Summary
우리는 고급 재료의 항균 특성에 대 한 프로토콜을 제시. 여기, 소재 표면에 항균 성 활동 서로 보완 하는 두 가지 방법에 의해 측정 된다: 하나는 agar 디스크 확산 테스트 기반 이며 다른 표준 절차 ISO 22196:2007 규격에 따라.
Abstract
향상 된 특성을 가진 첨단된 신소재의 개발 다양 한 생명 공학 응용 프로그램에서에서 점점 더 중요 해지고 있다. 따라서, 많은 새로운 생체 모방 제어 약물 전달 및 조직 공학 등 생물 의학 응용 프로그램에 필요한 특정 환경에 설계 되는 합니다. 셀 이나 효소의 동원 정지에 대 한 향상 된 특성을 가진 재료의 개발 bioprocess 공학에서 현재 연구 주제 이기도합니다. 그러나, 이러한 응용 프로그램에 있는 물자의 가장 바람직한 속성 중 어떤 바람직하지 않은 감염을 피하기 위해 항균 능력입니다. 이 위해, 우리 제시 소재 표면 (연락처에 항균 성 활동을 측정 하기 위해 ISO 22196:2007 규범 (ii) (i) 한 디스크 확산 시험 (확산 방법)에 따라 재료의 항균 특성에 대 한 따라 하기 쉬운 프로토콜 방법)입니다. 이 프로토콜은 그람 양성 및 그람 음성 박테리아와 효 모 미생물의 광범위 한 커버를 사용 하 여 수행 되어야 합니다. 예를 들어, 황색 포도상구균, 대장균, 칸디 다 albicans에 대 한이 프로토콜을 따르고 다른 화학 성격으로 4 재료 테스트 합니다. 이 테스트의 결과 첫 번째 소재와 다른 3 재료에 대 한 그람 양성 및 그람 음성 세균에 대해 항균 활동 증가 대 한 비 항균 활동을 전시 한다. 그러나, 4 재료의 아무도 Candida albicans의 성장을 억제 수 있습니다.
Introduction
임 플 란 트 실패는 종종 항균 예방 및 무 균 작업 조건에도 불구 하 고 발생 하는 미생물 감염의 결과 이다. 이 문제는 매우 높은 의료 비용을 일으키는 이며 환자1가운데 비참 한. 황색 포도상구균 같은 박테리아는 현재 카 및 다른 의료 임 플 란 트와 관련 된 병원내 감염에 매우 위험한 병원 체 것 여겨진다 고 의료 기기2의 주요 오염 물질은 중요 합니다. 따라서, 소설 항균 전략의 개발 매일 및 의료 사용에 대 한 긴급 하 게 필요 합니다.
항균 성 대리인 등 항생제3, 비밀이 암모늄 화합물4, 금속 이온/산화물5, 항균 성 펩 티 드 (암페어)6. 항생제는 점차적으로 때문에 세균 저항7, 항생제 남용8때문에 비효율적 되고있다. 비밀이 암모늄 화합물 미생물 저항9때문에 단기 사용을 위한 매우 효율적인만 있습니다. 금속 이온/산화물 매우 효과적인 항균 대리인으로 이용 되었습니다 오래 고 붕대, 물 필터, 페인트, 등10,,1112를 포함 하 여 많은 일반적인 상용 제품에 사용 됩니다. 그러나, 그것은 이러한 유형의 화합물13포유류 세포 어떤 종류에 독성 수 입증 되었습니다.
앰프는 우수한 항균 및 immunomodulatory 속성14,15, 표시 그리고 박테리아16그들에 대 한 저항을 개발 하기 위해 매우 어려운 찾을 것 같다. 그러나, 순수 앰프를 생산 하는 과정은 비싼; 따라서, 대규모 생산은 실용적 이다. 따라서, 앰프 생산에 문제가 되었습니다 카운터 전략 개발 (예:작은 분자 항균 peptoid 모방17, peptoids18, α 펩 티 드19 , β 펩 티 드20). 메타 크 릴 산-엔드 polypeptides 및 polypeptoids 항균 및 antifouling 코팅21합성 되었습니다.
순수에서 첨단된 소재 등 새로운 항균 제의 개발 또는 하이브리드 형태, 방지 하 고 multidrug 저항 감염을 치료 수는 점점 더 필요 합니다. 광범위 한 조직과 bioprocess 공학 등 다양 한 생명 공학 분야에 대 한 새로운 고급 재료 개발 되었습니다 향상 된 화학 및 물리적 특성을 가진 마지막 십 년간에서 여러 가지 방법을 통해: 플라즈마 중 합에 접목 소수 성 기질22,,2324, 가교 밀도25,26의 조정, 솔루션27,,2829 중 합 , 30, porogen 해산31,32, 나노 소재 그래 핀 산화물 (이동)33,,3435,36 등의 여과 탄소 nanofibers (CNFs)37
이러한 새로운 물질의 항균 능력의 연구 기 하 급수적으로 그들의 잠재적인 생명 공학 적용을 증가할 수 있었다 그리고, 그러므로, 되고있다 필수. 우리는 이러한 새로운 고급 재료의 항균 활동을 계량 하는 따라 하기 쉬운 프로토콜을 제시. 여기, 샘플 준비 후 두 가지 보완 방법 뒤에: 첫 번째는 agar 디스크 확산 테스트38 (확산 방법)에 따라 이며 두 번째는에 항균 성 활동을 측정 하기 위해 ISO 22196:2007 정상39 소재 표면은 (접촉 방법)입니다.
Protocol
1. 샘플 준비
- 원통형 펀치 10mm 직경 10 mm 직경 디스크에 소재 샘플을 잘라.
참고: 취 성 재료 1 시간에 대 한 적합 한 살 균 용 매에 부드럽게 고 디스크를 잘라 될 수 있습니다. 예를 들어 아연 alginate 같은 친수성 재료가이 프로토콜에 따라 테스트 하 고 압력가 마로 소독 물에 습 하 게 했다 샘플 위반을 피하기 위하여 그들을 절단 하기 전에. 그러나, poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) 같은 다른 소수 성 물질 절단 제대로 하려면 이전 붓기의 어떤 종류를 필요 하지 않습니다. - 진공 오븐에서 60 ° C에서 샘플 소재 디스크 건조 (< 10-2 Torr) 24 h에 대 한.
참고: 일부 재료는 높은 건조 온도 할 수 있습니다. 그러나, 그것은 중요 자료를 저하 열 수 온도 도달 하지 않습니다. - 디지털 캘리퍼스와 소재 필름 두께 측정 합니다.
참고:이 프로토콜은 다른 물질의 항균 활동을 비교할 때 상수와 비슷한 두께와 소재 영화의 활용을 권장 합니다. - 10 분에 대 한 에탄올 70%와 각 면 당 1 시간에 후속 자외선 (UV) 방사선에 침수에 의해 각 견본을 소독.
참고: UV 방사선 수행할 수 있습니다 12.0 W 램프 UV C 방사선의 각 표본 층 류 두건 내부 살 균 페 트리 접시에 배치.
주의: 연구원 노출 하면 안 스스로 UV 방사선 때문에 돌연변이. - 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 단계를 수행 합니다. 와 제어 소재 디스크.
참고: 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물) 또는 대체 비 항균 물질 제어 디스크 확산 및 접촉 방법으로 사용 될 수 있습니다. 또한, 나노 복합 재료 또는 치료 재료 특성화 때 제어 자료로 기본 재료를 사용 해야 합니다.
2. 권장된 미생물
참고: 우리는 다양 한 미생물에 대 한 시험된 물질의 항균 능력을 공부 하는 3 다른 미생물의 사용을 권장.
- 3 미생물의 순수 문화를 사용 하 여: 그람 양성 박테리아 포도 상 구 균, 대장균, 그람 음성 박테리아와 효 모 Candida albicans.
참고: 다른 미생물 종도 테스트할 수 있습니다이 프로토콜 부 화 조건이 필요한 경우 수정 하 여.
주의: 필요한 biosafety 측정이이 프로토콜에는 미생물의 종류에 따라 다음 합니다. - 미리 살 균 또는 압력가 소재와 작업과를 사용 하 여 분 젠 버너 미생물 조작 또는 생물 안전 캐비닛의 전체 과정 (필요한 경우) 무 균 조건을 보장 합니다.
참고: 권장된 고압 조건 작업 소재 및 생물 학적 잔류물 20 분 동안 문화 매체와 121 ° C 15 분 동안 121 ° C는.
3. 한 디스크 확산 시험 (확산 방법)
참고: 항균 성 화합물의 액체 확산, 신소재의 주요 항균 메커니즘을 수도 보급 방법 이러한 물질의 항균 능력에 대 한 매우 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 한 천 격판덮개의 센터에 있는 소재 디스크 미생물의 성장 억제 발생 후 24 h 문화의 투명 한 링 영역 (후광)을 형성할 수 있다 ( 그림 1참조).
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확산 테스트 절차
- 준비 및 고압 tryptic 간장 agar (TSA) 제조업체의 지침에 따라.
- 분 젠 버너 또는 층 흐름 후드를 사용 하 여 무 균 조건 하에서 무 균 페 트리 디쉬에 TSA를 부 어.
참고: TSA 격판덮개는 4-6 m m 두께 여야 합니다. - Aerobically 37 ° c.에 인큐베이터에 TSA와 페 트리 접시에서 18-24 h에 대 한 테스트를 다른 미생물 문화
- 준비와 압력솥 tryptic 간장 국물 (TSB) 제조업체의 지침에 따라.
- 분 젠 버너 또는 층 흐름 후드를 사용 하 여 무 균 조건 하에서 미리 살 균된 혈 청 학적인 피 펫 50 mL 미리 멸 균된 원심 분리기 튜브에는 TSB를 붓는 다.
- Resuspend 멸 균 면봉과 소용돌이 사용 하 여 메 마른 분리기 관에 포함 된 TSB의 단계 3.1.3에서 25 mL에서 몇 식민지 균일 한 혼합을 달성 하기 위해 1 분에 대 한 그들.
- 흡 광도 조정 (540에서 nm)의 mL 당 단위 (CFU)를 형성 하는 식민지의 적당 일 분 광 광도 계와 문화: 약 1.5 x 108 CFU/mL 박테리아 및 1 x 106 5 x 106 CFU/mL 효 모에 대 한.
참고: 문화와 베트 볼륨에서 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계 활용의 종류에 따라 선택 되어야 합니다. - 소용돌이 미생물 분산을 개선 하 고 짧게 살 균 면 잠수함을 5 초 동안 미생물 국물이 미생물 현 탁 액에 면봉. 문화를 포함 하는 관 벽에 눌러 면봉에서 액체의 과잉을 제거 합니다.
- 균등 하 게 미생물으로 그들의 전체 표면을 커버 하는 접종 후 5 분 동안 말리 3 비행기에서 TSA 격판덮개의 표면에 멸 균 면봉으로 미생물 국물 정지 행진.
참고: 모든 습기를 제거 하려면 TSA 격판덮개 배치 되어야 합니다 열기는 접종 하기 전에 10-15 분 동안 37 ° C에서 거꾸로 위치에. - 96% 에탄올과 비 커에서 그들을 immersing 및 다음 분 젠 버너 또는 알코올 버너와 함께 그들을 불타는 핀셋 한 켤레를 소독.
- 테스트 하 고 멸 균 핀셋의 쌍을 사용 하 여 TSA 격판덮개의 센터에서 디스크 제어 샘플 디스크를 놓습니다.
- Aerobically 24 h에 대 한 37 ° C에서 거꾸로 위치에 TSA 격판덮개를 품 어.
참고: 모든 오염 위험을 피하려면, 그것 것이 좋습니다 거꾸로 위치에 TSA 격판덮개를 품 어. 그러나, 샘플 디스크 TSA 격판덮개에서 분리를 하는 경우 수행 하지 않습니다이 단계를 거꾸로 위치에. 이 경우에, 층 류 두건에 접시를 건조 하는 것이 좋습니다. 이 항균 성 테스트를 적어도 quadriplicate에 재현성을 보장 하기 위해 다른 일에 수행 되어야 합니다.
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미생물 현 탁 액 농도 및 순도 확인
참고: 다음 단계는 미생물 농도 단계 3.1.7에서에서 분 광 광도 계 결정 올바른지 확인 하 고 미생물 환경 오염 없이 있었다는 것을 확인 하기 위해 필요 합니다. 미생물 환경 오염 문화 24 h 후 미생물 식민지의 다양 한 종류의 모양으로 쉽게 검색할 수 있습니다. 또한, 소수 직렬 희석에는 조작 하는 동안 TSB 매체의 미생물 오염 없이 부정적인 TSB 컨트롤 플레이트 보장 되어야 합니다.- 무 균 조건에 적합 한 압력가 팁는 micropipette를 사용 하 여 살 균 microcentrifuge 튜브 (3.1.4 단계에서 준비) 살 균 TSB 분배. 그들 중 하나는 부정적인 TSB 제어로 활용 될 것입니다.
- TSB를 포함 하는 메 마른 microcentrifuge 튜브에 3.1.9 단계에서 활용 하는 미생물 국물 중단 소수 직렬 희석을 수행 합니다.
- 미리 멸 균된 Drigalski 주걱 또는 다른 악기를 사용 하 여 TSA 격판덮개에 각 희석의 100 µ L를 확산. 또한 부정적인 TSB 제어 접시로 TSA 격판덮개에 (단계 3.2.1에서에서 준비) 미생물 없이 100 μ TSB 매체의 확산.
- Aerobically aerobically 24 h에 대 한 37 ° C에서 TSA 격판덮개를 품 어.
- CFU/mL 유사 단계 3.1.7에서에서 결정 되는지 확인 하는 식민지의 수를 계산 합니다.
- 식민지의 한 유형 가진 TSA 격판덮개에 미생물 환경 오염 없이 확인 합니다.
- 아니 식민지를 보여주는 TSB 부정적인 제어 접시에 미생물 오염 없이 확인
4. 소재 표면 (접촉 방법)에 항균 성 활동의 측정
참고: 표면 접촉, 일부 고급 재료의 주요 항균 메커니즘을 있을 때 접촉 방법 이러한 물질의 항균 능력에 대 한 매우 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 방법에서는, 미생물 소재 표면에 직접 배치 하 고 그들의 성장 억제 시간이 일정 금액 후 결정 될 수 있다.
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초기 절차
- 준비 및 고압 TSB 제조업체의 지침에 따라.
- 분 젠 버너 또는 층 흐름 후드를 사용 하 여 무 균 조건 하에서 미리 살 균된 혈 청 학적인 피 펫 50 mL 미리 멸 균된 원심 분리기 튜브에는 TSB를 붓는 다.
- 문화 aerobically 테스트할 다른 미생물 37 ° c.에서 궤도 셰이 커 (140 rpm)에서 TSB와 튜브에서 하룻밤
- 대략 10의 농도를 50 mL 미리 멸 균된 원심 분리기 튜브에 TSB의 20 mL에서 하룻밤 문화를 희석6 CFU/mL (540에서 분 광 광도 계 결정 nm).
참고: 문화와 베트 볼륨에서 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계 활용의 종류에 따라 선택 되어야 합니다. - TSB를 포함 하는 메 마른 microcentrifuge 튜브에 소수 직렬 희석이 문화를 수행 합니다. 100 µ L TSA 격판덮개에 문화의 확산과 aerobically 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
- 약 1 x 106 CFU/mL의 초기 세포 농도 위해 식민지의 수를 계산
- 장소 4 24 시간 및 각 유형의 미생물 계산 후에 24 h 분리 무 균 48-잘 접시의 우물에 대 한 시험된 자료의 4 샘플 디스크 후 미생물 계산에 대 한 디스크를 제어 합니다.
- 각 디스크 표면에 미생물 현 탁 액의 150 µ L 플라스틱
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미생물 제어 및 시험된 자료 (24 시간) 후 세
- 4.1.6 단계 후 aerobically 24 h에 대 한 37 ° C에서 48-잘 접시에 남아 있는 4 샘플 디스크를 품 어.
참고:이 24 시간 보육 시간 짧은 또는 긴 시간에서 성장 억제를 공부 하기 위해 수정할 수 있습니다. - 외피의 24 시간 후 4 샘플 디스크의 표면에 살 균 PBS의 850 µ L 플라스틱와 미생물 현 탁 액의 150 µ L와 함께 섞는다.
- 48-잘 접시에서 PBS/미생물 현 탁 액 혼합물 및 각 디스크를 수집 하 고 10 mL 중 소독된 튜브에 그들을 전송.
- 소용돌이 PBS/미생물 현 탁 액 혼합 하 고 1 분 동안 각 디스크 sonicate 그것 50 Hz에서 5 분와 아무 가능한 미생물 유지 되도록 1 분 동안 다시 그것은 소재 표면에 고착 하는 소용돌이.
- TSB를 포함 하는 메 마른 microcentrifuge 튜브에서 sonicated 각 문화의 소수 직렬 희석을 수행 하 고 100 µ L TSA 격판덮개에 문화의 확산 aerobically 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
- 각 샘플 및 제어 디스크 표면에 가능한 미생물의 수는 식민지의 수를 계산 합니다. 표현 가능한 셀 (CFU/mL)에서이 수 한다.
- 샘플 및 제어 디스크에 대 한 최종 미생물 문화의 사진을 가져가 라.
- 4.1.6 단계 후 aerobically 24 h에 대 한 37 ° C에서 48-잘 접시에 남아 있는 4 샘플 디스크를 품 어.
5. 항균 결과 분석
그림 1: "헤일로" 항균의 정규화 된 너비에 대 한 측정. 이 패널에는 억제 영역 (d오늘)의 직경 디스크 직경 (d) 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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확산 방법 결과 분석
- 금지 영역 (d오늘)의 지름과 디스크 직경 (d)를 측정 ( 그림 1참조) 디지털 캘리퍼스.
참고: 금지 영역 또는 항균 "헤일로" 항균 소재 디스크에 의해 생성 하는 미생물 성장 억제의 결과로 형성 된다 ( 그림 1참조). 미생물 제대로 성장해 왔습니다 접시의 나머지 부분에 비해 샘플에 가까운 투명 한 링 영역 관찰 수 (불투명 영역). - 방정식 (1)을 적용 하 여 항균 각 디스크의 "후광" (nw헤일로)의 정규화 된 너비를 결정 합니다.
(1)
- 평균 및 표준 편차 각 샘플의 항균 성 "헤일로" 4 결정 nw헤일로 값의 정규화 된 너비를 결정 합니다.
- 소재 디스크와 최종 미생물 문화의 사진을 가져가 라.
참고: 금지 영역 (d오늘)의 지름과 디스크 직경 (d)도 측정할 수 있습니다 적합 한 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 단계 5.1.4에서에서 찍은 사진에서.
- 금지 영역 (d오늘)의 지름과 디스크 직경 (d)를 측정 ( 그림 1참조) 디지털 캘리퍼스.
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접촉 방법 결과 분석
- 방정식 (2)에 따라 복구 가능한 미생물의 수를 결정 합니다.
(2)
참고: 여기에서, N 은 cm2 테스트 견본; 당 당 복구 가능한 미생물의 수 C 는 격판덮개 조사; D 는 희석 요인; Cm2 샘플 디스크 직경 결정에서 테스트 대상의 표면 영역입니다 . - 방정식 (3)을 적용 하 여 세포 성장 저해를 반영 하기 위해 생존 (LV)의 손실을 결정 합니다.
(3)
참고: 여기, C는 가능한 미생물 (N)의 평균 수 CFU/mL•cm2, 제어 표본에서 발견 한 후 24 h; S는 CFU/mL•cm2, 24 h 후 테스트 표본에서 발견 가능한 미생물 (N)의 수입니다. - 평균 및 생존 능력의 손실 각 샘플의 4 결정 LV(%) 값의 표준 편차를 확인 합니다.
- 방정식 (2)에 따라 복구 가능한 미생물의 수를 결정 합니다.
Representative Results
이 프로토콜은 고용 했다, 예를 들어, 3에 대 한 다른 화학 성격을 가진 4 물자의 항균 능력을 테스트 권장 미생물: 황색 포도상구균, 대장균, 칸디 다 albicans . 컨트롤 디스크 (C, 이미지 표시 되지 않음)에서 발생 한 디스크 확산 테스트 (확산 방법)의 결과 첫 번째 자료 (M1)에 대 한 비 항균 활동 전시 및 그람 양성 및 그람 음성에 대 한 항균 활동 증가 박테리아는 다른 3 재료 M2, M3 및 m 4는 ( 그림 2참조).
그림 2: 항균 확산 방법 결과. 이 패널 외피의 24 시간 후 4 소재 (M1, M2, M3 및 m 4) 디스크 (두께 1 m m x 10 m m 직경) S. 균 및 대장균 에 대 한 항균 성 확산 메서드를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 항균 "헤일로" (nw헤일로) 자료에 대 한 다른 예제에서는 M1, M2, M3, m 4 그람 양성 및 그람 음성 세균에 대 한 방정식 (1) 계산의 다른 표준화 된 폭을 보여준다. 그러나, 4 재료의 아무도 효 모 Candida albicans (이미지 표시 되지 않음)의 성장을 억제 수 있었다.
그림 3: 결과 항균 확산 "헤일로". 이 패널 외피의 24 h 후 각 소재 (M1, M2, M3 및 m 4) 디스크 (두께 1 m m x 10 m m 직경) S. 균 및 대장균 에 대 한 정규화 된 "헤일로" (nw헤일로)을 보여줍니다. 차이 통계적으로 유의 한 (p < 0.01). 그러나, 샘플 M1 항균 활동이 전시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
접촉 방법의 결과 또한 첫 번째 자료 (M1)에 대 한 비 항균 활동 전시 컨트롤 디스크 (C)와 Grampositive와 다른 3 자료 (참조에 대 한 그람 음성 세균에 대 한 증가 항균 활동에서 발생 그림 4)입니다.
그림 4: 항균 메서드 결과 문의. 이 패널은 S. 구 균 및 대장균 (10-4의 희석 요인)에 대 한 보육의 24 시간 후 4 소재 (M1, M2, M3 및 m 4) 표면 항균 활동 분석 결과의 ISO 22196:2007에 따라 각각 90 m m 접시를 보여줍니다. C 는 외피의 24 h 후 제어 디스크에서 복구 가능한 박테리아 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 프로토콜에 표시 된 대로 손실 가능성 (%)의 방정식 (2)와 (3)에 의해 결정 되었다 ( 그림 5참조).
그림 5: 접촉 방법에 의해 생존의 손실. 이 패널 소재 표면에 M1, M2, M3, 및 S. 구 균 및 대장균 에 대 한 m 4에 대 한 가능성 (%)의 감소를 보여줍니다. 샘플 M1 항균 활동이 전시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그러나, 4 재료의 접촉 방법에 의해 효 모 칸디 다 albicans 의 성장을 중 (이미지 표시 되지 않음)을 억제 수 있었다. 따라서, 이러한 4 신소재 3 긍정적인 항균 결과 그람 양성 및 그람 음성 세균에 대 한 그리고 따라서 매우 높은 항균 활동이 요구 많은 공학 응용 프로그램에 대 한 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 4 재료의 아무도 효 모 성장을 억제 수 있었다.
Discussion
새로운 고급 재료의 항균 활동 2 보완 절차 2 기존 방법에 따라 구성 된이 따라 하기 쉬운 프로토콜에 의해 분석 될 수 있다: 한 디스크 확산 테스트38 및 항균 활성 측정 ISO 22196:2007 정상39에 따라 소재 표면.
이 연구 분야에서 많은 문학에서 보고 된 항균 테스트 되 높은 분석 결과 따라 다릅니다. 따라서, 그것은 매우 상세한 중요 하 고 일관 된 실험실에서 장소에 프로토콜. 이 기사는 그 방향으로 단계 이다. 또한, 그것은이 분야에서 경험이 부족 하 고 정확한 깊이, 단계별 절차에 따라 요구 하는 많은 연구자에 대 한 매우 유용한 수 있습니다.
이 프로토콜은 10-m m 직경의 디스크 모양으로 잘라 재료의 많은 유형에 사용할 수 있습니다. 취 성 재료 절단 과정을 쉽게 렌더링 하 1 시간을 위한 적당 한 용 매에서 불 수 있다. 따라서, alginates 같은 친수성 물질 압력가 증류수에 하이드레이션 수 있습니다. 에탄올, 케 톤, 등 dichloromethane, 다른 용 매는 그들을 절단 하기 전에 1 시간에 대 한 소수 성 자료를 사용할 수 있습니다. 그러나, poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) 같은 일부 물질 부 될 필요가 없습니다 하 고 그들은 직접 잘라 수 있습니다. 그 후, 샘플 소재 디스크 진공 오븐에서 건조 하 고 오염 위험을 피하기 위해 에탄올과 자외선에 1 시간에 대 한 각 표본 소독 매우 중요 하다.
이 프로토콜 권장 TSA TSB 문화 미디어와 광범위 한 미생물에 도달 3 미생물의 순수 문화를 사용 하 여: 그람 양성 박테리아 포도 상 구 균, 대장균, 그람 음성 세균 그리고 효 모 Candida albicans. 그러나, 대안 문화 미디어와 다른 외피 조건 필요로 다른 미생물도 사용 될 수이 프로토콜. 때때로, 단 1 미생물 새로운 소재의 항균 성 활동의 초기 아이디어를가지고 테스트 됩니다.
보여주는 권장된 3에 대 한 강한 항균 성 활동 다른 미생물의 종류 또한 메 티 실린 내성 포도 상 구 균 epidermidis (MRSE) 같은 항생제 내성 병원 균에 대 한 테스트 해야 하는 재료는 이 프로토콜 성공적으로 이용 되어 있다. 많은 우려를 원인이 되는 다른 중요 한 약물 내성 미생물은 그람 양성 methicillin-내성 황색 포도상구균 (MRSA)과 vancomycin 내성 Enterococci (VRE), 그람 음성 녹 농 균40,41.
Biofilm 억제와 다른 유형의 바이러스, 기생충 등 미생물에 대 한 재료의 항균 활성이이 프로토콜을 테스트할 수 없습니다. 그러나,이 프로토콜 제공 합니다 매우 유용한 출발점을의 새로운 항균 성 연구에 대 한 고급 소재.
항균 agar 디스크 확산 테스트에서 중요 한 단계는 샘플 디스크 일부 자료 접어 최대한 빨리 그들은 한 천 매체 연락 때문에 접시의 중앙에 배치 될 때 발생 합니다. 이 경우에, 신중 하 게 샘플을 펼쳐 핀셋의 멸 균 쌍을 사용 하는 것이 좋습니다. 다른 한편으로, 접촉 방법, 컨트롤을 세척 하는 것이 중요에 샘플 디스크 아주 잘 PBS에 pipetting 4 번 다음 활기찬 vortexing 쥡니다 아무 가능한 미생물을 위해 그들에 의해 남아 자료를 준수 표면입니다.
이 비디오 프로토콜 bioprocess 공학, 조직 공학, 제어 약물 전달, 포장 재료, 폐수 처리, 농업, 바이오와 함께 사용 하는 등 많은 공학 응용 프로그램에서 활용할 수 있는 매우 바람직한 항균 능력입니다.
이 프로토콜으로 얻은 결과 질적 (이미지) 및 정량 (항균 "헤일로" 및 생존 능력의 손실의 정규화 폭)의 재현성 (평균 ± 표준 편차)의 좋은 분석. 일방통행 ANOVA, 터키의 임시 게시물 분석, 그들은, 통계적으로, 크게 공부 하기 위하여 뒤에 의해 보급 및 접촉 방법 결과 분석으로 얻은이 평균값을 분석 해야 비교할 때 다른 재료, 다른 (p < 0.01).
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 2017-231-001UCV를 통해이 작품에 대 한 재정 지원에 대 한 대학 Católica 드 발렌시아 산 비센테 Mártir를 인정 하 고 싶습니다 고 2018-231-001UCV 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylindrical punch | 10 mm diameter | ||
| Petri dishes | soria genlab | P101 | 90 mm diameter, sterile |
| Tryptic soy agar (TSA) | Liofilchem | 610052 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
| Tryptic soy broth (TSB) | Liofilchem | 610053 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
| Sterile cotton swab | EUTOTUBO | 300200 | |
| Centrifuge tubes | VIDRA FOC, SA | 429900 | 50 mL, sterile |
| Ethanol | VWR | 83813360 | Absolute ethanol |
| Sterile 48-wells plate | COSTAR | 3548 | Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene |
| A pair of tweezers | BRAUN | 24612036 | Toothless |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS). | VWR | E404-100TAPBS | |
| Vaccum oven with a connected vacuum pump | JP Selecta, SA | 5900620 | |
| Laminar flow hood | TELSTAR Technologies, SL | TELSTAR AH-100 | 12.0 W lamp of UV-C radiation |
| Class II Biological safety cabinet | LABOGENE | MARS 1200 | |
| Incubator | ASTEC CO, LTD | SCA-165DR | |
| Vortex mixer | Biosan | V-1 Plus | |
| Spectrophotometer | Macherey-Nagel, Germany | Nanocolor UV/VIS II | |
| Bunsen burner | JP Selecta, SA | 7001539 | |
| Alcohol burner | VIDRA FOC, SA | 1658/20 | In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet |
| Orbital shaker | sartorius stedim | 8864845 | |
| Sonicator | SELECTA | 3000617 | 50/60 Hz |
| Digital calliper | ACHA | 17-260 | 0-150 mm |
| Serological pipette | Fisherbrand | 13-678-11 | 25 mL, sterile |
| Serological pipette | VWR | 612-4950 | 5 mL, sterile |
| Serological pipette | VWR | 612-5541 | 10 mL, sterile |
| Micropipette | GILSON | FA10005P | Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL |
| Micropipette | GILSON | F123602 | Pipetman P1000, 200-1000 µL |
| Micropipette | GILSON | FA10016 | Pipetman L P12X300L, 20-300 µL |
| Micropipette tips | LABBOX | TIBP-200-960 | 2-200 µL |
| Micropipette tips | LABBOX | TIBP-1K0-480 | 100-1000 µL |
| Pre-sterilized tube | INSULAB | 301402 | 10 mL |
| Photo camera | Canon EOS 5D | Any camera with high resolution can also be utilized | |
| Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus | strain V329 | Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9), 2888–2896 (2001) | |
| Gram-negative bacteria Escherichia coli | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 101 | |
| Yeast Candida albicans | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 1394 | |
| Microcentrifuge tubes | DASLAB | 175508 | 1,5 mL |
| Autoclave | JP Selecta, SA | 4002136 | |
| Spectrophotometer-cuvettes | UVAT Bio CB | F-0902-02 | 4,5 mL |
| Drigalski spatula | LABBOX | SPRP-L05-1K0 | Sterile, disposable |
| glass balls (2 mm diameter) | Hecht Karl | 1401/2 | Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula |
| Autoclave bags | DELTALAB | 200318 | To sterilize microbiological residues or contaminated material |
| Electronic pipette filling device | JetPip | JET BIOFIL | |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-100-010 | 100 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-250-010 | 250 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-500-010 | 500 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-1K0-010 | 1000 mL, for autoclaving culture media |
| Latex gloves | DENIA | 2278000000 | |
| Indicator tape for sterilization | LABBOX | STAP-A55-001 | Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process. |
| Universal test tube rack | LABBOX | MTSP-001-001 | To hold centrifuge tubes |
| Microcentrifuge tube rack | VWR | 211-0210 | To hold microcentrifuge tubes |
| Sterile loop | ACEFE S.A. | 100140055 | 10 µL of capacity for microbial culture |
| Material M1 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 1 | |
| Material M2 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 2 | |
| Material M3 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type3 | |
| Material M4 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 4 | |
| Material C | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Control material |
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