Summary
نحن نقدم طريقة مؤتمتة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد من germline ايليجانس كاينورهابديتيس . أسلوبنا يحدد عدد والموقف من كل نواة داخل الخط وتحليلات germline البروتين التوزيع وهيكل cytoskeletal.
Abstract
يتم استخدام الخط ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) لدراسة عدة عمليات هامة بيولوجيا بما في ذلك ديناميات التنمية والمبرمج وكروموسوم الخلية الجذعية. بينما الفعل نموذجا رائعا، التحليل غالباً اثنان الأبعاد نظراً للوقت والعمالة اللازمة لتحليل ثلاثي الأبعاد. قراءات الرئيسية في مثل هذه الدراسات هي العدد/موقف النوى وتوزيع البروتين ضمن الفعل. نقدم هنا، طريقة لإجراء تحليل الآلي للخط استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] والنهج الحسابية لتحديد عدد وموقف النوى في كل منطقة الفعل. كما يحلل لدينا أسلوب توزيع البروتين germline التي تمكن من فحص ثلاثي الأبعاد للبروتين في التعبير في مختلف الخلفيات الوراثية. علاوة على ذلك، يبين دراستنا الاختلافات في بنية سيتوسكيليتال في مناطق متميزة الفعل أنه يمكن استيعاب متطلبات التنمية المكانية محددة. وأخيراً، تمكن لدينا طريقة العد الآلي للحيوانات المنوية في سبيرماثيكا لكل germline. أخذت معا، تمكن لدينا أسلوب التحليل المظهرية السريع واستنساخه من germline C. ايليجانس .
Introduction
يجعل المحافظة على إشارات المسارات مع الثدييات C. ايليجانس نموذجا ممتازا لدراسة متعددة العمليات البيولوجية1،2. في لدينا مختبر، نستخدم germline C. ايليجانس لدراسة تطوير الخلايا الجذعية، والمبرمج، والتعبير الجيني. بينما الفعل هيكل ثلاثي الأبعاد، العديد من الدراسات وهما الأبعاد نظراً لطبيعة تحليل ثلاثي الأبعاد تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة. أنه من المحتمل جداً أن تحليل الأبعاد قد تشوه في فيفو الأحداث في الفعل. وقد خنثي الكبار C. ايليجانس هما germline الأسلحة، كل منها يضم خلية جسدية نصيحة القاصي (DTC) الذي يحافظ على الخلايا الجرثومية القاصي في3،دولة غير متمايزة4. هذه الخلايا الجرثومية ابدأ أن يميز أنها تتحرك بعيداً عن DTC، الإفلات من تأثيرها، وتصبح بويضات والحيوانات المنوية كما أنها تصل إلى نهاية الدانية الفعل. وخلال هذه العملية، يخضع نواة الخلية الجرثومية الانقسام، قبل الانتقال إلى الانقسام الاختزالي5،6. اكتمال إنتاج الحيوانات المنوية بمرحلة اليرقات 4 (L4) التنمية، وبعد ذلك يتم إنتاج بويضات خلال مرحلة البلوغ. يتم تخزين الحيوانات المنوية في سبيرماثيكا حيث أنها تخصب بويضات لتوليد أجنة.
وهناك العديد من العوامل الوراثية والبيئية التي يمكن أن تؤثر على التنمية germline في C. ايليجانس أسفر عن تغييرات في عدد الأنوية، عدد من الأحداث أبوبتوتيك، وديناميات كروموسوم، وتعبير البروتين و/أو التعريب7 ،،من89،،من1011. تحليل هذه الأحداث تتطلب تحديد كل مرحلة من التمايز على أساس مورفولوجيا النووية والتوزيع. لدقة تحليل هذه المعلمات يدوياً مع حجم عينة كبيرة كثيفة العمالة وتستغرق وقتاً طويلاً. للالتفاف على هذه العيوب، ولتمكين اتساق التحليل، قمنا بتطوير أسلوب الآلي لفحص ثلاثي الأبعاد ل germline C. ايليجانس للنوى العد، وتوزيع الأنوية، تعبير البروتين، وسيتوسكيليتال الهيكل. بالجمع بين الفحص المجهري [كنفوكل] التقديم ثلاثي الأبعاد، نحن إنشاء معلمات حجم وشكل للتعرف على كل مرحلة من تمايز الخلية الجرثومية. علاوة على ذلك، يتيح هذا الأسلوب عد نواة الخلية الجرثومية والحيوانات المنوية بالإضافة إلى سجل لعدد الصبغيات في كل البويضات.
هيكل حاسم واحد في الفعل هو سيتوسكيليتون، الذي يوفر الاستقرار إلى حجرة germline والجري هيولى الإيدز والحماية بالفعل أنوية12. استخدام التقديم الحسابية، نحن إجراء إعادة البناء ثلاثي الأبعاد ل germline cytoskeleton وتحديد السمات المميزة سيتوسكيليتال ضمن الفعل. هنا، يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لتوضيح التحليل الحسابي كيف جنبا إلى جنب مع [كنفوكل] التصوير يتيح تحليلاً شاملا ل germline C. ايليجانس .
ونحن نقترح طريقة سريعة لتحليل ثلاثي الأبعاد C. ايليجانس germline (الشكل 1). استخدام تحليل ثلاثي الأبعاد، فمن الممكن لدراسة توزيع ثلاثي الأبعاد من نوى germline (الشكل 2 و الشكل 3)، الآلي عد الخلايا (الشكل 2)، إعادة إعمار cytoskeleton germline ( 3 الرقم)، توزيع البروتينات (الشكل 4)، وسجل عدد الحيوانات المنوية في سبيرماثيكا والصبغيات في بويضات (الشكل 5). الأسلوب ليس فقط تمكن الكمي سهل ودقيق للخط ولكن يحدد تعمل فسيولوجيا ذات الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد وتربية دودة
ملاحظة: تشير الجدول للمواد لجميع معلومات المنتج.
- OP50 الإشريكيّة القولونية الثقافة: الثقافة البكتيريا OP50 في مرق ليسوجيني (رطل) (تريبتوني 1%، الخميرة 0.5%، 0.5% كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون المضادات الحيوية.
- البذور 400 ميليلتر من البكتيريا OP50 لنمو السلكية وسائط الإعلام (NGM) لوحات (1.5 غرام من كلوريد الصوديوم، ز 8.5 من أجار، ز 1.25 من ببتون، 1 مل 1 م كاكل2، 1 مل 5 ملغ/مل الكولسترول في الإيثانول، 1 مل 1 م MgSO4 ، و 25 مل من المخزن المؤقت4 مشرف 1 متر) والهواء الجاف للبكتيريا ح 48.
- اختيار الديدان في المصنف NGM لوحات واحتضان في 15 درجة مئوية أو 20 درجة مئوية.
- لتحليل germline خنثي الكبار، انتقاء جيدا تغذية الديدان L4 المرج البكتيرية واحتضان بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية.
- لتسجيل عدد الحيوانات المنوية في المنحرفين، احتضان الديدان L4 في 20 درجة مئوية ح 12 حتى تصل الديدان إلى تساقط L4/الكبار. لمزامنة الديدان إلى مرحلة L4، تحضير البيض بالتقاط الديدان الكبار مع الكثير من البيض في حل التبييض (1 م هيدروكسيد الصوديوم والتبييض بنسبة 1:1). السماح للبيض يفقس وانتقاء الحيوانات L4 للتجربة.
- إعداد شرائح المجهر تفلون بوضع 25 ميليلتر من حل بولي-L-يسين على الشريحة ونشر الحل أيضا، استخدام تلميح ماصة. بعد إزالة الزائدة بولي-L-يسين مع منشفة ورقية، السماح للشرائح للهواء الجاف واحتضان الشرائح عند 65 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.
2-Germline تشريح والمصبوغة6،13
- بقعة 10 ميليلتر من تيتراميسولي 0.01 ٪ (مخدر) في ساترة 22 مم × 22 مم وانتقاء البالغ من العمر اليوم واحدة من الديدان الكبار في ذلك.
- تشريح الدودة في الذيل كما أنه يصبح مخدراً استخدام المحاقن (5 مل) وابرة (24 "× 1")، والتأكد من أنه الفعل غير معطوب.
ملاحظة: يجب إجراء التشريح قبل الدودة يصبح مشلولا تماما حيث أن الضغط السلبي في حركة الدودة والدودة المعونة طرد الفعل. للتهديف الحيوانات المنوية، يجب اتخاذ الاحتياطات لا على الضرر سبيرماثيكا بالإبرة خلال التشريح. تجنب لمس الفعل مع الإبرة ما عدا النقطة التشريح بعد سبيرماثيكا. إذا كان هناك كسر في حجرة germline أو يتم ملاحظة أي إفرازات من الخط، ينبغي عدم استخدام الفعل للتحليل. - ضع ساترة مقلوب على شريحة مغلفة بولي-L-يسين، إبقاء germline تشريح على الشريحة.
- إزالة السائل الزائد تحت ساترة بوضع برج ورق في زاوية ساترة، ثم مكان الشريحة في نيتروجين سائل لإزالة الحد الأدنى 1 بسرعة ساترة استخدام إبرة مع جيرملينيس على الشريحة.
- نقل الشرائح إلى الميثانول-20 درجة مئوية ل 30-60 ثانية في دائرة، ثم احتضانها لمدة 30 دقيقة في الحل تحديد الطازجة (1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تحتوي على 0.08 م حبيس pH 6.9، 1.6 مم MgSO4، 0.8 ملم جليكول-bis(beta-aminoethyl خماسي البروم ثنائي الفينيل)-ن، ن، ن '، ن'--بارافورمالدهيد tetraacetic حمض (عطا)، و 3.7 في المائة) في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل الشرائح عن طريق وضع في دائرة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني x 1، الرقم الهيدروجيني 7.4 مع 0.1% توين-20 للحد الأدنى 10 تكرار هذه الخطوة مرة واحدة.
- كتلة جيرملينيس مع 30 ميليلتر من عرقلة الحل (30% مصل الماعز أعدتها إضافة 900 ميليلتر من مصل الماعز في 1700 ميليلتر من المقطر ح2س و 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 10) في دائرة رطبة على استعداد بوضع منشفة ورقية رطبة في مربع بلاستيك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 50 ميليلتر من حل جسم REC-8 إعداد مصل الماعز 30% في رافعة نسبة لكل عينة. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- يغسل الشرائح عن طريق وضع في دائرة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني x 1 مع 0.1% توين-20 للحد الأدنى 10 كرر الخطوة مرة واحدة وإزالة السائل الزائد بوضع منشفة ورقية في زاوية الشريحة.
- تحضير حل جسم الثانوية بتمييع fluorophore الخضراء (488 نانومتر الانبعاثات الطول الموجي) الأجسام المضادة مترافق الثانوي (1: 1000)، فالويدين (أكتين وصمة عار، 1:4000) و DAPI (الحمض النووي وصمة عار، 1:4000) في مصل الماعز العادي 30%.
- إضافة 50 ميليلتر من حل جسم الثانوية إلى الشريحة.
- احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل الشرائح مرتين عن طريق وضع في دائرة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني x 1 مع 0.1% تمحو توين-20 للحد الأدنى 10 السائل الزائد.
- إضافة 30 ميليلتر من تحديد الكاشف على الشريحة ومكان 12 مم2 × 1.5 ميكرومتر ساترة في الأعلى وجاف الشرائح عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
3-[كنفوكل] مجهرية
- قم بتشغيل المجهر [كنفوكل]، وأشعة الليزر والماسح الضوئي رنانة البرمجيات مجهر [كنفوكل]. ضع الشرائح مع جيرملينيس الملون على حامل الشرائح أعلاه الهدف X 63.
- موقع الفعل، التركيز على الجزء العلوي الخط ووضع علامة عليه باستخدام البرمجيات مجهر [كنفوكل]. وبالمثل التركيز على الجزء السفلي من الخط ووضع علامة عليه تحديد سمك الخط الإجمالية.
- صورة germline كامل عن طريق تحديد سمك كل شريحة ما يصل إلى 0.5 ميكرومتر. مارك germline كاملة واقتناء ابدأ. مسح كل شريحة 8 مرات، ومتوسط القيم لتحسين جودة الصورة. وسوف تسمح الماسح الضوئي رنانة مسح سريع لتجنب تبيض أثناء التصوير. إذا لم يكن لديه المجهر ماسح رنانة، تقليل عدد عمليات التفحص إلى أربعة لتجنب تبيض.
4-وظيفة التصوير تحليل الأنوية العدد والتوزيع
ملاحظة: تشير التكميلية الرقم 1 للقطات من البرامج والأدوات والأزرار المستخدمة.
- استيراد الصورة إلى إيماريس 8.4.1 أو الإصدارات الأحدث من البرنامج.
- تعريف المنطقة الانقسامية والمنطقة الانتقالية والمنطقة هو، المنطقة البويضات وسبيرماثيكا الفعل بتحديد مورفولوجيا النووية في كل منطقة.
- استخدم الزر الدالة السطحية ("تكميلية الشكل" 1A) من البرنامج لتحديد منطقة الفائدة.
- إلغاء معالج إنشاء السطح التلقائي ورسم منطقة الفائدة في الشريحة الأولى والأخيرة من الصورة يدوياً من المكدس ثلاثي الأبعاد.
- انقر فوق إنشاء سطح.
ملاحظة: سيضع البرنامج تلقائياً إلى الكدسات بين مكدس الأول والأخير. - قناع كل القنوات ما عدا DAPI بواسطة النقر فوق زر قناة قناع ("تكميلية الشكل" 1B--جيم).
- تعريف معلمات حجم النووية باستخدام زر الدالة بقعة ("تكميلية الشكل" 1A). لمنطقة الانقسامية، تعريف قطر س ص 2 ميكرومتر بينما يترك القطر Z غير معروف. الانتقال لمنطقة تعريف قطر س ص 2 ميكرومتر وقطر Z ك 1.5 ميكرومتر. (تكميلية الشكل 1).
ملاحظة: استكشاف الأخطاء وإصلاحها في أقطار وفقا للتكبير والمواصفات من المجهر. للبروتوكول الحالي، هدف استخدامها 63 X وتقدم إضافي مرات 1.70 التكبير أثناء التصوير. إذا تم تغيير الهدف، على سبيل المثال 40 X، يجب تغيير في الأقطار تبعاً لذلك. ينبغي القيام باستكشاف الأخطاء وإصلاحها مع جيرملينيس wildtype إنشاء المعلمات الصحيحة. منطقة الانقسامية في ذراع germline نوع البرية بحوالي 250 الأنوية. وينبغي تعديل القطر لتحقيق هذه القيمة. استخدام جيرملينيس 15 على الأقل لتحديد القيمة المثلى للقطر. ينبغي استخدام نهج مماثل لمعايرة في المنطقة الانتقالية (نويات 150-170) وهو منطقة (600-700 نوى). - تقييد الكشف عن بقع بتعريف الحد الأدنى (1E الشكل التكميلية). استخدام DAPI الملون جيرملينيس نوع البرية تحديد عتبة الحد الأدنى بزيادة عتبة الحد الأدنى التقديم ثلاثي الأبعاد حتى يظهر الموقع الأول خارج الفعل.
- حفظ الصورة والحصول على عدد الأنوية من الجدول إنشاؤها تلقائياً بواسطة البرنامج. تصدير الصور كملفات TIF.
5-مرحلة ما بعد التصوير التحليل للتهديف الحيوانات المنوية وعدد الصبغيات
- أداء العرض ثلاثي الأبعاد بتحديد سبيرماثيكا كالمنطقة للفائدة. للكشف عن كل الحيوانات المنوية، وتحديد قطر بقعة بين 0.75-µm 1.0 ل X والمحور Y، بينما قطر ض ما زال غير معروف. استخدم الزر دالة البقع كما هو موضح في التكميلية الرقم 1.
- طرح الخلفية التي تدق خلفية طرح مربع واستخدام خلفية تصحيح القيم المحسوبة بالبرنامج (تكميلية الشكل 1).
ملاحظة: البرامج إيماريس يختار النقاط عالية الكثافة أولاً، ولذلك أثر الخلفية الحد الأدنى ما دام هناك فرق كبير بين منطقة الاهتمام والخلفية. طريقة ثانية تحديد تصحيح الخلفية يدوياً، وعند الاقتضاء قيم يمكن أن تعطي للخلفية. التصحيح اليدوي الخلفية سيكون مناسباً إذا كانت كثافة العينات المستقلة تحتاج المقارنة. - ضبط عتبة التقديم ثلاثي الأبعاد للكشف عن جميع الحيوانات المنوية DAPI الملون في سبيرماثيكا (1E الشكل التكميلية).
- لعد كروموسوم، تحديد قطر بقعة < ميكرومتر 0.75 ل X والمحور Y قبل وضع نماذج ثلاثية الأبعاد.
- احفظ الصورة وتصديرها كملف TIF.
6-مرحلة ما بعد التصوير التحليل لإعادة إعمار سيتوسكيليتال الفعل
- تحديد المنطقة للاهتمام الفعل وتخفي جميع القنوات إلا فالويدين بواسطة النقر فوق زر قناع القنوات .
- تعريف تفاصيل سطح من 0.25 ميكرومتر باستخدام الزر دالة السطحية (تكميلية الشكل 1).
ملاحظة: هذا يعني كل 0.25 ميكرومتر سيتم تقديمها إلى نماذج ثلاثية الأبعاد. تفاصيل السطح يمكن أن تكون ثابتة لأي منطقة الخط حيث سيتم إنشاء نموذج سطح ثلاثي الأبعاد لكل 0.25 ميكرومتر. ومع ذلك، يمكن زيادة تفاصيل السطح لمنطقة البويضيه، إلى 0.35-0.5 ميكرومتر سبب وجود ألياف الأكتين واضحة المعالم في هذه المنطقة. - طرح الخلفية التي تدق خلفية طرح مربع واستخدام خلفية تصحيح القيم المحسوبة بالبرنامج (تكميلية الشكل 1).
- ضبط عتبة التقديم ثلاثي الأبعاد اعتماداً على هيكل تتطلب التحليل (1E الشكل التكميلية).
- حفظ الصورة ثلاثية الأبعاد المتقدمة وتصديره كملف TIF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يشير الرقم 1 إلى الوقت اللازم لتحليل الخط ثلاثي الأبعاد. تشريح لعزل جيرملينيس المنحرفين L4 المحتضنة عند 20 درجة مئوية والملون مع DAPI، فالويدين، والأجسام المضادة ضد germline البروتينات. جيرملينيس يتم تصويرها باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. مجهرية المصبوغة و [كنفوكل] يتطلب حوالي 24 h. التحليل الحسابي للخط الكامل يتطلب 10-15 دقيقة عد عدد والموقف من النوى، وتحديد توزيع البروتين، تحليل هيكل سيتوسكيليتال ونقاط عدد الحيوانات المنوية. التحليل اليدوي الكامل يتطلب أكثر من 2 ح للخط الواحد، ويخضع لتأثير عامل، ولذلك، لدينا أسلوب الفائق الآلي يقلل من الوقت تحليل ويعزز إمكانية تكرار نتائج.
الآلي نويات التهديف يكشف أن ذراع germline المنازل تقريبا 1,000-1,200 نوى (الشكل 2ج)، المقابلة جيدا مع دليل المنشورة سابقا سجل البيانات1. للتأكد من دقة التهديف وطفرات متعددة وظروف مختلفة المستخدمة (الشكل 2د-ز). على سبيل المثال، يمكننا مقارنة rnp-8(tm435)، cpb-3(bt17)، والديدان glp-1(e2141) متحولة إلى الحيوانات البرية نوع. العد الآلي مستنسخة المعروفة خفض عدد الأنوية في cpb-3 و glp-1 جيرملينيس متحولة14،15،،من1617. ولوحظ أيضا انخفاض حاد في عدد الأنوية في المسخ حساسة للحرارة glp-1(e2141) عندما المحتضنة عند 25 درجة مئوية. توزيع الأنوية فيعتمد على مرحلة التمايز. منطقة الانقسامية التي تحتوي على حوالي 250 الأنوية في نوع البرية، معبأة بأحكام مع نويات مقارنة ببقية الخط (الشكل 3)1. التباعد بين الأنوية الانقسامية الحد الأدنى ونوى تقع في جميع أنحاء المنطقة الانقسامية. ومع ذلك، الأنوية تتحرك بعيداً عن النهاية البعيدة، تظهر أكثر نحو محيط germline (الشكل 3). التغير في التوزيع يبدأ في المنطقة الانتقالية واكتمال الأنوية تدخل الانقسام الاختزالي/باتشيتيني.
وقد الفعل هياكل cytoskeletal محددة في مراحل مختلفة من التفرقة. يمكننا تصور واكتين تلطيخ الفعل مع فالويدين. وكان توزيع F-أكتين من القاصي إلى نهاية الدانية الفعل متميزة في كل منطقة (الشكل 3 و الشكل 5). وبصفة عامة، هناك هياكل منفصلة اثنين التي تظهر ك 'اسطوانة داخل اسطوانة'. في المنطقة الانقسامية، يظهر أكتين الداخلية ككتلة صلبة بشكل معين (الشكل 3). كما يصل الفعل إلى منطقة انتقالية، أكتين الداخلية يفترض وجود هيكل أسطواني أكثر ويصبح اسطوانة جوفاء ما يصل إلى باتشيتيني الراحل. الطبقة الثانية من أكتين تغطي الطبقة الداخلية في شكلها الفعل. يختفي هذا الهيكل أكتين 'اسطوانة داخل اسطوانة' نحو منطقة البويضيه (الشكل 5). في المنطقة البويضيه، يظهر أكتين كألياف سميكة. تكون مفصولة بويضات الفقري أكتين، على الرغم من أنه يبدو أن دينامية السماح بتنقل بويضات سبيرماثيكا. أخيرا، تشكل أكتين في سبيرماثيكا أيضا حزم سميكة من ألياف الأكتين. ومع ذلك، تظهر الألياف لتكون معبأة أوثق مما في منطقة البويضات. يظهر هيكل cytoskeletal استكمالا لأنماط توزيع الأنوية (الشكل 3). في المنطقة الانقسامية، تظهر الأنوية لتوضع حول هيكل الأكتين الداخلية. كما أنها تصل إلى الانقسام الاختزالي/باتشيتيني، تنظيم الأنوية بين اثنان اسطوانات أكتين ترك منتصف الخط معظمها خالية من النواة (الشكل 3). وهذا يمكن أن تساعد ربما الجري هيولى بلا انقطاع في الفعل. كانت ملطخة بجسم مضاد ضد البروتين REC-8 جيرملينيس وتحليلها بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل]. REC-8 البلوتينيوم وتوزع حول نويات المبكر الفعل وهو في وقت لاحق المشقوق والمتدهورة خلال الانقسام الاختزالي18. ويبين توزيع 8 تفصيل في تحليل مقطعية ثلاثية الأبعاد الفعل توزيع البروتين في منطقة الانقسامية (الشكل 4).
ويشمل التقديم ثلاثي الأبعاد لنهاية الدانية الفعل في سبيرماثيكا وأول ثلاث بويضات القاصي سبيرماثيكا. تحليلنا المعترف بها في متوسط للحيوانات المنوية 151 في كل سبيرماثيكا (n = 18). وهذا يتوافق مع الكتابات المنشورة، مما يشير إلى مدى موثوقية الأسلوب (الشكل 5و)19. يمكن إجراء هذا التحليل جنبا إلى جنب مع سيتوسكيليتال أو دراسات توزيع البروتين. وتوزع الجينوم C. ايليجانس بين ستة من الكروموسومات. في بويضات نوع البرية نمواً كاملا، هذه الكروموسومات مرئية ويمكن أن تحسب. يمكن استخدام هذا الفصل الصبغي لدراسة استقرار كروموسوم أو غيرها من العيوب المرتبطة بتنمية البويضات. التقديم ثلاثي الأبعاد، يمكن تصور العدد الكروموسومات، وإذا كانت الكروموسومات مفصولة بشكل صحيح، العدد يمكن دقة الحصول على (الشكل 5).
الشكل 1 . الإطار الزمني للتحليل الآلي- الوقت مقارنة بين تحليل germline C. ايليجانس اليدوية والحاسوبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . توزيع الأنوية في الفعل- (أ) DAPI الملون germline عرض الانقسامية والانتقال، ومناطق باتشيتيني/هو. (ب) الحسابية نموذج ثلاثي الأبعاد من الخط. (ج) سجل لإجمالي عدد الأنوية في نوع البرية جيرملينيس. (د-و) وسجل لعدد الأنوية في الانقسامية، مرحلة انتقالية، وهو مناطق جيرملينيس متحولة نوع البرية رنب-8، cpb-3و glp-1 . (ز) مقارنة بإجمالي عدد الأنوية في المسخ glp-1 في 20 درجة مئوية و 25 درجة مئوية. يمثل الشريط خطأ الخطأ القياسي. اختبار الطالب. n < 0.0001، * * *ن < 0.001، * *n < 0.01، *n < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . هيكل سيتوسكيليتال الفعل. (أ-ب) منظمة cytoskeleton أكتين الداخلية (الأحمر) للخط في منطقة الانقسامية. أكتين الداخلية لديها بنية منتشر مقارنة أكتين الخارجي في منطقة الانقسامية. (ج-د) في منطقة باتشيتيني، ويفترض cytoskeleton هيكل أسطواني بتشكيل اثنان اسطوانات بين التي تنظم الأنوية (أزرق). (ه-و) تنظيم الأنوية germline في منطقتي الانقسامية وباتشيتيني. توزيع الأنوية أكثر نحو محيط 'جيرمتوبي' في منطقة باتشيتيني مقارنة بالمنطقة الانقسامية (الأخضر) والأوسط الخط أصبح خاليا من النوى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . التعبير REC-8 في منطقة الانقسامية. (أ) صورة مجهرية تبين نهاية القاصي الفعل 8 الملطخة REC. (ب-ج) التقديم ثلاثي الأبعاد لتلطيخ REC-8 (يظهر باللون الأزرق) وتوزيع البروتين بين الأنوية الانقسامية (الأخضر). تلوين REC-8 أقل وفرة الدانية إلى منطقة الانقسامية (تميز بالنقاط البيضاء يمثلون نواة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . هيكل Germline في نهاية الدانية. (أ) DAPI تلطيخ للخط في نهاية الدانية. (ب) ثلاثي الأبعاد التقديم من DAPI تلطيخ الحيوانات المنوية تظهر في سبيرماثيكا (أصفر) والصبغيات في بويضات (أبيض). (ج-ه) هيكل سيتوسكيليتال ثلاثية الأبعاد في نهاية الدانية الفعل. الأحمر يمثل نهاية الدانية كاملة والأخضر علامات سبيرماثيكا. عبر تحليل قطاعات يظهر أن cytoskeleton يشكل ليس فقط بنية الخيطية من أكتين حول بويضات ولكن يفصل أيضا بين بويضات. (و) رسم بياني يبين عدد الحيوانات المنوية في كل سبيرماثيكا والتي تم الحصول عليها من سبيرماثيكا متعددة في المتوسط (n = 18). يمثل الشريط خطأ الخطأ القياسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية رقم 1 . أدوات البرمجيات وصف. (أ) البقع وأدوات السطحية للكشف عن نوى وتلطيخ البروتين. (ب-ج) اختيار منطقة الاهتمام باستخدام أداة سطح ثلاثي الأبعاد. (د) تحديد س ص-القطر، باستخدام أداة البقع، للكشف عن الأنوية. تبعاً للمنطقة من اهتمام وتلطيخ، يمكن استخدام تصحيح محور ع قطر والخلفية. (ه) كحد أدنى وأقصى شدتها عتبة الكشف. يمكن أن تستخدم نهجاً مماثلاً للدالة السطحية حيث بدلاً من تحديد القطر، ويمكن تعريف تفاصيل السطح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والهدف من هذا البروتوكول هو تحسين الدقة وتقليل الوقت اللازم لتحليل الخط. بعد إعداد قياسية من جيرملينيس تشريح، إعداد نموذج ثلاثي الأبعاد لنوى germline التقديم الحسابي. بينما يسمح لمراقبة توزيع الأنوية germline في الفضاء، التقديم ثلاثي الأبعاد بحساب عدد الأنوية في مناطق محددة الفعل. الجوانب البالغة الأهمية في أسلوبنا تعريف دقيق لمعلمات حجم وشكل نواة. وهذا يعتمد على الوضوح في تلطيخ والتكبير المستخدمة للصورة. نحن يؤكد دقة الأسلوب بمقارنة لنشر البيانات يدوياً تحليل1. لزيادة التأكد من دقة أسلوبنا، استخدمنا طفرات متعددة تحت ظروف مختلفة وأكدت النتائج مع الكتابات المنشورة. وأكدت أيضا قدرة الأسلوب على كشف تعمل خفية وقوية-طفرات cpb-3 و glp-1 ، على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر هذا الأسلوب القدرة على التكيف للتغيرات في حجم الخصيتين والشكل ضمن الفعل أو حتى بين السلالات. كما تتيح هذه الخاصية تحديد الهوية والتهديف هياكل أصغر في الخط مثل الكروموسومات والحيوانات المنوية. الأسلوب يسمح أيضا مواصلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمعلمات الحجم والشكل، إذا لزم الأمر. كان قادراً على توضيح توزيع الأنوية في germline تحليلنا وأظهرت أن الأنوية في الانقسامية ويتم تنظيم المناطق باتشيتيني في أنماط مختلفة. عن طريق تطبيق التقديم ثلاثي الأبعاد لتفصيل-8 وتلطيخ DAPI، كما أظهر توزيع 8 تفصيل داخل نواة لمنطقة الانقسامية.
تمكين التقديم ثلاثي الأبعاد لتلطيخ أكتين دراسة مفصلة لهياكل germline cytoskeletal. يبدو الفعل أن هيكلين منفصلين أكتين، على الرغم من أنهم الحفاظ على الاتصال الجسدي. بينما الممكن إعادة إعمار سيتوسكيليتون للخط أكمله ككيان واحد، الحصول على أفضل النتائج يمكن الحصول عليها إذا هي مقدما تحديد المناطق ذات الأهمية في الانقسامية، وتمر بمرحلة انتقالية، وهو من المناطق. Cytoskeleton germline البعيدة بشكل غير محدد ويتطور إلى بنية الخيطية في نهاية الدانية. ولذلك يمكن لدينا بروتوكول إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من cytoskeleton أكتين germline بتحديد معالم محددة لاستيعاب الاختلافات في توزيع أكتين. الجانب الأكثر أهمية للتحليل هو تعريف المعلمات مثل حجم الأنوية واشتراط تفاصيل السطح. خفض حجم الأنوية أدناه الحجم الفعلي سوف خطر البرمجيات لاختيار النقاط المضيئة داخل نواة ككائنات منفصلة. وبالمثل، قيم التفاصيل السطحية العالية سيؤدي إلى فقدان الهياكل ثلاثية الأبعاد دقيقة. الطريقة المقترحة تعتمد على دقة التشريح ونوعية تلطيخ germline. Germline تالفة قد يؤدي إلى الإفراج عن نواة من الخط، مما تسبب في الترقيم غير صحيحة. كما سيؤدي ارتفاع الخلفية من تلطيخ عدد الأنوية غير دقيقة وغير لائق التقديم ثلاثي الأبعاد.
لدينا طريقة يوسع أساليب الآلي المعروفة سابقا من تحليل الخط حيث أننا قادرون على تحليل عدد الأنوية والتوزيع/تعبير البروتينات germline في الفضاء مع بروتوكول واحد20. ثانيا، لدينا طريقة تمكن التهديف هياكل أصغر مثل الكروموسومات داخل الفعل. العزل الصبغي أحد جوانب هامة ل التنمية البويضيه21. استخدام أسلوب لدينا، من الممكن الكشف عن عدد والموقف من الكروموسومات حيث يمكن تعريف المسافة بمعايرة ضد بويضات نوع البرية. أي الطفرة التي تؤثر على فصل الكروموسوم يمكن دراستها باستخدام هذه الأداة. أيضا، يمكن تمديدها الأسلوب لدراسة الكروموسومات في الأجنة في المرحلة 2-الخلية. ويوفر التحليل الحسابي أيضا عدد الحيوانات المنوية في سبيرماثيكا، عدد الكروموسومات بالبويضات والخط هياكل cytoskeletal. أخذت معا، الأسلوب يوفر تحليلاً شاملا ل germline C. ايليجانس استخدام بروتوكول واحد مع تقليل وقت التحليل إلى حد كبير. الأسلوب الذي يلغي شرط أدوات متعددة لكل تحليل (عدد الأنوية وتوزيع البروتين، وهيكل سيتوسكيليتال) ويزيل الوقت الترميز المطلوب في أي برامج محددة. أخيرا، يمكن توسيع هذا الأسلوب الفعال للدراسات دودة الأخرى بما في ذلك تحليل ثلاثي الأبعاد من الديدان يعيش مخدراً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونشكر ميكرويماجينج موناش لتقديم الدعم التقني لهم. وقدمت بعض سلالات كاينورهابديتيس مركز علم الوراثة، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). هذا العمل كان يدعمها زمالة اكتشاف الطب الحيوي جامعة موناش، ومنحة مشروع NHMRC (GNT1105374)، NHMRC أقدم زمالة بحثية (GNT1137645) والزمالة الابتكار فيسكي: 23 VIF لروجر بوكوك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
