Summary
Nous présentons une méthode automatisée pour une reconstruction tridimensionnelle de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans . Notre méthode détermine le nombre et la position de chacun des noyaux dans les cellules germinales et l’analyses germline PROTÉINE distribution et la structure du cytosquelette.
Abstract
La lignée germinale Caenorhabditis elegans (c. elegans) est utilisée pour étudier plusieurs processus biologiquement importants, y compris la dynamique de développement, l’apoptose et chromosomes cellules souches. Alors que la lignée germinale est un excellent modèle, l’analyse est souvent bidimensionnelle en raison de l’heure et la main-d'oeuvre requise pour l’analyse en trois dimensions. Grands afficheurs dans de telles études sont la nombre et la position des noyaux et la distribution des protéines au sein de la lignée germinale. Nous présentons ici une méthode pour exécuter une analyse automatisée de la lignée germinale, à l’aide de la microscopie confocale et approches informatiques pour déterminer le nombre et la position des noyaux dans chaque région de la lignée germinale. Notre méthode analyse également la distribution de protéines de cellules germinales qui permet l’examen en trois dimensions de l’expression de la protéine dans différents fonds génétiques. De plus, notre étude montre des variations dans l’architecture du cytosquelette dans des régions distinctes de la lignée germinale qui peut tenir compte des exigences spécifiques de développement spatiales. Enfin, notre méthode permet un comptage automatisé du sperme dans la spermathèque de chaque lignée germinale. Pris ensemble, notre méthode permet une analyse phénotypique rapide et reproductible de la lignée germinale de c. elegans .
Introduction
La conservation des voies avec mammifères de signalisation fait c. elegans , un excellent modèle pour étudier plusieurs processus biologiques1,2. Dans notre laboratoire, nous utilisons la lignée germinale de c. elegans pour étudier le développement de cellules souches, l’apoptose et l’expression des gènes. Alors que la lignée germinale est une structure tridimensionnelle, de nombreuses études sont deux dimensions étant donné la nature de longues et fastidieuse de l’analyse en trois dimensions. Il est fort probable que l’analyse bidimensionnelle peut fausser in vivo d’évenements dans la lignée germinale. L’hermaphrodite adulte de c. elegans a deux branches de la lignée germinale, dont chacune abrite une cellule somatique distale (DTC) qui maintient les cellules germinales distales dans l’État indifférencié3,4. Ces cellules germinales commencent à faire la différence car ils s’éloigner de la CRN, échapper à son influence et devenir des ovocytes et du sperme qu’ils atteignent l’extrémité proximale de la lignée germinale. Au cours de ce processus, les noyaux de cellules germinales subissent une mitose, avant de passer à la méiose5,6. La production de spermatozoïdes est complétée par le stade larvaire 4 (L4), la mise au point, après quoi les ovocytes sont produites au cours de l’âge adulte. Les spermatozoïdes sont stockés dans la spermathèque où ils féconder les ovocytes à produire des embryons.
Il y a plusieurs facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent influencer le développement des cellules germinales chez c. elegans , entraînant des changements dans le nombre de noyaux, nombre d’événements apoptotiques, dynamique des chromosomes et expression de la protéine ou localisation7 ,8,9,10,11. L’analyse de ces événements nécessite l’identification de chaque étape de la différenciation basée sur la distribution et de la morphologie nucléaire. Afin d’analyser avec précision ces paramètres manuellement avec un grand échantillon est long et fastidieux. Pour contourner ces inconvénients et activez la cohérence de l’analyse, nous avons développé une méthode automatisée pour examen en trois dimensions de la lignée germinale de c. elegans pour compter les noyaux, distribution de noyaux, expression de la protéine et du cytosquelette structure. En combinant la microscopie confocale à rendu tridimensionnel, nous avons généré des paramètres de taille et de forme pour l’identification de chaque étape de la différenciation des cellules germinales. En outre, cette méthode permet de comptage des noyaux de cellules germinales et sperme plus marqué du nombre de chromosomes dans chaque ovocyte.
Une structure cruciale dans la lignée germinale est le cytosquelette, qui assure la stabilité de la lignée germinale compartiment, la cyclose sida et la protection de noyaux de cellules germinales12. Utilisant le calcul rendu, nous avons effectué une reconstruction tridimensionnelle du cytosquelette des cellules germinales et identifié les caractéristiques du cytosquelette distinctes au sein de la lignée germinale. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour illustrer comment calcul analyse combinée d’imagerie confocale permet analyse détaillée de la lignée germinale de c. elegans .
Nous proposons une méthode rapide pour l’analyse tridimensionnelle de c. elegans lignée germinale (Figure 1). Selon l’analyse en trois dimensions, il est possible d’étudier la distribution tridimensionnelle des noyaux des cellules germinales (Figure 2 et Figure 3), automatisée comptage des cellules (Figure 2), reconstruction du cytosquelette germinale ( Figure 3), distribution des protéines (Figure 4) et ayant marqué le nombre de chromosomes dans les ovocytes (Figure 5) et de sperme dans la spermathèque. La méthode ne permet un dosage simple et précis de la lignée germinale mais identifie des phénotypes physiologiquement pertinents.
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Protocol
1. préparation et l’élevage du ver
Remarque : Consultez la Table des matières pour toutes les informations.
- OP50 Escherichia coli culture : la culture de bactéries OP50 dans un bouillon de lysogénie (LB) (1 % de tryptone, levure 0,5 %, 0,5 % de NaCl, pH 7,0) pendant une nuit à 37 ° C, sans antibiotiques.
- Graines de 400 µL de bactéries OP50 aux plaques de médias (NGM) croissance nématode (à 1,5 g de NaCl, 8,5 g d’agar-agar, 1,25 g de peptone, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de cholestérol 5 mg/mL dans de l’éthanol, 1 mL de 1 M MgSO4 et 25 mL de tampon de4 M 1 KPO) et sécher à l’air les bactéries pendant 48 h.
- Prendre vers sur les plaques NGM ensemencés et incuber à 15 ° C ou 20 ° C.
- Pour l’analyse de l’adulte germline hermaphrodite, choisissez bien nourris vers L4 à la pelouse bactérienne et incuber une nuit à 20 ° C.
- Pour marquer le nombre de spermatozoïdes dans hermaphrodites, incuber vers L4 à 20 ° C pendant 12 h jusqu'à ce que les vers atteignent la mue L4/adulte. Pour synchroniser les vers le stade L4, préparer les œufs en choisissant vers adultes avec beaucoup d’oeufs dans une solution d’eau de Javel (1 NaOH M et eau de Javel dans la proportion 1:1). Laisser les œufs éclosent et choisir L4 animaux pour l’expérience.
- Préparer des lames de microscope de téflon en plaçant 25 µL de solution de la poly-L-lysine dans la diapositive et encollage bien, la solution en utilisant un embout de la pipette. Après avoir retiré la poly-L-lysine excédentaire avec du papier essuie-tout, laisser les lames à l’air sec et incuber les lames à 65 ° C pendant 15-20 min.
2. cellules germinales Dissection et coloration6,13
- Spot 10 µL de 0,01 % Tétramisole (anesthésique) sur une lamelle de 22 × 22 mm et ramasser les vers adultes âgés d’un jours dedans.
- Disséquer le ver à la queue comme il devient sous sédation à l’aide d’une seringue (5 mL) et une aiguille (24 "x 1") et faire en sorte que les cellules germinales n’est pas endommagé.
Remarque : La dissection doit être effectuée avant que le ver devient entièrement paralysé alors que la pression négative dans le ver et le mouvement ver aide l’éjection de la lignée germinale. Pour la notation des spermatozoïdes, les précautions doivent être prises ne pas d’endommager la spermathèque par l’aiguille au cours de la dissection. Évitez de toucher la lignée germinale avec l’aiguille à l’exception du point de dissection après la spermathèque. Si il n’y a casser dans le compartiment de cellules germinales ou tout rejet de la lignée germinale est observée, la lignée germinale ne devrait pas servir à l’analyse. - Placer la lamelle inversée sur une glissière enduite poly-L-lysine, gardant la lignée germinale disséquée sur la diapositive.
- Retirer le liquide en excès sous le couvre-objet en plaçant une tour de papier à un angle de la lamelle couvre-objet, puis place la lame dans l’azote liquide pour 1 min. Retirer rapidement la lamelle à l’aide d’une aiguille avec la germlines sur la diapositive.
- Transférer les lames dans le méthanol de-20 ° C pendant 30-60 s dans une chambre, puis incuber pendant 30 minutes dans une solution fraîchement préparée de fixation (1 x tamponné phosphate salin (PBS) contenant 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM MgSO4, 0,8 mM ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl éther)-N, N, N', N'-tétraacétique acide (EGTA) et 3,7 % de paraformaldéhyde) à température ambiante.
- Laver les diapositives en plaçant dans une chambre contenant 1 x PBS, pH 7,4 avec 0,1 % Tween-20 à 10 min. répéter cette étape une fois.
- Bloquer le germlines 30 µL de la solution de blocage (30 % de sérum de chèvre préparé en ajoutant 900 µL de sérum de chèvre en 1700 µL d’eau distillée H2O et 300 µL de PBS de x 10) dans une chambre humide préparée en plaçant une serviette en papier humide dans une boîte en plastique à température ambiante pendant 30 min.
- Ajouter 50 µL de solution d’anticorps REC-8 préparée à 30 % de sérum de chèvre dans un rapport 1 : 300 à chaque échantillon. Incuber une nuit à 4° C.
- Laver les diapositives en plaçant dans une chambre contenant 1 x PBS avec 0,1 % Tween-20 à 10 min. Répétez l’étape une fois et retirer l’excès de liquide en plaçant une serviette en papier à l’angle de la lame.
- Préparer la solution d’anticorps secondaire en diluant vert fluorophore (488 nm émission longueur d’onde) conjugués anticorps secondaire (1 : 1000), la phalloïdine (coloration de l’actine, 1:4000) et DAPI (coloration de l’ADN, 1:4000) dans le sérum de chèvre normal de 30 %.
- Ajouter 50 µL de solution d’anticorps secondaire à la diapositive.
- Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver les lames deux fois en la plaçant dans une chambre contenant 1 x PBS avec 0,1 % Tween-20 à 10 min. essuyer l’excès de liquide.
- Ajouter 30 µL de réactif sur le toboggan de fixation et poser un de 12 mm2 x 1,5 µm lamelle dessus et sécher les lames à 4 ° C durant la nuit.
3. confocal Microscopy
- Allumez le microscope confocal, lasers, résonnant scanner et logiciel de microscope confocal. Placez les glissières avec germlines tachée sur le support de diapositive au-dessus de l’objectif X 63.
- Recherchez une lignée germinale, mise au point sur le dessus de la lignée germinale et marquez-le à l’aide de logiciels de microscope confocal. De même, se concentrer sur la partie inférieure de la lignée germinale et marquez-le pour établir l’épaisseur totale de cellules germinales.
- Image le germline tout en définissant l’épaisseur de chaque tranche jusqu'à 0,5 µm. Marquez l’acquisition complète de la lignée germinale et démarrer. Numériser chaque tranche 8 fois et la moyenne des valeurs afin d’améliorer la qualité de l’image. Le scanner à résonant permettra une numérisation rapide pour éviter le blanchiment en imagerie. Si le microscope n’a pas un scanner à résonant, réduire le nombre d’analyses à quatre pour éviter la décoloration.
4. après analyse des noyaux d’imagerie nombre et Distribution
Remarque : Reportez-vous supplémentaire Figure 1 pour les captures d’écran des outils logiciels et boutons utilisés.
- Importez l’image Imaris 8.4.1 ou des versions ultérieures du logiciel.
- Définir la région mitotique, zone de transition, région méiotique, région de l’ovocyte et spermathèque de la lignée germinale en identifiant la morphologie nucléaire dans chaque région.
- La touche de fonction surface (complémentaire de la Figure 1 a) du logiciel permet de sélectionner la région d’intérêt.
- Annulez l’Assistant de création de surface automatique et dessiner manuellement la région d’intérêt à la première et la dernière tranche de l’image de la pile en trois dimensions.
- Cliquez sur Create aire.
Remarque : Le logiciel va développer automatiquement les empilements entre la première et la dernière pile. - Masquer toutes les chaines sauf DAPI en cliquant sur le bouton de canal masque (Figure supplémentaire 1 b-C).
- Définissez les paramètres de la taille du noyau à l’aide de la touche de fonction spot (complémentaire de la Figure 1 a). Pour la région mitotique, définir un diamètre XY de 2 µm en laissant diamètre Z indéfini. Pour la zone de transition, définir un diamètre XY de 2 µm et Z comme 1,5 µm. (complémentaire Figure 1).
NOTE : Dépanner les diamètres selon le grossissement et les spécifications du microscope. Pour le protocole actuel, l’objectif utilisé était de 63 X et fourni un extra de grossissement de 1,70 en imagerie. Si l’objectif change, par exemple 40 X, le diamètre doit être modifié en conséquence. Dépannage doit être réalisée avec germlines de type sauvage d’établir les paramètres corrects. La région mitotique d’un bras de lignée germinale de type sauvage a environ 250 noyaux. Le diamètre doit être modifié pour atteindre cette valeur. Au moins 15 germlines permet de déterminer la valeur optimale pour le diamètre. Une approche similaire devrait être utilisée pour l’étalonnage de la zone de transition (noyaux de 150-170) et la région méiotique (noyaux de 600-700). - Limiter la détection de taches en définissant le seuil minimal (1E Figure supplémentaire). Utilisation DAPI teinté germlines de type sauvage pour établir le seuil minimum en augmentant le seuil minimal de rendu tridimensionnel jusqu'à ce que le premier spot apparaît en dehors de la lignée germinale.
- Enregistrer l’image et obtenir le nombre de noyaux de la table générée automatiquement par le logiciel. Exporter les images sous forme de fichiers TIF.
5. après l’analyse d’imagerie pour la notation des spermatozoïdes et du nombre de chromosomes
- Exécuter le rendu tridimensionnel en sélectionnant la spermathèque comme la région d’intérêt. Pour détecter chaque spermatozoïde, définir le diamètre du spot entre 0,75 - 1,0 µm pour X et Y-axe, tandis que le diamètre de Z reste indéfini. Utilisez la touche de fonction de taches comme indiqué dans supplémentaire Figure 1.
- Soustraire l’arrière-plan en cochant fond soustraire la boîte et en utilisant les valeurs de correction de fond calculés par le logiciel (complémentaire Figure 1).
NOTE : Imaris logiciel pronostics points de forte intensité tout d’abord, l’effet de fond est donc minime tant qu’il y a une différence significative entre la région d’intérêt et de l’arrière-plan. Une deuxième méthode consiste à définir la correction de fond manuellement, le cas échéant des valeurs peut être donnée pour l’arrière-plan. Une correction de fond manuel sera appropriée si l’intensité des échantillons indépendants a besoin de comparaison. - Régler le seuil de rendu tridimensionnel pour détecter tout DAPI souillé de sperme dans la spermathèque (1E Figure supplémentaire).
- Pour compter les chromosomes, définir le diamètre du spot < 0,75 µm pour X et Y-axe avant d’élaborer des modèles en trois dimensions.
- Enregistrer l’image et les exporter en tant que fichier TIF.
6. après l’analyse d’imagerie pour la Reconstruction du cytosquelette de la lignée germinale
- Identifier la zone d’intérêt dans la lignée germinale et masquer toutes les chaines sauf la phalloïdine en cliquant sur le bouton masquer des canaux .
- Décrivez en détail un surface de 0,25 µm en utilisant la touche de fonction surface (supplémentaire Figure 1).
Remarque : Cela signifie que chaque 0,25 µm sera rendu dans des modèles en trois dimensions. Détail de surface peut être constante pour n’importe quelle région de la lignée germinale où un modèle en trois dimensions de la surface sera créé pour chaque 0,25 µm. Toutefois, pour la région de l’ovocyte, détail de surface peut être porté à 0,35 - 0,5 µm due à la présence de fibres d’actine bien définis dans cette région. - Soustraire l’arrière-plan en cochant fond soustraire la boîte et en utilisant les valeurs de correction de fond calculés par le logiciel (complémentaire Figure 1).
- Ajuster le seuil de rendu tridimensionnel selon la structure nécessitant une analyse (1E Figure supplémentaire).
- Enregistrez l’image en trois dimensions développée et exporter dans un fichier TIF.
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Representative Results
La figure 1 indique le temps requis pour l’analyse des cellules germinales en trois dimensions. L4 hermaphrodites incubées à 20 ° C ont été disséqués pour isoler germlines et colorées au DAPI, la phalloïdine et des anticorps contre les protéines de la lignée germinale. Germlines sont imagés à l’aide de la microscopie confocale. Microscopie confocale et de coloration nécessite environ 24 h. analyse de calcul pour la lignée germinale complete, il faut 10-15 min pour compter le nombre et la position des noyaux, identifier la distribution de protéines, analyser la structure du cytosquelette et le score le nombre de spermatozoïdes. Analyse manuelle complète nécessite plus de 2 h par lignée germinale et est soumise à l’influence de l’opérateur, par conséquent, notre méthode automatisée de haut débit réduit le temps de l’analyse et améliore la reproductibilité.
Automatisée des noyaux marquant révèle qu’un bras de la lignée germinale abrite environ 1 000-1 200 noyaux (Figure 2C), correspond bien avec manuel publié antérieurement marquant des données1. Pour confirmer que l’exactitude de la notation, plusieurs mutants et des conditions différentes sont utilisés (Figure 2D-G). Par exemple, nous avons comparé les rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)et glp-1(e2141) les vers mutants aux animaux de type sauvage. Comptage automatique reproduit connue réduction du nombre de noyaux à l’OPC-3 et le glp-1 mutant germlines14,15,16,17. Une sévère réduction nombre de noyaux a également observée chez le mutant sensible à la température de glp-1(e2141) incubés à 25 ° C. La répartition des noyaux est dépend du stade de différenciation. La région mitotique, qui contient environ 250 noyaux de type sauvage, est étroitement emballée avec des noyaux par rapport au reste de la lignée germinale (Figure 3)1. L’espacement entre les noyaux mitotiques est minime et noyaux sont situés dans toute la région mitotique. Toutefois, comme les noyaux s’éloigner l’extrémité distale, ils apparaissent plus vers la circonférence de la lignée germinale (Figure 3). Le changement dans la distribution commence à la zone de transition et se termine comme les noyaux entrer méiose/pachytène.
La lignée germinale a des structures du cytosquelette spécifiques à différents stades de différenciation. Nous avons visualisé actine F par coloration de la lignée germinale avec la phalloïdine. La distribution d’actine-F de distale de l’extrémité proximale de la lignée germinale était distincte à chaque région (Figure 3 et Figure 5). En général, il y a deux structures distinctes qui apparaissent comme un « cylindre cylindre ». À la région mitotique, actine interne apparaît comme une masse solide avec une forme particulière (Figure 3). Comme la lignée germinale arrive dans la zone de transition, l’actine interne suppose une structure plus cylindrique et il devient un cylindre creux qu’il atteint le stade pachytène tardif. La deuxième couche de l’actine couvre la couche intérieure donnant forme à la lignée germinale. Cette structure d’actine « cylindre cylindre » disparaît vers la région de l’ovocyte (Figure 5). Dans la région de l’ovocyte, actine apparaît comme fibres épaisses. Les ovocytes sont séparées par un rachis actine, bien qu’il semble être dynamique pour permettre la circulation des ovocytes de la spermathèque. Enfin, l’actine dans la spermathèque forme aussi épais faisceaux de fibres d’actine. Cependant, les fibres semblent être emballés plus proche que dans la région de l’ovocyte. La structure du cytosquelette semble compléter les modes de répartition des noyaux (Figure 3). À la région mitotique, les noyaux semblent être fixées autour de la structure interne de l’actine. Qu’ils atteignent la méiose/pachytène, les noyaux organisent entre les deux cylindres d’actine laissant au milieu de la lignée germinale pour la plupart dépourvues de noyaux (Figure 3). Cela pourrait aider probablement cyclose ininterrompue de la lignée germinale. Germlines ont été colorées avec un anticorps dirigé contre la protéine REC-8 et analysés par microscopie confocale. REC-8 est distribuée de façon homogène autour des noyaux au début de la lignée germinale et est plus tard s’est fendue et dégradée au cours de la méiose,18. REC-8 répartition en trois dimensions analyse transversale de la lignée germinale montre la répartition des protéines dans la région mitotique (Figure 4).
Un rendu tridimensionnel de l’extrémité proximale de la lignée germinale comprend la spermathèque et trois premiers ovocytes distales de la spermathèque. Notre analyse a reconnu une moyenne de 151 sperme dans chaque spermathèque (n = 18). Cela correspond à la littérature publiée, indiquant la fiabilité de la méthode (Figure 5F)19. Cette analyse peut être effectuée avec cytosquelette ou études de distribution de protéine. Le génome de c. elegans est réparti entre six chromosomes. Dans les ovocytes de décélération type sauvage, ces chromosomes sont visibles et peuvent être comptés. Cette séparation des chromosomes peut être utilisée pour étudier la stabilité chromosomique ou autres défauts associés au développement des ovocytes. Par le rendu en trois dimensions, le nombre de chromosomes peut être visualisé, et si les chromosomes sont séparées correctement, le nombre peut être obtenu avec précision (Figure 5).
Figure 1 . Chronologie d’analyse automatisée. Comparaison de temps entre l’analyse manuelle et algorithmique de la lignée germinale de c. elegans . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Distribution des noyaux dans la lignée germinale. (A) DAPI teinté germline montrant mitotique, transition et régions pachytène/méiotique. (B) calcul tridimensionnel de la lignée germinale. (C) notation pour le nombre de noyaux dans les germlines de type sauvage. (D-F) Notation pour le nombre de noyaux à mitotique, transition et régions méiotiques de type sauvage, rnp-8, 3-cpbet glp-1 germlines mutant. (G) la comparaison du nombre total des noyaux dans le mutant de glp-1 à 20 ° C et 25 ° C. Barre d’erreur représente écart-type. Test de Student. n < 0,0001, ***n < 0,001, **n < 0,01, *n < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . La structure du cytosquelette de la lignée germinale. (A-B) Organisation du cytosquelette d’actine interne (rouge) de la lignée germinale dans la région mitotique. L’actine intérieure a une structure diffuse par rapport à l’actine extérieure à la région mitotique. (C-D) Dans la région de pachytène, le cytosquelette suppose une structure cylindrique en formant deux cylindres entre lesquels les noyaux (bleus) sont organisées. (E-F) Organisation des noyaux de cellules germinales dans les régions mitotiques et pachytène. La répartition des noyaux est plus vers la circonférence de la « germtube » à la région de pachytène par rapport à la région mitotique (verte) et milieu de la lignée germinale devenu sans noyaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Expression de REC-8 dans la région mitotique. (A) micrographie montrant l’extrémité distale de la lignée germinale un REC-8-colorées. (B-C) Rendu tridimensionnel du REC-8 taches (représenté en bleu) et la distribution des protéines entre les noyaux mitotiques (vert). REC-8 coloration est moins abondante proximale à la région mitotique (marquée par des points blancs représentant les noyaux). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Structure de la lignée germinale à l’extrémité proximale. (A) la coloration DAPI de la lignée germinale à l’extrémité proximale. (B) rendu tridimensionnel de DAPI coloration des chromosomes dans les ovocytes (blanc) et affichage de sperme dans la spermathèque (jaune). (C-E) Structure du cytosquelette tridimensionnelle à l’extrémité proximale de la lignée germinale. Rouge marque l’extrémité proximale complète et vert marque la spermathèque. Analyse transversale croisée montre que le cytosquelette constitue non seulement une structure filamenteuse de l’actine autour d’ovocytes, mais qu’il sépare également entre les ovocytes. (F) graphique montrant le nombre de spermatozoïdes dans chaque spermathèque et la moyenne obtenue de la spermathèque multiples (n = 18). Barre d’erreur représente écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 . Description des outils logiciels. (A) les taches et les outils de surface pour la détection des noyaux et des taches de protéines. (B-C) La sélection de la région en trois dimensions d’intérêt à l’aide de l’outil surface. (D) définir le XY-diamètre, à l’aide d’outil de taches, pour la détection de noyaux. Selon la région d’intérêt et de coloration, permet la correction de diamètre et fond d’axe z. (E) au minimum et détection de seuil d’intensité maximale. Une approche similaire peut être utilisée pour la fonction surface où, au lieu de définir le diamètre, et les détails de la surface peuvent être définies. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole vise à améliorer la précision et réduire le temps nécessaire pour l’analyse de la lignée germinale. Après l’emballage standard germlines disséqués, un modèle tridimensionnel de noyaux de cellules germinales est préparé par calcul rendu. Tout en permettant l’observation de la distribution de noyaux de cellules germinales dans l’espace, rendu tridimensionnel calcule le nombre de noyaux à des régions spécifiques de la lignée germinale. L’aspect essentiel de notre méthode est une définition précise des paramètres de taille et la forme des noyaux. Cela dépend de la clarté de la coloration et le grossissement utilisé pour l’image. Nous avons confirmé l’exactitude de la méthode en comparant à publié les données analysées manuellement1. Pour confirmer l’exactitude de notre méthode, nous avons utilisé plusieurs mutants dans des conditions différentes et a confirmé les résultats avec la documentation publiée. Il a également confirmé la capacité de la méthode pour détecter les phénotypes subtiles et fortes - mutants cpb-3 et le glp-1 , respectivement. En outre, cette méthode indique adaptabilité aux changements dans la taille des noyaux et la forme au sein de la lignée germinale ou même entre les souches. Cette propriété permet aussi l’identification et la cotation de plus petites structures dans la lignée germinale tels que des chromosomes et le sperme. La méthode permet également plus de dépannage pour les paramètres de taille et la forme, si nécessaire. Notre analyse a pu élucider la distribution des noyaux dans la lignée germinale et a montré que les noyaux en mitose et régions pachytène sont organisées dans différents modèles. En appliquant rendu tridimensionnel à REC-8 et la coloration DAPI, nous avons également montré que la distribution de REC-8 dans les noyaux de la région mitotique.
Rendu tridimensionnel d’actine coloration a permis un examen détaillé des structures du cytosquelette de la lignée germinale. La lignée germinale semble avoir deux structures distinctes de l’actine, bien qu’ils maintiennent un contact physique. Alors que la reconstruction du cytosquelette de la lignée germinale tout est possible comme une seule entité, les meilleurs résultats peuvent être obtenus si les régions d’intérêt sont présélectionnées en mitose, de transition et les régions méiotiques. Le cytosquelette des cellules germinales distale a une forme indéfinie et se transforme en une structure filamenteuse à l’extrémité proximale. Notre protocole permet donc une reconstruction tridimensionnelle du cytosquelette d’actine de la lignée germinale en définissant des paramètres spécifiques pour tenir compte des différences dans la distribution de l’actine. L’aspect le plus important de l’analyse est la définition des paramètres tels que la taille des noyaux et condition de détail de surface. Réduire la taille des noyaux au-dessous de la taille réelle risque le logiciel pour prendre des points lumineux dans les noyaux en tant qu’objets distincts. De même, des valeurs de détails élevé de la surface entraînera la perte des structures tridimensionnelles précises. La méthode proposée s’appuie sur la précision de la dissection et la qualité de la coloration de la lignée germinale. Une lignée germinale endommagé peut conduire à la libération des noyaux de la lignée germinale, causant la numérotation inexactes. Ambiants de la coloration provoquera également le nombre de noyaux inexacte et la mauvaise rendu tridimensionnel.
Notre méthode s’étend déjà connues les méthodes automatisées d’analyse de la lignée germinale où nous sommes en mesure d’analyser le nombre de noyaux et de la distribution/expression des protéines de la lignée germinale dans l’espace avec un protocole simple20. Deuxièmement, notre méthode permet de marquer de plus petites structures comme les chromosomes dans les cellules germinales. Ségrégation des chromosomes est un aspect important de l’ovocyte développement21. En utilisant notre méthode, il est possible de détecter le nombre et la position des chromosomes où la distance peut être définie en étalonnant contre des ovocytes de type sauvage. Toute mutation affectant la séparation des chromosomes peut être étudiée à l’aide de cet outil. En outre, la méthode peut être étendue à l’étude des chromosomes chez les embryons au stade 2 cellules. L’analyse de calcul fournit également le nombre de spermatozoïdes dans la spermathèque, nombre de chromosomes dans un ovocyte et des cellules germinales des structures du cytosquelette. Pris ensemble, la méthode fournit une analyse complète de la lignée germinale de c. elegans en utilisant un protocole unique tout en réduisant considérablement les temps d’analyse. La méthode élimine le besoin d’outils multiples pour chaque analyse (nombre de noyaux, la distribution des protéines et la structure du cytosquelette) et supprime le temps de codage requis dans un logiciel spécifique. Enfin, cette méthode peut être efficacement appliquée à d’autres études de ver, y compris l’analyse tridimensionnelle vers vivants sous sédation.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Monash Microimaging pour leur support technique. Certaines souches ont été fournis par le centre de génétique de Caenorhabditis , qui est financé par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Ce travail a été soutenu par une Université Monash biomédecine bourse de découverte, subvention de projet NHMRC (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) et de bourse innovation veski : 23 VIF à Roger Pocock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
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