Summary
この作業の目的は、実用的な脂肪水ファントム ファントム脂肪をさまざまな割合とボリュームを生成するカスタマイズすることができますを作成するためのプロトコルを記述するためです。
Abstract
画像脂肪組織に新しい技術を開発すると、そのようなプロトコルの検証を行うメソッドがますます重要になっています。ファントム、組織や臓器、目的の実験的レプリカは、低コスト、柔軟なソリューションを提供します。しかし、高価で特殊な機器へのアクセス、なし高脂肪分数で安定したファントムを構築 (e.g。、> 褐色脂肪組織に見られるものなど 50% 脂肪率レベル) 脂質の疎水性性質のために困難にすることができます。この作業は、0%、25%、50%、75%、100% の基本的な実験室の供給(ホット プレート、ビーカーなど)と簡単にアクセスできるコンポーネント (蒸留水、寒天、水溶性を使用しての脂肪の分数の 5 x 100 mL ファントムを作成するため、低コストで詳細なプロトコルを示す界面活性剤、安息香酸ナトリウム、ガドリニウム-diethylenetriaminepentacetate (DTPA) 造影剤、ピーナッツ油、油溶性界面活性剤)。プロトコルに柔軟に対応する設計されましたそれは脂肪質の異なる画分とボリュームの広い範囲でファントムを作成する使用できます。この手法で作成したファントムは、構築されたファントムのターゲット値に脂肪水磁気共鳴イメージングから脂肪の割合の値を比較した検討で評価しました。今回得られた一致の相関係数は 0.998 (95% 信頼区間: 0.972 1.00)。要約すると、これらの研究は、脂肪ファントム脂肪組織が臨床的に関連する組織や臓器の範囲にわたってイメージング技術を検証するためのユーティリティを示します。
Introduction
脂肪とトリグリセライドの磁気共鳴画像 (MRI) などの画像診断装置を用いた定量化に興味は多方面にわたってあります。研究分野は、臓器や組織など肝1膵臓の2、および骨格筋3に白と茶色の脂肪組織の貯蔵庫の調査および脂質の異所性ストレージをなど。脂肪の定量化のためのこれらの新規技術を開発すると、撮像パラメーターが研究および臨床応用に有効であることを確認する方法が必要です。
ファントム、組織や臓器の実験的レプリカ開発し、イメージングのテクニック4を検証する低コスト、柔軟性、および制御ツールを提供します。具体的には、脂肪から成り、水比または脂肪体積 (FF) 臨床興味の組織のそれに匹敵するファントムを構築できます。組織や臓器での FF の値が大きく異なることが臨床的に: 褐色脂肪組織での FF が 29.7%、93.95; の間滝平均肝脂肪変性患者で FF は 18.1 ± 9.06;1.6% 22.27と 2 型糖尿病の範囲のリスクで成人の膵 FFあらかじめ病気のいくつかのケースでデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者はいくつかの筋肉の8FF のほぼ 90% の値を持つことができます。
水などの極性分子から成るソリューションでよく脂質など非極性分子が溶解しない、ために、やりがいのまま高い目標 FF で安定したファントムを作成します。FF までの 50% 多くの既存のメソッド使用できます脂肪水ファントム9,10、11,12を作成します。通常高い FFs を達成する他の方法には、高価な機器、ホモジナイザー、超音波細胞攪乱13,14などが必要があります。これらの技法は、高い FF ファントムのためのロードマップを提供、機器の制約と実験方法の変化量制限再現性と堅牢な脂肪水ファントムを作成するための努力。
これらの前の技術を踏まえ、カスタマイズ可能な FF の範囲の値にわたって低コストで安定した脂肪水ファントムを作成する方法を開発しました。このプロトコルの詳細 0%、25%、50%、75%、100% の単一のホット プレートを使用しての FF 値と脂肪のファントムの 5 x 100 mL を作るために必要な手順を実行します。また、さまざまなボリューム (10 に 200 mL) と脂肪の割合 (0 ~ 100%) を作成する簡単に調整できます。ファントムの手法の有効性は、実現可能性研究比較脂肪水 MRI FF 値、ターゲット FF 構築されたファントムで評価した.
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Protocol
1. ワークステーションと材料を準備します。
- すべての研究室の安全規則に従います。目の保護と手袋を着用します。読み取り化学物質安全性データ シート各試薬の使用し、適切な予防策を講じる。材料と機器リスト、化学処理手順、およびガラス製品の注意事項を確認してください。
注意: このプロトコルには、高温ホット プレートの使用が必要です。注意を使用し、コンテナーをホットとやり取りし、ホット プレートの表面には触れないで耐熱手袋を着用します。 - ワークスペースをオフし、消毒剤で表面をきれいします。手を洗うし、グローブを着用してください。
- すべての楽器と幻の長寿の増加汚染の潜在的な危険性を減らすためにすべてのガラス瓶の内側を殺菌します。
注: ファントムが数日間以上使用する場合、細菌の増殖を防ぐためにエタノールと完成したファントムの表面を定期的にクリーンアップします。
2. 水ソリューションを準備します。
- 水ソリューションのワークスペースを準備します。ベンチに次の材料および装置の位置: シリンダー、400 mL ビーカー、攪拌棒、スケール、2 x の重さの船、へら、2 x 1.0 mL 注射器針、蒸留水、ガドリニウム-diethylenetriaminepentacetate (DTPA) 造影剤を卒業水溶性界面活性剤、寒天、安息香酸ナトリウム。
注: または針なし注射器は使用できます。ただし、針を使用してと、測定精度を向上させるため、内容は、水や油のソリューションに追加されているときにスプラッタを防ぐを助けます。 - 400 mL のビーカーに攪拌棒を配置します。100 や 200 mL のメスシリンダーのシリンダーを使用して 300 mL の蒸留水を測定し、ビーカーに水を注ぐ。ホット プレートにビーカーを置き、攪拌速度 100 rpm の 90 ° C に設定します。
注意: 高温は、迅速な結果を達成するためにこのプロトコルで使用されます。解決策は、時間の長い期間、ホット プレートに残っていない、ため、ホット プレートの温度設定はソリューションの温度を反映しません。 - 校正スケールを使用して重量を量るボートに安息香酸ナトリウムの 0.30 g を測定します。安息香酸ナトリウムを水のソリューションに追加します。
- 注射器を使用すると、水溶性の界面活性剤の 0.6 mL を測定します。空気の泡がないことを確認してください。ソリューションの中心に数ミリの針を押し、ビーカーの壁にスプラッタを避けるために水溶性の界面活性剤をゆっくりと解放します。
- 清潔なシリンジ、ガドリニウム DTPA 造影剤の 0.24 mL を測定します。ステップ 2.4 と同じ方法を使用して、ビーカーにそれを追加します。
メモ: ガドリニウム DTPA は興味のティッシュに匹敵する幻の MRI リラクゼーション プロパティを調整する使用されます。読者は、興味の組織の緩和特性に合わせて追加したガドリニウム DTPA のボリュームを調整できます。 - 重量を量るボートに寒天の 9.0 g を測定します。ゆっくりと水をビーカーにヘラで寒天をスプーンします。
- すべてが水ソリューションに追加されて、ホット プレートの温度を 350 ° C 増加し、バーの寒天を溶かすための 5-10 分のための 1100 の rpm に速度をかき混ぜます。
- 寒天が溶けているかどうかを確認するには、簡単に水のソリューションをホット プレートから削除、攪拌を停止し、ソリューションの色をチェックします。クリア (のぼりまたは塊)、黄色またはオレンジ色で、溶けた寒天はする必要があります。
- 寒天が完全に溶けるが、一度注射器を使用したり、小さなバイアルに水ソリューションの約 3.5 mL を注ぐ。テスト ソリューションが設定されていない、5-10 分後分離寒天は溶けていません。350 ° C に戻るホット プレートの温度を高め、ソリューションを加熱を続けます。
- 正しくテスト バイアル セットで水ソリューションまで 2.8 のステップを繰り返します。
- 50 ° C、100 rpm でホット プレートに水ソリューションを残します。作業スペースをきれいにし油液の準備します。
- ベンチから以下の資料を削除: スケール、重量を量るボート、ヘラ、針 (使用) 2 x 1.0 mL 注射器、蒸留水、ガドリニウム DTPA 造影剤、水溶性界面活性剤、寒天、安息香酸ナトリウム × 2。
- ベンチに次の材料および装置の位置: 400 mL ビーカー (クリーン)、撹拌 (クリーン)、2.0 mL 注射器針、ピーナッツ油、油溶性界面活性剤。
3. 油剤
- きれいな 400 mL ビーカーに新しい攪拌棒を配置します。卒業シリンダーを使用して 300 mL のピーナッツ オイルを測定し、ビーカーに注ぐ。ビーカーの水溶液を含むを削除し、ホット プレートに油ソリューション ビーカーを置きます。1 分 100 rpm の攪拌速度 90 ° C に設定します。
注:15ひと脂肪組織でトリグリセリドと比較して同じような核磁気共鳴スペクトルをもっているために、ピーナッツ油が使用されます。- 放置しないでください、オイル、ホット プレートで。油が熱くなりすぎた、煙を開始、ホット プレートからそれを削除し、ホット プレートに油を返す前に温度を下げます。
- 清潔なシリンジと油溶性の界面活性剤の 3.0 mL を測定します。手順 2.4 で説明した同じ技術を使用して、油溶性の界面活性剤をビーカーに加えます。150 ° C と 1100 rpm 5 分油液を完全に混合するために、ホット プレートを設定します。
- ホット プレートに油液を取るし、ファントムを作成する下準備としてワークスペースをクリーンアップします。
- ベンチから以下の資料を削除: 2.0 mL 注射器針 (使用)、ピーナッツ油、油溶性界面活性剤。
- ベンチに次の材料および装置の位置: 250 mL 三角フラスコ、攪拌バー (きれいな)、体積のピペット、ピペット ホルダー、5 × 120 mL ガラス瓶。
4. 幻のエマルジョンを作成します。
- 水と油のソリューションの体積のピペットを準備します。ピペットは、クロス汚染を防ぐために彼らのそれぞれのソリューションのみ使用ください。
- ピペットのプロトコルで使用されているボリュームのサイズに合わせて。たとえば、2 x 50 mL 体積ピペット (50 mL 水溶液 + 50 mL 油液) ターゲット 50% 脂肪の FF で 100 mL のファントムを作成するを使用します。
- ホット プレートに水ソリューションを配置し、ホット プレートを 300 ° C から 1100 rpm に設定します。4-5 分後、撹拌機をオフにします。
- ホール ピペットを使用して、部分的にソリューションの少量 (5-10 mL) でピペットを充填し、ビーカーに戻って解放によって水ソリューションを抽出の準備ができてが確認してください。水ソリューションを簡単に削除されてし、ピペットで過度の残りなしでリリースすることができます、それ以外の場合、次のステップに移動、ホット プレートにままにして 2 〜 3 分にもう一度チェックします。
注: 水ソリューションのコンポーネントは、攪拌および/またはできるだけ頻繁に暖かい水のソリューションを保持することをお勧めしますので設定し、分離することになりやすい。水溶液が加温され、転送する前に攪拌された場合、それは非常に冷却凝固に寒天の傾向のための量を正確に測定することは困難になります。 - 250 mL 三角フラスコにきれいな攪拌棒を慎重に追加します。ホット プレートに水溶液を取り出して適切な量 (表 2) 測定エルレンマイヤー フラスコに転送。
- ホット プレートに油液を配置し、90 ° C で設定 1100 rpm 均一、ソリューションにします。1-2 分後、ホット プレートから油液を削除し、三角フラスコを置き換えます。
- 油液 (表 2) の適切な量を測定し、ゆっくりエルレンマイヤー フラスコの水のソリューションに追加します。
- すべての油液を追加すると、300 ° C まで温度が上昇し、1100 rpm で攪拌を維持します。4-5 分 (攪拌棒から渦があるはず) のソリューションの組み合わせをかき混ぜます。乳剤は白、クリーミーな質感とする必要があります。
- 電磁攪拌バー レトリーバーを使用して攪拌棒を削除します。
注: すべての将来エマルジョンから攪拌バーを削除する攪拌バー レトリーバーを使用ください。それぞれの使用の間に徹底的にきれい。 - 耐熱手袋を使用すると、慎重に三角フラスコでクリーン 120 mL ガラス瓶に混合物を注ぐ。ゆっくりとそれを冷却、混合物中の気泡を防ぐためにガラス瓶の側面の下混合物を注ぐ。
- きれいな三角フラスコと攪拌棒、手順 4.2-4.8 すべてファントムが作成されるまで、水と油のソリューションの量を調整することを繰り返します。
注: クリーニングの前にガラスがクールになっていることを確認します。
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Representative Results
水ソリューションを正しく準備されている場合、ソリューションの少量はテスト バイアル (図 1、左) ですぐに凝固する必要があります。ソリューションは、(図 1右) を分離している場合、ソリューションを (プロトコルの 3.8 ステップの手順に従って)、再度準備されるべき。エマルジョンを分離 (の例図 2、左右)、怪人は現実的ではないと、破棄する必要があります。これが発生すると、それは通常乳剤は十分に高い温度に到達しないためです。
成功したファントムをイメージ、MRI で測定できる均質な混合物を形成する凍らせます。(図 3)。高い一致相関係数 (0.998; 95% 信頼区間: 0.972 1.00) 回帰直線の 95% の信頼バンド内の id の行を含めることで計測した平均の MRI 観測脂肪信号分数 (FSF) 値を示唆していると、画像の目的の領域でした脂肪水ファントム (図 4) で既知の FF 値から著しく異ならない。
図 1。図 (左) 凝結し、(右) 水ソリューション テスト バイアルを分離します。小テスト バイアルをサンプリングして、水解の実行可能性を評価する必要があります。水溶液は (左) 固まる場合、ファントム構築プロトコルの次のステップに進みます。かどうか水ソリューション分離 (矢印で示した 2 つ右のバイアルに)、水ソリューションは、ファントムのエマルジョンの形成に使用することができます前に再準備する必要があります。
図 2。失敗したファントム エマルジョン例。エマルジョンの設定が適切かどうかを注入後ファントム約 10 分を目視で確認します。ファントム (左) を分離する開始または不均質 (右) が表示されます、ファントムをリメイクする必要があります。
図 3。ファントムとそのそれぞれの磁気共鳴画像 (MRI) 結果の範囲の概略図。写真は、(0%、25%、50%、75%、100%; 上) 構築されたファントムのわずかな色の違いを示しています。プロトン密度脂肪信号分数 (FSF) マップでは、同種の FSF 測定ターゲット脂肪 (中央) に似たを明らかにします。ガラス容器のイメージング特性による個別のエッジ効果は FSF の各マップの国境に明らかにされます。
図 4。散布図表示測定知られている FF (ブルー ポイント) の関数として FSF 値。黒の実線は、アイデンティティを示します。青色の点線は、ベスト フィットの行を示します。日陰では、推定値の 95% 信頼区間を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。プロトコルの高レベルの概要を示すスケッチです。図の左上は、食材、材料、およびホット プレート設定水ソリューションを準備して図の右上油液を準備するための食材、材料、およびホット プレート設定を示しています。下部には、エマルジョンを形成する油と水のソリューションを組み合わせることをホット プレート設定が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 数量 | 機器・材料 | ||
| 300 mL | 蒸留水 | ||
| 9.0 g | 寒天培地 | ||
| 0.6 mL | 水溶性界面活性剤 | ||
| 0.24 mL | ガドリニウム DTPA 造影剤 | ||
| 0.3 g | 安息香酸ナトリウム | ||
| 300 mL | ピーナッツ油 | ||
| 2.0 mL | 油溶性河越 | ||
| 1 * | 攪拌機 w/ホット プレート | ||
| 3 | バーをかき混ぜる | ||
| 2 | 400 mL ビーカー | ||
| 1 | 250 mL 三角フラスコ | ||
| 2 | 25 mL ホール ピペット | ||
| 1 | 3.0 mL 注射器 | ||
| 2 | 1.0 mL 注射器 | ||
| 3 | 注射針 | ||
| 1 | ヘラ | ||
| 1 | スケール | ||
| 2 | ボートの重量を量る | ||
| 5 | 120 mL ガラス瓶します。 | ||
| 1 | 耐熱手袋 (ペア) | ||
| 1 | 1-3 dram バイアル | ||
| 2 | 50 mL ホール ピペット | ||
| 2 | 75 mL ホール ピペット | ||
テーブル 1。必要な機材の量 5 × 100 mL ファントム (0%、25%、50%、75%、100%) です。
| 幻水/油測定 | ||
| 脂肪率 | 水ソリューション | 油液 |
| 0% | 100 mL | 0 mL |
| 25% | 75 mL | 25 mL |
| 50% | 50 mL | 50 mL |
| 75% | 25 mL | 75 mL |
| 100% | 0 mL | 100 mL |
表 2。5 × 100 mL ファントム (0%、25%、50%、75%、100%) を作成する油と水の溶液の測定。
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Discussion
脂肪組織およびトリグリセリドのコンテンツで生体を定量化するために使用の医療画像技術の検証に適した脂肪水ファントムを作成する手法について述べる.2 つの貯水池 (油液と水のソリューションの 1 つ) を作成すると、FF の値が-50% を超える値を含む-の様々 な安定したファントムは、高価な機器を必要とせず建設されました。高い FF ファントム (> 50%) 脂肪の定量化のためのイメージング技術、組織、褐色脂肪組織5など、FF 価値の高い臓器に有効なことを確認するためのユーティリティを提供します。FSF の MRI の見積もりも、既知の FF 値と相関しました。
場合のみ 1 つのホット プレート (としてこのプロトコルで記述されている)、各ソリューションの熱を維持するための物流は最大の関心事。加熱や攪拌がなければ水ソリューション可能性があります冷却し、凝固し始めます。これを避けるには、水ソリューションを配置、鉄板 (< ~ 100 rpm、100 ° C) 可能な限り、常にファントムを混合。重要なは、ファントムを作成する各ソリューションを抽出する場合は、油と水の両方のソリューションはよく混合する必要があります。常に少なくとも 30 ホット プレートにそれぞれのソリューションを配置 s (< 100 ° C ~ 100 rpm) ソリューションを抽出する前に。理想的なケース、水溶液、油液とファントムのエマルジョンのため、別のホット プレートを使用してください。各ソリューションを作成する上記同じ手順に従います。一度完全に混ぜ、50 ° C と 100 rpm 会場や定着を防ぐために両方のホット プレートを設定します。ビーカーからソリューションを抽出する前に、攪拌を切り、完全に移動を停止する攪拌棒を待ちます。
油エマルジョンの水比の精度及び重要なですが、油と水のソリューションの各コンポーネントの測定はより多くの柔軟性の許可します。創業、MRI 観察 FSF は合計ボリュームの「無脂肪」信号対「脂肪」の測定したがって、「非脂肪」は、画像信号強度(水、寒天、界面活性剤など)に寄与する化合物をすることができます。我々 はまだそれらの比率は、最も安定性と再現性のあるファントムを作成する発見された、水と油のソリューション コンポーネントをできるだけ正確に測定をアドバイスします。水溶液に寒天の量の小さい偏差 (e.g。、9.0 g の代わりに 8.9)、しかし、オイルが水溶食率が維持される場合を乳剤の全体的な FF に影響はありません。常温水と油のソリューションの量の測定は各コンポーネントのボリュームに熱膨張の効果のための小さなエラーもあります。熱による全体的な FF の誤差を推定する体積の温度、密度16,17と温度の比較的小さい変化の反射として油と水の膨張係数を考慮考慮0.5% 未満に拡大。我々 はまた水と脂質のガドリニウム DTPA の relaxivity が異なる場合があります可能性を注意してください。だから、パルス シーケンスのパラメーターに応じて、MRI FSF 測定の定量精度が低下することでした。MRI 観察 FSF はデータの分析に使用されるスペクトル モデルとも異なります。
メソッドの説明がここで、ファントム 10 mL と 200 mL の間を作るに使用されているのみ、小さいまたは大きいボリューム ファントムを生成する手法を使用できます。特に、それは量を抽出することは困難です < 10 mL、溶液の粘度による貯留層から。少量のファントム、したがって、最終的なファントムの FF の精度を維持するために必要なボリュームを描画するから余分な乳剤が必要です。たとえば、10% ターゲット FF とファントム 10 mL は、100 mL エマルジョンから 10 mL の抽出を必要とします。大規模なファントムを作成するとき (> 100 mL)、攪拌棒とガラスの両方のサイズを縮小する必要があります一緒に (およびガラス容量に溶液の比率) かくはん > 500 rpm に設定されている場合、ソリューションに渦を作成します。可能性のエマルジョンは、渦なしの均質性を達成できません。
高い FF ファントムの作成の複雑さを考えると、プロトコルからの小さい偏差は安定性および最終的なファントムの品質に大きな影響を与えるをかもしれません。部屋の温度、高度、湿度などの環境条件はファントムの準備プロセスを一貫性のある方法で変更し、最終製品に悪影響を与える可能性があります。水ソリューションの中間チェックを検出し、それらの影響を軽減するために提供します。ただし、プロトコルの詳細に注意を払うとも最後のファントムを分けることができ、プロセスが繰り返される必要がありますは不可能です。
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Disclosures
著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が任意の商業や金融関係の不在を宣言します。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所 (NIH) と国立糖尿病・消化器・腎臓病 (NIDDK) 提供されたサポートの資金/NIH R01 DK 105371。脂肪水ファントム作成上のアドバイスや提案を博士 Houchun (ハリー) 胡に感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Amazon | B000P9BY38 | Base of water solution |
| Agar | Sigma Aldrich Incorporated | A1296-100G | Gelling agent |
| Water-Soluble Surfactant | Sigma Aldrich Incorporated | P1379-500ML | Surfactant/emulsifying agent |
| Gadolinium-DTPA Contrast Agent | Bayer Healthcare | 50419-0188-01 | Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent. |
| Sodium Benzoate | Sigma Aldrich Incorporated | 71300-250G | Preservative |
| Peanut Oil | Amazon | 54782-LOU | Base of oil solution |
| Oil-Soluble Surfactant | Sigma Aldrich Incorporated | S6760-250ML | Surfactant/emulsifying agent |
| Hotplate w/ Stirrer | Fisher Scientific | 07-770-152 | |
| Stir bars (Egg-Shaped) | Sigma Aldrich Incorporated | Z127116-1EA | |
| 400 mL Beaker | Sigma Aldrich Incorporated | CLS1003400-48EA | |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | Sigma Aldrich Incorporated | CLS4450250-6EA | |
| 25 mL Glass Volumetric Pipette | Fisher Scientific | 13-650-2P | Quantity = 2 |
| 50 mL Glass Volumetric Pipette | Fisher Scientific | 13-650-2S | Quantity = 2 |
| 75 mL Glass Volumetric Pipette | Fisher Scientific | 13-650-2T | Quantity = 2 |
| 3.0 mL Syringe | Sigma Aldrich Incorporated | Z248002-1PAK | |
| 1.0 mL Syringe | Sigma Aldrich Incorporated | Z230723-1PAK | |
| Spatula | Sigma Aldrich Incorporated | S3897-1EA | |
| Scale (100g X 0.01g Resolution) | Amazon | AWS-100-BLK | |
| Weigh Boats | Sigma Aldrich Incorporated | Z740499-500EA | |
| 120 mL Glass Jars | McMaster Carr Supply Co | 3801T73 | |
| Heat Resistant Gloves (pair) | Amazon | B075GX43MN | |
| Syringe Needles | Sigma Aldrich Incorporated | Z192341-100EA | |
| 18" stir bar retriver | Fisher Scientific | 14-513-70 | |
| 1 Dram Clear Glass Vial | Fisher Scientific | 03-339-25B |
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