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Developmental Biology

नाभिक, प्रोटीन, और Cytoskeleton के वितरण का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस Germline का अभिकलनी विश्लेषण

doi: 10.3791/57702 Published: April 19, 2018

Summary

हम Caenorhabditis एलिगेंस germline के तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए एक स्वचालित विधि प्रस्तुत करतेहैं । हमारे विधि germline और विश्लेषण germline प्रोटीन वितरण और cytoskeletal संरचना के भीतर प्रत्येक नाभिक की संख्या और स्थिति निर्धारित करता है ।

Abstract

Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) germline स्टेम सेल विकास, apoptosis, और गुणसूत्र गतिशीलता सहित कई जैविक रूप से महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । जबकि germline एक उत्कृष्ट मॉडल है, विश्लेषण अक्सर दो समय और तीन आयामी विश्लेषण के लिए आवश्यक परिश्रम के कारण आयामी है । ऐसे अध्ययनों में प्रमुख readouts germline के भीतर नाभिक और प्रोटीन वितरण की संख्या/ यहां, हम germline के प्रत्येक क्षेत्र में संख्या और नाभिक की स्थिति निर्धारित करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी और गणनात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर germline के स्वचालित विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । हमारे विधि भी germline प्रोटीन वितरण कि विभिंन आनुवंशिक पृष्ठभूमि में प्रोटीन अभिव्यक्ति के तीन आयामी परीक्षा में सक्षम बनाता है विश्लेषण करती है । इसके अलावा, हमारे अध्ययन germline है कि विशिष्ट स्थानिक विकास आवश्यकताओं को समायोजित कर सकते है के विभिंन क्षेत्रों में cytoskeletal वास्तुकला में बदलाव से पता चलता है । अंत में, हमारे विधि प्रत्येक germline के spermatheca में शुक्राणु की स्वचालित गिनती सक्षम बनाता है । एक साथ लिया, हमारी विधि में सक्षम बनाता है तेजी से और reproducible के phenotypic विश्लेषण C. एलिगेंस germline ।

Introduction

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स्तनधारियों के साथ संकेत रास्ते के संरक्षण सी. एलिगेंस एक उत्कृष्ट करने के लिए एकाधिक जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन1,2मॉडल बनाता है । हमारी प्रयोगशाला में, हम स्टेम सेल विकास, apoptosis, और जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए C. एलिगेंस germline का उपयोग करते हैं । जबकि germline एक तीन आयामी संरचना है, कई अध्ययनों से दो समय लेने वाली और श्रम तीन आयामी विश्लेषण के गहन प्रकृति के कारण आयामी हैं । यह बहुत संभावना है कि दो आयामी विश्लेषण germline में vivo घटनाओं में misrepresent हो सकता है । C. एलिगेंस वयस्क द्विलिंग दो germline हथियार है, जिनमें से प्रत्येक एक दैहिक बाहर टिप सेल (डीटीसी) है कि एक विभेदित राज्य3,4में बाहर रोगाणु कोशिकाओं का कहना है कि घरों । इन रोगाणु कोशिकाओं के रूप में वे डीटीसी से दूर ले जाने के अंतर शुरू, इसके प्रभाव से बचने, और अंडाणुओं और शुक्राणु बन के रूप में वे germline के समीपस्थ अंत तक पहुँचने । इस प्रक्रिया के दौरान, रोगाणु कोशिका नाभिक, अर्धसूत्रीविभाजन5,6के लिए संक्रमण से पहले बँटवारा से गुजरना । शुक्राणु उत्पादन लार्वा चरण 4 (L4) के विकास के द्वारा पूरा हो गया है, जिसके बाद अंडाणुओं वयस्कता के दौरान उत्पादित कर रहे हैं । शुक्राणु spermatheca में संग्रहित होते हैं जहां वे भ्रूण उत्पन्न करने के लिए अंडाणुओं की खाद बनाते हैं ।

वहां कई आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि नाभिक की संख्या में परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप सी एलिगेंस में germline विकास को प्रभावित कर सकते हैं, अपोप्तोटिक घटनाओं की संख्या, गुणसूत्र गतिशीलता, और प्रोटीन अभिव्यक्ति और/ ,8,9,10,11. इन घटनाओं के विश्लेषण परमाणु आकृति विज्ञान और वितरण के आधार पर भेदभाव के प्रत्येक चरण की पहचान की आवश्यकता है । सही ढंग से इन मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए एक बड़े नमूना आकार के साथ श्रम-प्रधान और समय लेने वाली है । इन कमियों को दरकिनार करने और विश्लेषण की निरंतरता को सक्षम करने के लिए, हमने नाभिक काउंटिंग, नाभिक वितरण, प्रोटीन एक्सप्रेशन, और cytoskeletal के लिए C. एलिगेंस germline की तीन आयामी परीक्षा के लिए एक स्वचालित विधि विकसित की संरचना. तीन आयामी प्रतिपादन के साथ फोकल माइक्रोस्कोपी के संयोजन से, हम रोगाणु कोशिका विभेद के प्रत्येक चरण की पहचान के लिए आकार और आकार मापदंडों उत्पन्न । इसके अलावा, इस विधि रोगाणु कोशिका नाभिक और शुक्राणु प्लस प्रत्येक oocyte में गुणसूत्र संख्या के स्कोरिंग की गिनती में सक्षम बनाता है ।

germline में एक महत्वपूर्ण संरचना cytoskeleton है, जो germline डिब्बे को स्थिरता प्रदान करता है, एड्स cytoplasmic स्ट्रीमिंग और germline नाभिक12को संरक्षण । गणना प्रतिपादन का उपयोग करना, हम germline cytoskeleton के तीन आयामी पुनर्निर्माण प्रदर्शन किया और germline के भीतर विशिष्ट cytoskeletal सुविधाओं की पहचान की. यहां, हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल वर्णन करने के लिए कैसे गणना फोकल इमेजिंग के साथ संयुक्त विश्लेषण की व्याख्या सी. एलिगेंस germline के व्यापक विश्लेषण में सक्षम बनाता है ।

हम C. एलिगेंस germline (चित्रा 1) के तीन आयामी विश्लेषण के लिए एक तीव्र विधि का प्रस्ताव है । तीन आयामी विश्लेषण का उपयोग करना, यह germline नाभिक के तीन आयामी वितरण का अध्ययन करने के लिए संभव है (चित्रा 2 और चित्रा 3), कोशिकाओं की स्वचालित गिनती (चित्रा 2), germline cytoskeleton के पुनर्निर्माण ( चित्रा 3), प्रोटीन का वितरण (चित्रा 4), और अंडाणुओं में spermatheca और गुणसूत्रों में शुक्राणु की संख्या स्कोरिंग (चित्रा 5). विधि न केवल germline के आसान और सटीक ठहराव सक्षम बनाता है, लेकिन शारीरिक रूप से प्रासंगिक phenotypes की पहचान करता है ।

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Protocol

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1. तैयारी और कृमि पशुपालन

नोट: सभी उत्पाद जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

  1. OP50 ई कोलाई संस्कृति: संस्कृति OP50 बैक्टीरिया Lysogeny शोरबा (पौंड) (1% tryptone, ०.५% खमीर, ०.५% NaCl, पीएच ७.०) में रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस पर एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ।
  2. OP50 जीवाणुओं के बीज ४०० µ l को निमेटोड ग्रोथ मीडिया (NGM) प्लेट्स (१.५ g of NaCl, आगर के ८.५ जी, peptone के १.२५ ग्राम, 1 एम CaCl2के 1 मिलीलीटर, 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल के 1 एमएल, 1 एम MgSO4 के 1 मिलीलीटर , और 1 मीटर केपीओ4 बफर के 25 मिलीलीटर) और हवा ४८ एच के लिए बैक्टीरिया सूखी ।
  3. बीज NGM प्लेटों पर कीड़े उठाओ और 15 डिग्री सेल्सियस या 20 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    1. वयस्क द्विलिंग germline के विश्लेषण के लिए, अच्छी तरह से खिलाया L4 कीड़े जीवाणु लॉन के लिए और 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी उठाओ ।
    2. hermaphrodites में स्कोरिंग शुक्राणु संख्या के लिए, 12 के लिए 20 ° c पर L4 कीड़े गर्मी जब तक कीड़े L4/वयस्क गलते तक पहुंचने । L4 अवस्था में कीड़े को सिंक्रनाइज़ करने के लिए ब्लीच सॉल्यूशन (१ एम NaOH और ब्लीच में 1:1 अनुपात) में बहुत सारे अंडों के साथ वयस्क कीड़े उठा कर अंडे तैयार करते हैं. अंडे हैच और प्रयोग के लिए L4 जानवरों लेने के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. स्लाइड पर पाली-एल-lysine समाधान के 25 µ एल रखकर Teflon माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करने और समाधान अच्छी तरह से फैल, एक पिपेट टिप का उपयोग कर. अतिरिक्त पाली-एल कागज तौलिया के साथ lysine को हटाने के बाद, स्लाइड शुष्क हवा और 15-20 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड गर्मी की अनुमति दें ।

2. Germline विच्छेदन और दाग6,13

  1. स्पॉट 10 ०.०१% tetramisole (संवेदनाहारी) के एक 22 मिमी × 22 मिमी coverslip पर µ एल और एक दिन में पुराने वयस्क कीड़े उठाओ ।
  2. काटना पूंछ पर कीड़ा के रूप में यह एक सिरिंज (5 मिलीलीटर) और एक सुई (24 "x 1") का उपयोग कर बेहोश हो जाता है, और यह सुनिश्चित करें कि germline क्षतिग्रस्त नहीं है ।
    नोट: विच्छेदन किया जाना चाहिए इससे पहले कि कीड़ा पूरी तरह से पंगु हो जाता है ताकि कीड़ा और कीड़ा आंदोलन में नकारात्मक दबाव germline के बेदखली सहायता । स्कोरिंग शुक्राणु के लिए, सावधानियों को विच्छेदन के दौरान सुई द्वारा spermatheca नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए । spermatheca के बाद विच्छेदन बिंदु को छोड़कर सुई के साथ germline को छूने से बचें । यदि germline डिब्बे या germline से किसी भी छुट्टी में टूट रहा है मनाया जाता है, germline विश्लेषण के लिए नहीं किया जाना चाहिए ।
  3. उल्टे coverslip को एक पाली-एल-lysine लेपित स्लाइड पर रखें, जिससे वह विच्छेदित germline को स्लाइड पर रखे ।
  4. coverslip के एक कोने पर एक कागज टॉवर रखकर coverslip के तहत अतिरिक्त तरल निकालें, फिर 1 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में स्लाइड जगह । स्लाइड पर germlines के साथ एक सुई का उपयोग कर coverslip को जल्दी से निकालें ।
  5. एक चैंबर में 30-60 एस के लिए-20 ° c मेथनॉल में स्लाइड स्थानांतरण, तो 30 मिनट के लिए हौसले से तैयार फिक्सिंग समाधान में मशीन (1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) युक्त ०.०८ एम HEPES पीएच ६.९, १.६ mMMgSO4, ०.८ mM ईथीलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (बीटा-aminoethyl ईथर)-n, n, n ', N'-tetraacetic एसिड (EGTA), और ३.७% paraformaldehyde) कमरे के तापमान पर ।
  6. 1x पंजाब युक्त एक चैंबर में रखकर स्लाइड धो लो, ०.१% के बीच के साथ पीएच ७.४-20 के लिए 10 मिनट के लिए इस कदम को एक बार दोहराएं ।
  7. अवरुद्ध समाधान के 30 µ एल के साथ germlines ब्लॉक (बकरी सीरम के 30% आसुत एच के १७०० µ l में बकरी सीरम के ९०० µ एल जोड़कर तैयार 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक प्लास्टिक बॉक्स में गीले कागज तौलिया रखकर तैयार एक आर्द्र कक्ष में, 10x पंजाबियों के2हे और ३०० µ एल ।
  8. प्रत्येक नमूने के लिए 1:300 एक अनुपात में 30% बकरी सीरम में तैयार आरईसी-8 एंटीबॉडी समाधान के ५० µ एल जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  9. 10 मिनट के लिए ०.१% के बीच-20 के साथ 1x पंजाब युक्त एक चैंबर में रखकर स्लाइड धो लें एक बार कदम दोहराएं और स्लाइड के कोने पर एक कागज तौलिया रखकर अतिरिक्त तरल निकालें ।
  10. कमजोर ग्रीन fluorophore (४८८ एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य) संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:1000), phalloidin (actin दाग, 1:4000), और DAPI (डीएनए दाग, 1:4000) 30% सामांय बकरी सीरम में द्वारा द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें ।
  11. स्लाइड के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के ५० µ l को जोड़ें ।
  12. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  13. 10 मिनट के लिए ०.१% के बीच के साथ 1x पंजाब युक्त एक चैंबर में रखकर दो बार स्लाइड धो लो । बंद अतिरिक्त तरल पोंछें ।
  14. स्लाइड पर रिएजेंट फिक्सिंग के 30 µ l को जोड़ें और एक 12 mm2 x १.५ µm coverslip को शीर्ष पर रखें और स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सुखा लें ।

3. फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. फोकल माइक्रोस्कोप, पराबैंगनीकिरण, गुंजयमान स्कैनर, और फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर को चालू करें । स्लाइड होल्डर पर सना germlines के साथ स्लाइड 63X उद्देश्य के ऊपर रखें ।
  2. एक germline का पता लगाएँ, germline के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित करने और यह फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निशान. इसी तरह germline के तल पर ध्यान केंद्रित करने और यह कुल germline मोटाई स्थापित करने के लिए चिह्नित ।
  3. प्रत्येक स्लाइस की मोटाई को परिभाषित करके पूरे germline छवि ०.५ µm. Mark पूरा germline और शुरू अधिग्रहण । प्रत्येक स्लाइस को 8 बार स्कैन करें और छवि गुणवत्ता में सुधार के लिए मानों को औसत करें । गुंजयमान स्कैनर इमेजिंग के दौरान ब्लीचिंग से बचने के लिए तेजी से स्कैनिंग की अनुमति देगा । यदि माइक्रोस्कोप में गुंजयमान स्कैनर न हो तो ब्लीचिंग से बचने के लिए चार स्कैन की संख्या को कम करें ।

4. नाभिक संख्या और वितरण के पोस्ट इमेजिंग विश्लेषण

नोट: इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर उपकरण और बटन के स्क्रीनशॉट के लिए अनुपूरक चित्रा 1 देखें.

  1. छवि को Imaris 8.4.1 या सॉफ़्टवेयर के बाद के संस्करणों में आयात करें ।
  2. प्रत्येक क्षेत्र में नाभिकीय आकृति की पहचान करके mitotic क्षेत्र, संक्रमण क्षेत्र, meiotic क्षेत्र, oocyte क्षेत्र, और germline की spermatheca को परिभाषित करें ।
  3. रुचि के क्षेत्र का चयन करने के लिए सॉफ़्टवेयर का सरफ़ेस फ़ंक्शन बटन (अनुपूरक आंकड़ा 1a) का उपयोग करें ।
  4. स्वत: सतह निर्माण विज़ार्ड रद्द करें और मैंयुअल रूप से तीन-आयामी स्टैक से छवि के प्रथम और अंतिम स्लाइस पर रुचि के क्षेत्र को ड्रा ।
  5. सरफ़ेस बनाएंक्लिक करें ।
    नोट: सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से पहले और अंतिम स्टैक के बीच स्टैक विकसित करेगा ।
  6. मास्क चैनल बटन (अनुपूरक आंकड़ा 1b-C) पर क्लिक करके DAPI को छोड़कर सभी चैनल मास्क करें ।
  7. स्पॉट फंक्शन बटन (अनुपूरक आंकड़ा 1a) का उपयोग कर परमाणु आकार के मापदंडों को परिभाषित करें । mitotic क्षेत्र के लिए, 2 µm के एक XY व्यास परिभाषित करते हुए जेड व्यास अपरिभाषित छोड़ । संक्रमण क्षेत्र के लिए, 2 µm और Z व्यास के रूप में १.५ µm. (अनुपूरक आंकड़ा 1 d) के एक XY व्यास को परिभाषित करें ।
    नोट: व्यास इज़ाफ़ा और माइक्रोस्कोप की विशेषताओं के अनुसार समस्या निवारण । वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, उद्देश्य का इस्तेमाल किया 63X और इमेजिंग के दौरान एक अतिरिक्त १.७० बार आवर्धन प्रदान की गई थी । यदि उद्देश्य परिवर्तन, उदाहरण के लिए 40X, व्यास तदनुसार बदल दिया जाना चाहिए । समस्या निवारण सही पैरामीटर स्थापित करने के लिए wildtype germlines के साथ किया जाना चाहिए । एक जंगली प्रकार germline बांह के mitotic क्षेत्र लगभग २५० नाभिक है । इस मान को प्राप्त करने के लिए व्यास को संशोधित किया जाना चाहिए । व्यास के लिए इष्टतम मान निर्धारित करने के लिए कम से 15 germlines का उपयोग करें । एक समान दृष्टिकोण संक्रमण क्षेत्र (१५०-१७० नाभिक) और meiotic क्षेत्र (६००-७०० नाभिक) जांच के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  8. न्यूनतम सीमा (अनुपूरक आंकड़ा 1E) को परिभाषित करके स्पॉट का पता लगाने की सीमा तय करे. पहले स्थान germline के बाहर प्रकट होता है जब तक न्यूनतम तीन आयामी प्रतिपादन दहलीज को बढ़ाने के द्वारा न्यूनतम सीमा स्थापित करने के लिए DAPI सना हुआ जंगली प्रकार germlines का उपयोग करें.
  9. छवि सहेजें और सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से उत्पंन तालिका से नाभिक की संख्या प्राप्त करें । छवियों को TIF फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें ।

5. पोस्ट इमेजिंग शुक्राणु और गुणसूत्र संख्या स्कोरिंग के लिए विश्लेषण

  1. ब्याज के क्षेत्र के रूप में spermatheca का चयन करके तीन आयामी प्रतिपादन करते हैं । प्रत्येक शुक्राणु का पता लगाने के लिए, X और Y-अक्ष के लिए ०.७५-१.० µm के बीच स्पॉट व्यास को परिभाषित, जबकि जेड व्यास अपरिभाषित रहता है । अनुपूरक चित्र 1में दिखाए गए के रूप में स्पॉट फंक्शन बटन का उपयोग करें ।
  2. पृष्ठभूमि घटाना बॉक्स टिक और सॉफ्टवेयर (अनुपूरक आंकड़ा 1 डी) द्वारा गणना की पृष्ठभूमि सुधार मूल्यों का उपयोग करके पृष्ठभूमि घटाना.
    नोट: Imaris सॉफ्टवेयर उच्च तीव्रता अंक पहले चुनता है, इसलिए पृष्ठभूमि के प्रभाव के रूप में लंबे समय के रूप में वहां ब्याज के क्षेत्र और पृष्ठभूमि के बीच महत्वपूर्ण अंतर है कम है । पृष्ठभूमि सुधार मैन्युअल रूप से परिभाषित करने के लिए एक दूसरी विधि है, जहाँ उपयुक्त मान पृष्ठभूमि के लिए दिया जा सकता है । मैनुअल पृष्ठभूमि सुधार उचित होगा अगर स्वतंत्र नमूनों की तीव्रता तुलना की जरूरत है ।
  3. spermatheca (अनुपूरक आंकड़ा 1E) में सभी DAPI सना हुआ शुक्राणु का पता लगाने के लिए त्रि-आयामी प्रतिपादन थ्रेशोल्ड समायोजित करें.
  4. गुणसूत्र गिनती के लिए, तीन आयामी मॉडल विकसित करने से पहले हाजिर व्यास < 0.75 µm X और Y-अक्ष के लिए परिभाषित करें ।
  5. छवि सहेजें और TIF फ़ाइल के रूप में निर्यात करें ।

6. Germline के Cytoskeletal पुनर्निर्माण के लिए पोस्ट इमेजिंग विश्लेषण

  1. मास्क चैनल बटन क्लिक करके phalloidin को छोड़कर सभी चैनलों को germline और मास्क में रुचि के क्षेत्र की पहचान करें ।
  2. surface फ़ंक्शन बटन (supplement figure 1) का उपयोग करके ०.२५ µm की सतह विवरण निर्धारित करें.
    नोट: यह हर ०.२५ µm का अर्थ है तीन आयामी मॉडल में गाया जाएगा । सतह विस्तार germline जहां एक तीन आयामी सतह मॉडल हर ०.२५ µm के लिए बनाया जाएगा के किसी भी क्षेत्र के लिए स्थिर हो सकता है । हालांकि, oocyte क्षेत्र के लिए, सतह विस्तार ०.३५-०.५ इस क्षेत्र में अच्छी तरह से परिभाषित actin फाइबर की उपस्थिति के कारण µm के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
  3. पृष्ठभूमि घटाना बॉक्स टिक और सॉफ्टवेयर (अनुपूरक आंकड़ा 1 डी) द्वारा गणना की पृष्ठभूमि सुधार मूल्यों का उपयोग करके पृष्ठभूमि घटाना.
  4. विश्लेषण (अनुपूरक आंकड़ा 1E) की आवश्यकता संरचना के आधार पर त्रि-आयामी रेंडरिंग थ्रेशोल्ड समायोजित करें.
  5. विकसित तीन आयामी छवि और एक TIF फ़ाइल के रूप में निर्यात सहेजें ।

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Representative Results

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आरेख 1 तीन-आयामी germline विश्लेषण के लिए आवश्यक समय को इंगित करता है । L4 hermaphrodites 20 डिग्री सेल्सियस पर germlines को अलग करने के लिए और DAPI, phalloidin, और germline प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग विच्छेदित किया गया । Germlines फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर imaged कर रहे हैं । धुंधला और फोकल माइक्रोस्कोपी लगभग 24 घंटे की आवश्यकता है पूर्ण germline के लिए अभिकलनी विश्लेषण संख्या और नाभिक की स्थिति की गणना करने के लिए 10-15 मिनट की आवश्यकता है, प्रोटीन वितरण की पहचान, cytoskeletal संरचना का विश्लेषण और स्कोर शुक्राणुओं की संख्या । पूर्ण मैनुअल विश्लेषण germline प्रति 2 घंटे से अधिक की आवश्यकता है और ऑपरेटर प्रभाव के अधीन है, इसलिए, हमारे स्वचालित उच्च प्रवाह विधि विश्लेषण समय कम कर देता है और reproducibility को बढ़ाता है ।

स्वचालित नाभिक स्कोरिंग से पता चलता है कि एक germline बांह घरों लगभग १,०००-१,२०० नाभिक (चित्रा 2सी), पहले से प्रकाशित मैनुअल स्कोरिंग डेटा1के साथ अच्छी तरह से इसी । स्कोरिंग की सटीकता की पुष्टि करने के लिए, एकाधिक म्यूटेंट और विभिन्न स्थितियों का उपयोग किया जाता है (चित्रा 2डी-जी). उदाहरण के लिए, हम की तुलना में rnp-8 (tm435), cpb-3 (bt17), और जीएलपी-1 (e2141) उत्परिवर्ती कीड़े जंगली प्रकार के जानवरों के लिए । स्वचालित गिनती cpb-3 और जीएलपी-1 उत्परिवर्ती germlines14,15,16,17में नाभिक की संख्या के ज्ञात कमी reproduced । नाभिक संख्या में एक गंभीर कमी भी जीएलपी-1 (e2141) तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्ती जब 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन में मनाया गया था । नाभिक का वितरण विभेद की अवस्था पर निर्भर है. mitotic क्षेत्र है, जो जंगली प्रकार में लगभग २५० नाभिक शामिल है कसकर germline के बाकी की तुलना में नाभिक के साथ पैक (चित्रा 3)1। mitotic नाभिक के बीच की रिक्ति ंयूनतम है और नाभिक mitotic क्षेत्र में स्थित हैं । हालांकि, नाभिक बाहर के छोर से दूर ले जाने के रूप में, वे germline की परिधि की ओर अधिक दिखाई देते हैं (चित्रा 3) । वितरण में परिवर्तन संक्रमण ज़ोन पर प्रारंभ होता है और नाभिक अर्धसूत्रीविभाजन/pachytene दर्ज करें के रूप में पूरा करता है ।

germline विभेद के विभिंन चरणों में विशिष्ट cytoskeletal संरचनाओं है । हम phalloidin के साथ germline दाग द्वारा एफ actin visualized । germline के बाहर से समीपस्थ छोर से एफ-actin का वितरण प्रत्येक क्षेत्र (चित्रा 3 और चित्रा 5) में अलग था । सामांय में, दो अलग संरचनाओं कि सिलेंडर के भीतर एक ' सिलेंडर के रूप में दिखाई देते हैं । mitotic क्षेत्र में, भीतरी actin एक विशिष्ट आकार के साथ एक ठोस द्रव्यमान के रूप में प्रकट होता है (चित्रा 3) । के रूप में germline संक्रमण क्षेत्र तक पहुंचता है, भीतरी actin एक और बेलनाकार संरचना मान लिया है और यह एक खोखले सिलेंडर के रूप में यह देर pachytene तक पहुंच जाता है । actin की दूसरी परत germline को आकार दे रही भीतरी परत को शामिल करती है । इस ' सिलेंडर के भीतर सिलेंडर ' actin संरचना oocyte क्षेत्र (चित्रा 5) की ओर गायब हो जाता है । oocyte क्षेत्र में, actin मोटी फाइबर के रूप में प्रकट होता है । अंडाणुओं एक actin राच्यों द्वारा अलग कर रहे हैं, हालांकि यह spermatheca को अंडाणुओं के आंदोलन की अनुमति के लिए गतिशील प्रतीत होता है । अंत में, spermatheca में actin भी actin फाइबर के मोटी बंडल रूपों । हालांकि, फाइबर oocyte क्षेत्र की तुलना में करीब पैक करने के लिए दिखाई देते हैं । cytoskeletal संरचना नाभिक (चित्र 3) के वितरण प्रतिमानों को पूरित करने के लिए प्रकट होती है. mitotic क्षेत्र में, नाभिक भीतरी actin संरचना के आसपास रखा दिखाई देते हैं । के रूप में वे अर्धसूत्रीविभाजन/pachytene तक पहुंचने के लिए, नाभिक के बीच दो actin सिलिंडरों के बीच का आयोजन germline ज्यादातर नाभिक से रहित (चित्रा 3) । यह शायद निर्बाध cytoplasmic germline में स्ट्रीमिंग सहायता सकता है । Germlines आरईसी के खिलाफ एक एंटीबॉडी-8 प्रोटीन के साथ दाग रहे थे और फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया । आरईसी-8 germline के प्रारंभिक नाभिक के आसपास homogeneously वितरित किया जाता है और बाद में अर्धसूत्रीविभाजन18के दौरान सट और नीचा है । आरईसी-8 germline के तीन आयामी पार-अनुभागीय विश्लेषण में वितरण mitotic क्षेत्र में प्रोटीन का वितरण दिखाता है (चित्रा 4) ।

germline के समीपस्थ अंत के तीन आयामी प्रतिपादन spermatheca के लिए बाहर spermatheca और पहले तीन अंडाणुओं शामिल हैं. हमारे विश्लेषण प्रत्येक spermatheca (n = 18) में १५१ शुक्राणु के एक औसत को मांयता दी । यह प्रकाशित साहित्य के अनुरूप है, जो विधि की विश्वसनीयता का संकेत करता है (चित्रा ५एफ)१९. इस विश्लेषण cytoskeletal या प्रोटीन वितरण अध्ययन के साथ एक साथ प्रदर्शन किया जा सकता है । C. एलिगेंस जीनोम छह गुणसूत्रों के बीच वितरित किया जाता है । पूरी तरह से विकसित जंगली प्रकार अंडाणुओं में, इन गुणसूत्रों दिखाई और गिना जा सकता है । इस गुणसूत्र जुदाई गुणसूत्र स्थिरता या oocyte विकास के साथ जुड़े अन्य दोषों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तीन आयामी प्रतिपादन करके, गुणसूत्रों की संख्या visualized किया जा सकता है, और अगर गुणसूत्रों ठीक से अलग कर रहे हैं, संख्या सही ढंग से प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 5) ।

Figure 1
चित्र 1 . स्वचालित विश्लेषण के लिए समयरेखा । C. एलिगेंस germline की मैंयुअल और परिकलनात्मक विश्लेषण के बीच समय तुलना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . germline में नाभिक वितरण । (क) DAPI सना germline दिखा mitotic, संक्रमण, और pachytene/meiotic क्षेत्रों । (ख) germline का अभिकलनीय तीन आयामी मॉडल. (ग) वाइल्ड टाइप germlines में नाभिक की कुल संख्या के लिए प्राप्तांक । (डी एफ) mitotic, संक्रमण, और जंगली प्रकार के meiotic क्षेत्रों में नाभिक की संख्या के लिए स्कोरिंग, rnp-8, cpb-3, और जीएलपी-1 उत्परिवर्ती germlines । (छ) 20 ° c और 25 ° c में जीएलपी-1 उत्परिवर्ती में नाभिक की कुल संख्या में तुलना । त्रुटि पट्टी मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है । छात्र का परीक्षण । n < 0.0001, * * *n < 0.001, * *n < 0.01, *n < 0.05 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . germline की Cytoskeletal संरचना। (A-B) mitotic क्षेत्र में germline के भीतरी actin (लाल) cytoskeleton के संगठन । भीतरी actin mitotic क्षेत्र में बाहरी actin की तुलना में एक फैलाना संरचना है । (सी-डी) pachytene क्षेत्र में, cytoskeleton दो सिलेंडरों के बीच जो नाभिक (नीला) का आयोजन कर रहे है बनाने के द्वारा एक बेलनाकार संरचना मानता है । (E-F) mitotic और pachytene क्षेत्रों में germline नाभिक का संगठन । नाभिक का वितरण mitotic क्षेत्र की तुलना में pachytene क्षेत्र में ' germtube ' की परिधि की ओर अधिक है (हरा) और germline के मध्य नाभिक से रहित हो जाते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . आरईसी-8 mitotic क्षेत्र में अभिव्यक्ति। (a) आरईसी-8-सना germline के बाहर का छोर दिखा Micrograph । (बी-सी) आरईसी के तीन आयामी प्रतिपादन-8 धुंधला (नीले रंग में दिखाया गया है) और mitotic नाभिक (हरा) के बीच प्रोटीन का वितरण । आरईसी-8 धुंधला mitotic क्षेत्र के लिए कम प्रचुर मात्रा में समीपस्थ है (नाभिक का प्रतिनिधित्व सफेद डॉट्स द्वारा चिह्नित) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . समीपस्थ छोर पर Germline संरचना। (क) समीपस्थ छोर पर germline का DAPI दाग. (ख) spermatheca (पीला) और गुणसूत्रों में अंडाणुओं (सफेद) में शुक्राणु दिखा DAPI धुंधला के तीन आयामी प्रतिपादन । (सी-ई) germline के समीपस्थ छोर पर तीन आयामी cytoskeletal संरचना । लाल निशान पूरा समीपस्थ अंत और हरे रंग के निशान spermatheca । क्रॉस अनुभागीय विश्लेषण से पता चलता है कि cytoskeleton न केवल अंडाणुओं के आसपास actin की एक रेशा संरचना रूपों, लेकिन यह भी अंडाणुओं के बीच अलग करती है । (च) प्रत्येक spermatheca में शुक्राणुओं की संख्या और एकाधिक spermatheca (n = 18) से प्राप्त औसत ग्राफ दिखा रहा है. त्रुटि पट्टी मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक आंकड़ा 1 . सॉफ्टवेयर उपकरण विवरण। (क) धब्बे और नाभिक और प्रोटीन धुंधला का पता लगाने के लिए सतह उपकरण । (बी-सी) ब्याज की सतह उपकरण का उपयोग कर के तीन आयामी क्षेत्र का चयन । (घ) नाभिक का पता लगाने के लिए, धब्बे उपकरण का उपयोग कर XY-व्यास को परिभाषित करना । ब्याज और धुंधला के क्षेत्र पर निर्भर करता है, Z-अक्ष व्यास और पृष्ठभूमि सुधार किया जा सकता है । (ङ) न्यूनतम और अधिकतम तीव्रता सीमा का पता लगाना. एक समान दृष्टिकोण जहां के बजाय व्यास को परिभाषित करने की सतह समारोह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और सतह विवरण परिभाषित किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सटीकता में सुधार और germline विश्लेषण के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए है । विच्छेदित germlines की मानक तैयारी के बाद, germline नाभिक का एक तीन आयामी मॉडल गणनात्मक प्रतिपादन द्वारा तैयार किया जाता है. जबकि अंतरिक्ष में germline नाभिक वितरण के प्रेक्षण की अनुमति, तीन आयामी प्रतिपादन germline के विशिष्ट क्षेत्रों में नाभिक की संख्या की गणना करता है । हमारे विधि के महत्वपूर्ण पहलू नाभिक के आकार और आकार मापदंडों की सटीक परिभाषा है । यह धुंधला और छवि के लिए इस्तेमाल आवर्धन की स्पष्टता पर निर्भर करता है । हमने मैन्युअल रूप से विश्लेषित डेटा1प्रकाशित करने के लिए तुलना करके विधि की सटीकता की पुष्टि की । आगे हमारी विधि की सटीकता की पुष्टि करने के लिए, हम विभिंन स्थितियों के तहत कई म्यूटेंट का इस्तेमाल किया और प्रकाशित साहित्य के साथ परिणामों की पुष्टि की । यह भी सूक्ष्म और मजबूत phenotypes- cpb-3 और जीएलपी-1 म्यूटेंट, क्रमशः का पता लगाने के लिए विधि की क्षमता की पुष्टि की । इसके अलावा, इस विधि germline के भीतर या यहां तक कि उपभेदों के बीच नाभिक आकार और आकार में परिवर्तन करने के लिए अनुकूलनता से पता चलता है । यह गुण ऐसे गुणसूत्रों और शुक्राणु के रूप में germline में छोटे संरचनाओं की पहचान और स्कोरिंग भी सक्षम बनाता है । विधि भी आगे आकार और आकार पैरामीटर के लिए समस्या निवारण की अनुमति देता है, यदि आवश्यक हो । हमारा विश्लेषण germline में नाभिक के वितरण को स्पष्ट करने में सक्षम था और पता चला कि नाभिक में mitotic और pachytene क्षेत्रों में विभिन्न पैटर्नों का आयोजन किया जाता है. आरईसी-8 और DAPI धुंधला करने के लिए तीन आयामी प्रतिपादन लागू करके, हम भी mitotic क्षेत्र के नाभिक के भीतर आरईसी-8 का वितरण दिखाया ।

germline cytoskeletal संरचनाओं के actin धुंधला सक्षम विस्तृत परीक्षा के तीन आयामी प्रतिपादन । germline दो अलग actin संरचनाओं है, हालांकि वे शारीरिक संपर्क बनाए रखने के लिए प्रकट होता है । जबकि पूरे germline के लिए cytoskeleton के पुनर्निर्माण एक एकल इकाई के रूप में संभव है, सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त किया जा सकता है अगर ब्याज के क्षेत्रों mitotic, संक्रमण, और meiotic क्षेत्रों में चुना जाता है । बाहर germline cytoskeleton एक अपरिभाषित आकार है और समीपस्थ अंत में एक रेशा संरचना में विकसित । इसलिए actin वितरण में अंतर को समायोजित करने के लिए विशिष्ट पैरामीटर्स को परिभाषित करके germline actin cytoskeleton के तीन-आयामी पुनर्निर्माण में हमारा प्रोटोकॉल सक्षम करता है । विश्लेषण का सबसे महत्वपूर्ण पहलू इस तरह के नाभिक आकार और सतह विस्तार की आवश्यकता के रूप में मापदंडों की परिभाषा है । वास्तविक आकार के नीचे नाभिक आकार कम सॉफ्टवेयर के लिए अलग वस्तुओं के रूप में नाभिक के भीतर चमकीले धब्बे लेने के लिए जोखिम होगा । इसी तरह, उच्च सतह विवरण मूल्यों सटीक तीन आयामी संरचनाओं के नुकसान के लिए नेतृत्व करेंगे । प्रस्तावित विधि विच्छेदन और germline धुंधला की गुणवत्ता की परिशुद्धता पर निर्भर करता है । एक क्षतिग्रस्त germline germline से नाभिक की रिहाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, गलत क्रमांकन के कारण । दाग से उच्च पृष्ठभूमि भी गलत नाभिक गिनती और अनुचित तीन आयामी प्रतिपादन का कारण होगा ।

हमारे विधि germline विश्लेषण के पहले से ज्ञात स्वचालित तरीकों जहां हम नाभिक संख्या और वितरण/एक एकल प्रोटोकॉल20के साथ अंतरिक्ष में germline प्रोटीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने में सक्षम है प्रदान करता है । दूसरे, हमारी विधि germline के भीतर गुणसूत्रों जैसे छोटे संरचनाओं के स्कोरिंग में सक्षम बनाता है । गुणसूत्र अलगाव oocyte विकास का एक महत्वपूर्ण पहलू है21। हमारे विधि का प्रयोग, यह संख्या और गुणसूत्रों की स्थिति का पता लगाने के लिए जहां दूरी जंगली प्रकार अंडाणुओं के खिलाफ जांच के द्वारा परिभाषित किया जा सकता है संभव है । गुणसूत्र जुदाई को प्रभावित करने वाले किसी भी उत्परिवर्तन इस उपकरण का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है । इसके अलावा, विधि 2-सेल मंच पर भ्रूण में अध्ययन गुणसूत्रों को बढ़ाया जा सकता है । गणनात्मक विश्लेषण spermatheca में शुक्राणुओं की संख्या, एक oocyte और germline cytoskeletal संरचनाओं में गुणसूत्रों की संख्या भी प्रदान करता है । साथ में लिया गया, विधि विश्लेषण समय काफी कम करते हुए एकल प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए C. एलिगेंस germline का व्यापक विश्लेषण प्रदान करता है । विधि प्रत्येक विश्लेषण (नाभिक संख्या, प्रोटीन वितरण, और cytoskeletal संरचना) के लिए एकाधिक उपकरणों की आवश्यकता समाप्त और कोडिंग किसी भी विशिष्ट सॉफ्टवेयर में आवश्यक समय निकालता है । अंत में, इस विधि को प्रभावी ढंग से तीन-बेहोश रहते कीड़े के आयामी विश्लेषण सहित अंय कीड़ा अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई विरोध नहीं की घोषणा ।

Acknowledgments

हम उनके तकनीकी समर्थन के लिए मोनाश Microimaging धंयवाद । कुछ उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र है, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान की गई । इस काम के लिए एक मोनाश विश्वविद्यालय के द्वारा समर्थित किया गया था एक चिकित्सा डिस्कवरी फैलोशिप, NHMRC परियोजना अनुदान (GNT1105374), NHMRC वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप (GNT1137645) और veski इनोवेशन फैलोशिप: VIF 23 करने के लिए रोजर Pocock.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III  Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacteria Homemade
Nematode Growth Media (NGM) plates Homemade
polyclonal rabbit anti-REC-8  SDIX 29470002
Alexa 488 conjugated antibody raised in goat Thermofisher Scientific A-21236
Cytoskeletal dye phalloidin  Thermofisher Scientific A-12380
DAPI  Thermofisher Scientific  62248
Poly-L-lysine  Sigma Aldrich P5899
Tetramisol  Sigma Aldrich P5899
MgSO4 Sigma Aldrich M7506
1M HEPES buffer, pH 7.4  Sigma Aldrich G0887
10X PBS pH 7.4  Thermofisher Scientific AM9625
Tween-20  Sigma Aldrich P1389
EGTA Sigma Aldrich E3889
37% Paraformaldehyde solution Merck Millipore 1040031000
Normal goat serum Sigma Aldrich G9023
Fluoroshield fixing reagent  Sigma Aldrich F6182
Ethanol  Millipore  1009832511
Methanol Sigma Aldrich 34860
20°C & 25°CIncubator  Any brand
Light microscope Any brand
Confocal microscope   Any brand (Leica, Zeiss)
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. Bitplane
Phospho buffered saline, pH 7.4 Homemade
Teflon microscope slides  Tekdon   941-322-8288

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References

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नाभिक, प्रोटीन, और Cytoskeleton के वितरण का अध्ययन करने के लिए <em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> Germline का अभिकलनी विश्लेषण
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Gopal, S., Pocock, R. Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (134), e57702, doi:10.3791/57702 (2018).More

Gopal, S., Pocock, R. Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (134), e57702, doi:10.3791/57702 (2018).

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