어 도구 설명. (A)는 관광 명소 및 핵 및 단백질 얼룩을 탐지 하기 위한 표면 도구입니다. (B-C) 3 차원 지구의 표면 도구를 사용 하 여 관심사의 선택. (D) XY-직경, 핵 탐지에 대 한 명소 도구를 사용 하 여 정의 합니다. 관심 및 얼룩의 지역에 따라 z 축 직경 및 배경 보정을 사용할 수 있습니다. (E) 최소 및 최대 강도 임계값 검출 이와 비슷한 방식을 대신 사용할 수 있습니다 표면 기능에 대 한 어디 직경, 정의 그리고 표면 세부 정보를 정의할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 목표는 정확도 개선 하 고 생식 분석에 필요한 시간을 줄일 것입니다. 준비 후에 표준 해 부 germlines의, 생식 핵의 3 차원 모델 렌더링 계산에 의해 준비 된다. 공간에 생식 핵 분포의 관찰 하면서 3 차원 렌더링은 생식의 특정 지역에서 핵의 수를 계산 합니다. 우리의 방법의 중요 한 측면 핵의 크기와 모양 매개 변수의 정확한 정의 이다. 이 얼룩이 지 고 사용 확대의 선명도에 따라 이미지를. 우리는 게시 된 데이터를 수동으로 분석1에 비교 하 여 방법의 정확성을 확인 했다. 더욱 우리의 방법의 정확도 확인, 우리 다른 조건 하에서 여러 돌연변이 사용 하 고 게시 된 문학으로 결과 확인. 그것은 또한 미묘 하 고 강한 고기-감지 하는 방법의 능력을 확인 cpb-3 및 glp-1 돌연변이, 각각. 또한,이 방법은 핵 크기와 형태는 생식 또는 심지어 긴장 사이 변화에 적응력을 보여줍니다. 이 속성은 또한 id 및 염색체와 정자 등 생식에 작은 구조의 득점 수 있습니다. 필요한 경우는 메서드 또한 크기와 모양 매개 변수에 대 한 문제 해결, 수 있습니다. 우리의 분석 수 핵은 생식에의 분포를 명료 하 고 보여주었다 핵 mitotic 그리고 pachytene 지역 다른 패턴으로 구성 됩니다. REC-8와 DAPI 얼룩 3 차원 렌더링을 적용 하 여 우리 또한 mitotic 영역의 핵 내에서 REC-8의 분포를 보였다.
말라 얼룩의 3 차원 렌더링 생식 cytoskeletal 구조의 상세한 검사를 사용할 수 있습니다. 그들은 신체 접촉을 유지는 생식 두 개의 별도 걸 구조를 나타납니다. 최상의 결과 얻으려면 관심 영역은에 mitotic 미리 선택 하는 경우 얻을 수 있습니다, 전환, 전체 생식에 대 한 골격의 재건은 단일 엔터티로 가능, meiotic 지역. 원심 생식 골격은 정의 되지 않은 모양을 있으며 인접 끝 filamentous 구조 진화. 따라서 우리의 프로토콜 말라 분포에 차이 수용 하기 위해 특정 매개 변수를 정의 하 여 생식 말라 골격의 3 차원 재구성을 수 있습니다. 분석의 가장 중요 한 측면은 핵 크기와 표면 세부 사항 요구 등 매개 변수 정의입니다. 실제 크기 아래 핵 크기를 낮추는 별도 개체로 핵 내에서 밝은 반점 선택 소프트웨어를 위험 것입니다. 마찬가지로, 높은 표면 세부 값의 정확한 3 차원 구조 손실 이어질 것입니다. 제안된 된 방법의 해 부 및 생식 얼룩의 품질 정밀도에 의존합니다. 손상 된 생식 핵의 릴리스 부정확 한 번호 매기기 일으키는 생식에서 발생할 수 있습니다. 얼룩에서 높은 배경 또한 부정확 한 핵 수와 부적 절 한 3 차원 렌더링 될 수 있습니다.
우리의 방법은 우리가 핵 번호와 유통/식 단일 프로토콜20공간에서 생식 단백질의 분석 수 있는 생식 분석의 이전에 알려진된 자동화 된 방법을 확장 합니다. 둘째, 우리의 메서드는 더 작은 구조는 생식 내 염색체 등의 득점 수 있습니다. 염색체 분리 oocyte 개발21의 중요 한 측면입니다. 우리의 방법을 사용 하 여, 번호와 어디 거리는 야생 타입 oocytes에 대 한 보정에 의해 정의 될 수 있습니다 염색체의 위치 검출 가능 하다. 이 도구를 사용 하 여 염색체 분리에 영향을 미치는 모든 돌연변이 공부 될 수 있다. 또한, 2 세포 단계에서 태아에서 염색체를 연구 메서드를 확장할 수 있습니다. 계산 분석 또한 cytoskeletal 구조를 spermatheca, oocyte 생식에서 염색체의 수에에서는 정자의 수를 제공합니다. 함께 찍은, 방법은 단일 프로토콜을 사용 하 여 분석 시간을 상당히 줄이면서 C. 선 충 생식의 포괄적인 분석을 제공 합니다. 메서드를 각 분석 (핵 수, 단백질 분포, 및 cytoskeletal 구조)에 대 한 여러 도구의 요구 사항을 제거 하 고 어떤 특정 소프트웨어에 필요한 코딩 시간을 제거 합니다. 마지막으로,이 방법은 진정 살아있는 벌레의 3 차원 분석을 포함 한 다른 웜 연구를 효과적으로 확장할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 관심의 충돌을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 그들의 기술 지원에 대 한 모나 쉬 Microimaging 감사합니다. 일부 변종 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 이 작품 모나 쉬 대학 의학 발견 친목, NHMRC 프로젝트 그랜트 (GNT1105374), NHMRC 수석 연구 친교 (GNT1137645)와 veski 혁신 친교에 의해 지원 되었다: 로저 Pocock VIF 23.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
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