हम उन्नत सामग्री के रोगाणुरोधी लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. यहां, सामग्री सतहों पर रोगाणुरोधी गतिविधि दो तरीकों कि एक दूसरे के पूरक द्वारा मापा जाता है: एक आगार डिस्क प्रसार परीक्षण पर आधारित है, और अंय आईएसओ 22196:2007 आदर्श पर आधारित एक मानक प्रक्रिया है ।
बढ़ाया संपत्तियों के साथ नए उंनत सामग्री के विकास और अधिक और इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में अधिक महत्वपूर्ण होता जा रहा है । इस प्रकार, कई उपंयास जैव सामग्री ऐसे ऊतक इंजीनियरिंग और नियंत्रित दवा वितरण के रूप में बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक विशिष्ट वातावरण नकल डिजाइन किया जा रहा है । कोशिकाओं या एंजाइमों के स्थिरीकरण के लिए बेहतर गुणों के साथ सामग्री के विकास में भी एक मौजूदा अनुसंधान विषय है प्रक्रिया इंजीनियरिंग. हालांकि, इन आवेदनों में एक सामग्री के सबसे वांछित गुणों में से एक रोगाणुरोधी क्षमता किसी भी अवांछनीय संक्रमण से बचने के लिए है । इस के लिए, हम आसानी से वर्तमान (i) के आधार पर सामग्री के रोगाणुरोधी लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें डिस्क प्रसार परीक्षण (प्रसार विधि) और (ii) आईएसओ 22196:2007 आदर्श सामग्री सतहों पर रोगाणुरोधी गतिविधि को मापने के लिए (संपर्क विधि) । यह प्रोटोकॉल सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत रेंज को कवर करने के लिए ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और खमीर का उपयोग किया जाना चाहिए । एक उदाहरण के रूप में, विभिंन रासायनिक प्रकृति के साथ 4 सामग्री Staphylococcus aureus, ई कोलाई, और Candida albicansके खिलाफ इस प्रोटोकॉल के बाद परीक्षण कर रहे हैं । इन परीक्षणों के परिणाम पहली सामग्री के लिए गैर रोगाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शन और अन्य 3 सामग्री के लिए ग्राम सकारात्मक और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के खिलाफ जीवाणुरोधी गतिविधि में वृद्धि. हालांकि, 4 सामग्री में से कोई भी Candida albicansके विकास को बाधित कर रहे हैं ।
प्रत्यारोपण विफलता अक्सर रोगाणुरोधी प्रोफिलैक्सिस और अपूतित काम कर रहे स्थितियों के बावजूद होते हैं कि माइक्रोबियल संक्रमण का एक परिणाम है । यह समस्या बहुत उच्च स्वास्थ्य देखभाल लागत पैदा कर रहा है और1रोगियों के बीच चिंताजनक है । महत्वपूर्ण बैक्टीरिया जैसे Staphylococcus aureus वर्तमान में बहुत ही खतरनाक रोगजनकों और अन्य चिकित्सा प्रत्यारोपण के साथ जुड़े nosocomial संक्रमण में रोगज़नक़ों माना जाता है और चिकित्सा उपकरणों के मुख्य संदूषणों रहे हैं2. इसलिए, उपंयास रोगाणुरोधी रणनीतियों के विकास तत्काल दोनों दैनिक और चिकित्सा का उपयोग करता है के लिए आवश्यक है ।
रोगाणुरोधी एजेंटों एंटीबायोटिक दवाओं3, चतुर्धातुक अमोनियम यौगिकों4, धातु आयनों/आक्साइड5, और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs)6शामिल हैं । एंटीबायोटिक बैक्टीरिया प्रतिरोध के कारण कम कुशल होते हैं,जो एंटीबायोटिक अति8के बढ़ने पर होता है । चतुर्धातुक अमोनियम यौगिकों केवल माइक्रोबियल प्रतिरोध9की वजह से एक अल्पकालिक उपयोग के लिए बहुत ही कुशल हैं । धातु आयनों/आक्साइड लंबे समय के रूप में बहुत प्रभावी रोगाणुरोधी एजेंटों का उपयोग किया गया है और पट्टियों, पानी फिल्टर, पेंट, आदि10,11,12सहित कई आम वाणिज्यिक उत्पादों में उपयोग किया जाता है । हालांकि, यह प्रदर्शित किया गया है कि यौगिकों के इन प्रकार के स्तनधारी कोशिकाओं के कुछ प्रकार के लिए विषाक्त किया जा सकता है13.
AMPs उत्कृष्ट रोगाणुरोधी और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण दिखाएँ14,15, और बैक्टीरिया उन्हें16के खिलाफ एक प्रतिरोध विकसित करने के लिए बहुत मुश्किल लगता है लगता है. हालांकि, शुद्ध AMPs का उत्पादन करने की प्रक्रिया महंगी है; इसलिए, बड़े पैमाने पर उत्पादन व्यवहार्य नहीं है । इस प्रकार, रणनीतियों का उत्पादन AMPs में समस्याओं का मुकाबला करने के लिए विकसित किया गया है (जैसे, छोटे आणविक जीवाणुरोधी peptoid नकल17, peptoids18, α-पेप्टाइड्स19 और β-पेप्टाइड्स20). Methacrylate-समाप्त polypeptides और polypeptoids रोगाणुरोधी और antifouling कोटिंग्स के लिए संश्लेषित किया गया है21.
ऐसे शुद्ध या संकर रूप में उंनत सामग्री के रूप में नए रोगाणुरोधी एजेंटों के विकास, को रोकने और बहुऔषध प्रतिरोधी संक्रमण के इलाज में सक्षम है, तेजी से आवश्यक है । कई ऐसे ऊतक और जैव प्रक्रिया इंजीनियरिंग के रूप में इंजीनियरिंग क्षेत्रों के लिए नई उंनत सामग्री का एक व्यापक रेंज पिछले दशकों में सुधार रासायनिक और भौतिक संपत्तियों के साथ कई तरीकों के माध्यम से विकसित किया गया है: प्लाज्मा-बहुलकीकरण पर भ्रष्टाचार एक hydrophobic सब्सट्रेट22,23,24, crosslinking घनत्व की सिलाई25,26, बहुलकीकरण समाधान में27,28,29 , 30, porogen विघटन31,३२, और मैटीरियल्स के निगमन जैसे ग्राफीन ऑक्साइड (GO)३३,३४,३५,३६ और द्वारा कार्बन nanofibers (CNFs)३७.
इन नई सामग्रियों की रोगाणुरोधी क्षमता का अध्ययन तेजी से उनके संभावित इंजीनियरिंग प्रयोज्यता में वृद्धि कर सकता है और है, इसलिए, आवश्यक हो गया है । हम एक आसान करने के लिए पालन करने के लिए इस तरह के नए उन्नत सामग्री के रोगाणुरोधी गतिविधि यों तो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यहां, नमूना तैयार करने के बाद, दो पूरक तरीकों का पालन कर रहे हैं: पहला आगार डिस्क प्रसार परीक्षण३८ (प्रसार विधि) पर आधारित है और दूसरा आईएसओ 22196:2007 नॉर्म३९ पर रोगाणुरोधी गतिविधि को मापने पर आधारित है सामग्री सतहों (संपर्क विधि) ।
नई उन्नत सामग्री के रोगाणुरोधी गतिविधि 2 मौजूदा तरीकों के आधार पर २ पूरक प्रक्रियाओं से मिलकर इस आसान करने के लिए पालन प्रोटोकॉल द्वारा विश्लेषण किया जा सकता: आगर डिस्क प्रसार परीक्षण३८ और रोगाणुरोधी गतिविधि पर मापा सामग्री आईएसओ 22196:2007 नॉर्म३९के अनुसार सतहों ।
इस शोध के क्षेत्र में, रोगाणुरोधी परीक्षणों के कई साहित्य में रिपोर्ट उच्च परख पर निर्भर हैं । इसलिए, यह बहुत महत्वपूर्ण है प्रयोगशालाओं में जगह में विस्तृत और सुसंगत प्रोटोकॉल है । यह लेख उस दिशा में एक कदम है । इसके अलावा, यह बहुत शोधकर्ताओं जो कम इस क्षेत्र में अनुभवी है और आवश्यकता में गहराई, कदम दर कदम प्रक्रियाओं सटीक परिणामों के लिए पालन करने के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है ।
इस प्रोटोकॉल 10 मिमी व्यास के डिस्क आकार में कटौती सामग्री के कई प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । भंगुर सामग्री 1 एच के लिए एक उपयुक्त विलायक में सूजन को काटने की प्रक्रिया को आसान प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, alginates के रूप में हाइड्रोफिलिक सामग्री autoclaved आसुत जल में हाइड्रेटेड किया जा सकता है । ऐसे इथेनॉल, कीटोंन के रूप में अंय सॉल्वैंट्स, और dichloromethane, उंहें काटने से पहले 1 एच के लिए hydrophobic सामग्री प्रफुल्लित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । हालांकि, कुछ सामग्रियों जैसे पॉली (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) में सूजन होने की जरूरत नहीं है और उन्हें सीधे काटा जा सकता है । उसके बाद, यह बहुत महत्वपूर्ण है एक वैक्यूम ओवन में नमूना सामग्री डिस्क सूखी और 1 के लिए इथेनॉल और यूवी विकिरण के साथ प्रत्येक नमूना निष्फल किसी भी संदूषण जोखिम से बचने के लिए ।
इस प्रोटोकॉल की सिफारिश TSA और संस्कृति मीडिया के रूप में TSB और 3 सूक्ष्मजीवों की शुद्ध संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत रेंज तक पहुंचने: ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया Staphylococcus aureus, ग्राम नकारात्मक जीवाणु ई कोलाई, और खमीर Candida albicans। हालांकि, वैकल्पिक संस्कृति मीडिया और विभिंन गर्मी की स्थिति की जरूरत में अंय सूक्ष्मजीवों भी इस प्रोटोकॉल के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । कई बार, केवल 1 सूक्ष्मजीवों के लिए एक नई सामग्री के रोगाणुरोधी गतिविधि का एक प्रारंभिक विचार है परीक्षण किया है ।
सूक्ष्मजीवों की सिफारिश की 3 विभिंन प्रकार के खिलाफ मजबूत रोगाणुरोधी गतिविधि दिखा सामग्री भी एंटीबायोटिक के खिलाफ परीक्षण किया जाना चाहिए प्रतिरोधी रोगजनकों जैसे methicillin प्रतिरोधी Staphylococcus epidermidis (MRSE), जो सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल के साथ उपयोग किया गया है । अन्य महत्वपूर्ण दवा प्रतिरोधी सूक्ष्मजीवों जो ज्यादा चिंता का कारण बन रहे हैं ग्राम पॉजिटिव methicillin प्रतिरोधी Staphylococcus aureus (MRSA) और vancomycin प्रतिरोधी Enterococci (VRE), और चना-नकारात्मक Pseudomonas aeruginosa४०,४१.
इस प्रोटोकॉल के साथ इस तरह के वायरस और परजीवी के रूप में सूक्ष्मजीवों के अंय प्रकार के खिलाफ सामग्री की एक फिल्म निषेध और रोगाणुरोधी गतिविधि का परीक्षण नहीं किया जा सकता । हालांकि, इस प्रोटोकॉल एक नई उंनत सामग्री के एक रोगाणुरोधी अध्ययन के लिए एक बहुत ही उपयोगी प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है ।
रोगाणुरोधी आगार डिस्क प्रसार परीक्षण में, एक महत्वपूर्ण कदम है जब नमूना डिस्क प्लेट के केंद्र में रखा जाना है क्योंकि कुछ सामग्री के रूप में जल्द ही गुना के रूप में वे आगार मीडिया के साथ संपर्क में मिलता है । इस मामले में, यह सावधानी से नमूना खुलासा करने के लिए चिमटी की एक बाँझ जोड़ी का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । दूसरी ओर, संपर्क विधि में, यह है कि कोई व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों सामग्री के लिए पालन सुनिश्चित करने के क्रम में उन्हें चार बार एक जोरदार भंवर और sonication द्वारा पीछा pipetting द्वारा पंजाबियों के साथ बहुत अच्छी तरह से नियंत्रण और नमूना डिस्क धोने के लिए महत्वपूर्ण है सतह.
इस वीडियो प्रोटोकॉल जैसे कई इंजीनियरिंग के अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि, इंजीनियरिंग, टिशू इंजीनियरिंग, नियंत्रित दवा वितरण, पैकेजिंग सामग्री, अपशिष्ट जल उपचार, और कृषि, जो एक उच्च के साथ उपयोग करता है वांछनीय रोगाणुरोधी क्षमता ।
इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त परिणामों गुणात्मक (छवियों) और मात्रात्मक (जीवाणुरोधी “हेलो” और व्यवहार्यता की हानि की सामान्यीकृत चौड़ाई) अपनी reproducibility का एक अच्छा विश्लेषण के साथ कर रहे हैं (± मानक विचलन मतलब) । जब विभिंन सामग्रियों की तुलना, ये मतलब प्रसार और संपर्क विधि परिणाम विश्लेषण के साथ प्राप्त मूल्यों को एक तरह से ANOVA द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए, तुर्की के पोस्ट हॉक विश्लेषण के बाद, ताकि अध्ययन के लिए अगर वे कर रहे हैं, सांख्यिकीय, काफी भिंन (p < 0.01) ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक 2017-231-001UCV और 2018-231-001UCV अनुदान के माध्यम से इस काम के लिए वित्तीय सहायता के लिए Universidad Católica de वालेंसिया San विसेंट Mártir स्वीकार करना चाहते हैं ।
Cylindrical punch | 10 mm diameter | ||
Petri dishes | soria genlab | P101 | 90 mm diameter, sterile |
Tryptic soy agar (TSA) | Liofilchem | 610052 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Tryptic soy broth (TSB) | Liofilchem | 610053 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Sterile cotton swab | EUTOTUBO | 300200 | |
Centrifuge tubes | VIDRA FOC, SA | 429900 | 50 mL, sterile |
Ethanol | VWR | 83813360 | Absolute ethanol |
Sterile 48-wells plate | COSTAR | 3548 | Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene |
A pair of tweezers | BRAUN | 24612036 | Toothless |
Sterile phosphate buffered saline (PBS). | VWR | E404-100TAPBS | |
Vaccum oven with a connected vacuum pump | JP Selecta, SA | 5900620 | |
Laminar flow hood | TELSTAR Technologies, SL | TELSTAR AH-100 | 12.0 W lamp of UV-C radiation |
Class II Biological safety cabinet | LABOGENE | MARS 1200 | |
Incubator | ASTEC CO, LTD | SCA-165DR | |
Vortex mixer | Biosan | V-1 Plus | |
Spectrophotometer | Macherey-Nagel, Germany | Nanocolor UV/VIS II | |
Bunsen burner | JP Selecta, SA | 7001539 | |
Alcohol burner | VIDRA FOC, SA | 1658/20 | In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet |
Orbital shaker | sartorius stedim | 8864845 | |
Sonicator | SELECTA | 3000617 | 50/60 Hz |
Digital calliper | ACHA | 17-260 | 0-150 mm |
Serological pipette | Fisherbrand | 13-678-11 | 25 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-4950 | 5 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-5541 | 10 mL, sterile |
Micropipette | GILSON | FA10005P | Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL |
Micropipette | GILSON | F123602 | Pipetman P1000, 200-1000 µL |
Micropipette | GILSON | FA10016 | Pipetman L P12X300L, 20-300 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-200-960 | 2-200 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-1K0-480 | 100-1000 µL |
Pre-sterilized tube | INSULAB | 301402 | 10 mL |
Photo camera | Canon EOS 5D | Any camera with high resolution can also be utilized | |
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus | strain V329 | Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9), 2888–2896 (2001) | |
Gram-negative bacteria Escherichia coli | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 101 | |
Yeast Candida albicans | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 1394 | |
Microcentrifuge tubes | DASLAB | 175508 | 1,5 mL |
Autoclave | JP Selecta, SA | 4002136 | |
Spectrophotometer-cuvettes | UVAT Bio CB | F-0902-02 | 4,5 mL |
Drigalski spatula | LABBOX | SPRP-L05-1K0 | Sterile, disposable |
glass balls (2 mm diameter) | Hecht Karl | 1401/2 | Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula |
Autoclave bags | DELTALAB | 200318 | To sterilize microbiological residues or contaminated material |
Electronic pipette filling device | JetPip | JET BIOFIL | |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-100-010 | 100 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-250-010 | 250 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-500-010 | 500 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-1K0-010 | 1000 mL, for autoclaving culture media |
Latex gloves | DENIA | 2278000000 | |
Indicator tape for sterilization | LABBOX | STAP-A55-001 | Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process. |
Universal test tube rack | LABBOX | MTSP-001-001 | To hold centrifuge tubes |
Microcentrifuge tube rack | VWR | 211-0210 | To hold microcentrifuge tubes |
Sterile loop | ACEFE S.A. | 100140055 | 10 µL of capacity for microbial culture |
Material M1 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 1 | |
Material M2 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 2 | |
Material M3 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type3 | |
Material M4 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 4 | |
Material C | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Control material |