Summary
Presentamos un protocolo para la caracterización antimicrobiana de materiales avanzados. Aquí, la actividad antimicrobiana en superficies de material se mide mediante dos métodos que se complementan: uno se basa en la prueba de difusión de discos de agar, y el otro es un procedimiento estándar basado en la norma ISO de 22196:2007.
Abstract
El desarrollo de nuevos materiales avanzados con propiedades mejoradas se está convirtiendo en cada vez más importante en una amplia gama de aplicaciones de la bioingeniería. Así, muchos biomateriales novedosos se están diseñando para simular entornos específicos para aplicaciones biomédicas tales como ingeniería de tejidos y el suministro de medicamentos controlados. El desarrollo de materiales con propiedades mejoradas para la inmovilización de células o enzimas también es un tema actual de investigación en ingeniería de bioprocesos. Sin embargo, una de las propiedades más deseables de un material en estas aplicaciones es la capacidad antimicrobiana para evitar cualquier infección indeseables. Para esto, presentamos, fácil de seguir los protocolos para la caracterización antimicrobiana de materiales basados en (i) la prueba de difusión de discos de agar (método de difusión) y (ii) la norma ISO 22196:2007 para medir la actividad antimicrobiana en superficies (contacto método). Este protocolo debe realizarse utilizando bacterias Gram-positivas y gram negativas y levaduras para cubrir una amplia gama de microorganismos. Por ejemplo, 4 materiales con diferentes naturalezas químicas son probados siguiendo este Protocolo contra Staphylococcus aureus, Escherichia coliy Candida albicans. Los resultados de estas pruebas exhiben actividad antimicrobiana no para el primer material y aumentar la actividad antibacteriana contra bacterias Gram positivas y gram-negativas para los otros 3 materiales. Sin embargo, ninguno de los 4 materiales son capaces de inhibir el crecimiento de Candida albicans.
Introduction
Fracaso del implante es a menudo una consecuencia de las infecciones microbianas que se producen a pesar de la profilaxis antimicrobiana y las condiciones de trabajo aséptico. Este problema está causando costos médicos muy altos y es penoso entre pacientes1. Importante de bacterias como Staphylococcus aureus , actualmente se consideran muy peligrosos patógenos en infecciones nosocomiales asociadas a catéteres y otros implantes médicos y son los principales contaminantes de instrumentos médicos2. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias antimicrobianas es urgente para uso cotidiano y médico.
Agentes antimicrobianos incluyen antibióticos3, compuestos de amonio cuaternario4, óxidos de iones metal5y péptidos antimicrobianos (AMPs)6. Antibióticos poco a poco son cada vez menos eficientes debido a la resistencia bacteriana7, que va en aumento debido al uso excesivo de antibióticos8. Compuestos de amonio cuaternario sólo son muy eficientes para un uso a corto plazo debido a la resistencia microbiana9. Óxidos de iones metal durante mucho tiempo se han utilizado como agentes antimicrobianos muy eficaces y se utilizan en muchos productos comerciales comunes, incluyendo vendas, filtros de agua, pinturas, etc.10,11,12. Sin embargo, se ha demostrado que estos tipos de compuestos pueden ser tóxicos para algunos tipos de células de mamíferos13.
Amperios muestran excelente antimicrobiano e inmunomoduladores propiedades14,15, y las bacterias parecen que resulta muy difícil desarrollar una resistencia contra ellos16. Sin embargo, el proceso para producir puros amperios es caro; por lo tanto, una producción a gran escala no es viable. Por lo tanto, estrategias para contrarrestar los problemas en la producción de amplificadores han sido desarrollan (por ejemplo, peptoid antibacteriano molecular pequeño imita17, peptoides18, péptidos α19 y péptidos β20). Polypeptoids y metacrilato de-terminado de polipéptidos han sido sintetizados para antimicrobianos y antifouling recubrimientos21.
El desarrollo de nuevos antimicrobianos como materiales avanzados en puro o forma híbrida, capaz de prevenir y tratar las infecciones multirresistentes, es cada vez más necesario. Una amplia gama de nuevos materiales avanzados para muchos campos de la bioingeniería como ingeniería de bioprocesos y tejidos se han desarrollado con propiedades químicas y físicas mejoradas en las últimas décadas a través de varios métodos: polimerización plasma injerto en un sustrato hidrofóbico22,23,24, sastrería de reticulación densidad25,26, polimerización en solución27,28,29 , 30, porogen disolución31,32y la incorporación de nanomateriales como grafeno óxido (ir)33,34,35,36 y carbono de nanofibras (CNFs)37.
El estudio de la capacidad antimicrobiana de estos nuevos materiales podría aumentar exponencialmente su potencial aplicabilidad de bioingeniería y, por lo tanto, es esencial. Presentamos un protocolo fácil de seguir para cuantificar la actividad antimicrobiana de estos nuevos materiales avanzados. Aquí, después de la preparación de la muestra, se siguen dos métodos complementarios: el primero se basa en el agar disco difusión prueba38 (método de difusión) y la segunda se basa en la ISO 22196:2007 norma39 para medir la actividad antimicrobiana en superficies (método de contacto).
Protocol
1. preparación de la muestra
- Cortar las muestras de material en discos de diámetro de 10 mm con un diámetro de 10 mm perforación cilíndrica.
Nota: Materiales frágiles pueden ser ablandados en solventes adecuados estériles durante 1 hora y luego cortar en discos. Por ejemplo, materiales hidrofílicos como alginato de zinc fueron probados siguiendo este protocolo y fueron humedecidos en agua esterilizada antes de cortar para evitar la rotura de la muestra. Sin embargo, otros materiales hidrófobos, como poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) no es necesario ningún tipo de hinchazón anterior para cortar correctamente. - Los discos de material muestra a 60 ° C en una estufa de vacío en seco (< 10-2 Torr) durante 24 h.
Nota: Algunos materiales pueden necesitar una temperatura alta de secado. Sin embargo, es importante no llegar a una temperatura que podría degradar térmicamente el material. - Medir los espesores de película de material con un calibrador digital.
Nota: Este protocolo recomienda la utilización de películas materiales con espesores constantes y similares cuando se comparó la actividad antimicrobiana de diferentes materiales. - Esterilizar a cada muestra por inmersión en etanol 70% durante 10 minutos y posterior radiación ultravioleta (UV) durante 1 hora por cada lado.
Nota: La radiación UV puede realizarse colocando a cada muestra en una placa Petri estéril dentro de una campana de flujo laminar con una lámpara W 12.0 de radiación UV-C.
PRECAUCIÓN: Los investigadores deben no exponerse a la radiación UV, porque es mutagénico. - Realice los pasos 1.1, 1.2, 1.3 y 1.4. con los discos de material de control.
Nota: Polietileno tereftalato (PET) o materiales alternativos no antimicrobiano podrían utilizarse como discos de control en el método de difusión y contacto. Además, al caracterizar nanocompuestos o materiales tratados, el material base puede usarse como material de control.
2. recomendadas microorganismos
Nota: Se recomienda el uso de 3 diferentes microorganismos para estudiar la capacidad antimicrobiana del material probado contra una amplia gama de microorganismos.
- Uso de cultivos puros de 3 microorganismos: las bacterias Gram-positivas Staphylococcus aureus, bacteria gram negativa Escherichia coliy la levadura Candida albicans.
Nota: Otras especies de microorganismos se pueden también probar con este protocolo mediante la modificación de las condiciones de incubación, si es necesario.
PRECAUCIÓN: Deben seguirse las medidas de bioseguridad necesarias según el tipo de microorganismos empleados en el presente Protocolo. - Trabajar con el material previamente estéril o en autoclave y use un mechero de Bunsen durante todo el proceso de la manipulación microbiana o un gabinete de seguridad biológica (si es necesario) para asegurar condiciones de asepsia.
Nota: Condiciones de autoclave recomendado son 121 ° C durante 15 minutos para medios de cultivo y 121 ° C durante 20 min para el material de trabajo y residuos biológicos.
3. agar prueba de difusión de disco (método de difusión)
Nota: Cuando una líquido difusión de compuestos antimicrobianos podría ser el principal mecanismo antimicrobiano de los materiales avanzados, el método de difusión puede proporcionar información muy útil sobre la capacidad antimicrobiana de estos materiales. El disco de material ubicado en el centro de la placa de agar puede formar una zona transparente anillo (halo) donde se produce una inhibición del crecimiento de los microorganismos después de 24 h de cultivo (ver figura 1).
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Procedimiento de la prueba de difusión
- Preparar y autoclave peptona soya agar (TSA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Vierta la TSA en placas de Petri estériles en condiciones asépticas utilizando un mechero Bunsen o una campana de flujo laminar.
Nota: Las placas TSA deben ser 4 – 6 mm de espesor. - Cultura de los diferentes microorganismos prueba aeróbica de 18 – 24 h en las cajas Petri con TSA en una incubadora a 37 ° C.
- Preparar y caldo de soja tríptica de autoclave (TSB) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Vierta el TSB en un tubo de centrífuga previamente esterilizadas de 50 mL con una pipeta serológica previamente esterilizada bajo condiciones asépticas utilizando un mechero Bunsen o una campana de flujo laminar.
- Vuelva a suspender unas cuantas colonias de paso 3.1.3 en 25 mL de TSB contenida en un tubo de centrífuga estéril utilizando un hisopo de algodón estéril y agitar por 1 minuto lograr una mezcla uniforme.
- Ajustar la absorbancia (a 540 nm) de la cultura con un espectrofotómetro para el número adecuado de colonias formando unidades (UFC) por mL: aproximadamente 1.5 x 108 UFC/mL para las bacterias y de 1 x 106 a 5 x 106 UFC/mL de levaduras.
Nota: Los volúmenes cultura y cubeta para medir la absorbancia deben seleccionarse según el tipo de espectrofotómetro utilizado. - Vórtice el caldo microbiano durante 5 segundos para mejorar la dispersión del microorganismo y brevemente sumerja un hisopo de algodón estéril en la suspensión microbiana. Retirar el exceso de líquido de la torunda presionando contra la pared del tubo que contiene la cultura.
- Uniformemente la raya la suspensión de caldo microbiano con la torunda de algodón estéril sobre la superficie de las placas TSA en 3 planos para cubrir su superficie con el microorganismo y déjelo secar durante 5 minutos después de la inoculación.
Nota: Para quitar cualquier humedad, las placas TSA deben colocarse abiertas en una posición invertida a 37 ° C durante 10-15 min antes de la inoculación. - Esterilizar un par de pinzas por la inmersión de ellos en un vaso de precipitado con etanol 96% y luego les llamas con un quemador de alcohol o mechero Bunsen.
- Coloque los discos de muestra para prueba y control de disco en el centro de las placas TSA con el par de pinzas estériles.
- Incubar aeróbicamente las placas TSA en una posición invertida a 37 ° C durante 24 h.
Nota: Para evitar cualquier riesgo de contaminación, se recomienda incubar las placas TSA en una posición invertida. Sin embargo, si el disco de la muestra se desprende de las placas TSA, no realice este paso en una posición invertida. En este caso, se recomienda secar las placas en la campana de flujo laminar. Este ensayo antimicrobiano debe realizarse por lo menos en quadriplicate en días diferentes para asegurar la reproducibilidad.
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Comprobación de la pureza y concentración de la suspensión microbiana
Nota: Los siguientes pasos son necesarios para comprobar que la concentración microbiana determinada con el espectrofotómetro en paso 3.1.7 es correcto y asegurarse de que no había ninguna contaminación microbiana ambiental. Una contaminación ambiental microbiana puede ser fácilmente detectada por la aparición de varios tipos de colonias microbianas después de 24 h de cultivo. Además, no hay contaminación microbiana del medio TSB durante su manipulación en las diluciones seriadas decimales debe garantizarse con una placa de control TSB negativa.- Dispensar el TSB estéril (preparado en el paso 3.1.4) en tubos de microcentrífuga estéril utilizando una micropipeta con puntas esterilizadas adecuados en condiciones asépticas. Uno de ellos será utilizado como un control negativo de la TSB.
- Realizar diluciones seriadas decimales con la suspensión del caldo microbiano utilizada en paso 3.1.9 en los tubos de microcentrífuga estéril con TSB.
- Extensión 100 μl de cada dilución en placas de TSA con una espátula de Drigalski preesterilizada o un instrumento alternativo. Extensión también 100 μL de medio TSB sin microorganismo (preparado en el paso 3.2.1) sobre una placa TSA como una placa de control TSB negativa.
- Incubar aeróbicamente las placas TSA aeróbicamente a 37 º C durante 24 h.
- Contar el número de colonias para verificar que las UFC/mL son similares a los que se determinó en el paso 3.1.7.
- Compruebe que no hay contaminación ambiental microbiana en las placas TSA con un único tipo de colonias.
- Compruebe que no hay ninguna contaminación microbiana de la placa de control negativo de TSB no mostrando colonias
4. medición de la actividad antimicrobiana de superficies (método de contacto)
Nota: Cuando la superficie de contacto puede ser el principal mecanismo antimicrobiano de algunos materiales avanzados, el método de contacto puede proporcionar información muy útil sobre la capacidad antimicrobiana de estos materiales. En este método, los microorganismos se colocan directamente sobre la superficie del material y su inhibición de crecimiento puede ser determinada después de una cierta cantidad de tiempo.
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Procedimiento inicial
- Preparar y autoclave TSB siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Vierta el TSB en un tubo de centrífuga previamente esterilizadas de 50 mL con una pipeta serológica previamente esterilizada bajo condiciones asépticas utilizando un mechero Bunsen o una campana de flujo laminar.
- Cultura los microorganismos diferentes a probarse aeróbicamente durante la noche en el tubo con TSB en un agitador orbital (140 rpm) a 37 ° C.
- Diluir la cultura durante la noche en 20 mL de TSB en un tubo de centrífuga previamente esterilizadas de 50 mL a una concentración de aproximadamente 106 UFC/mL (determinado con un espectrofotómetro a 540 nm).
Nota: Los volúmenes cultura y cubeta para medir la absorbancia deben seleccionarse según el tipo de espectrofotómetro utilizado. - Realizar diluciones decimales seriadas de esta cultura en tubos estériles de microcentrífuga con TSB. Extensión 100 μl del cultivo en placas de TSA e incubar aeróbicamente a 37 º C durante 24 h.
- Contar el número de colonias para asegurar una concentración celular inicial de aproximadamente 1 x 106 UFC/mL
- Colocar 4 discos de control para el recuento microbiano después de 24 h y 4 discos de muestra de cada tipo de los materiales probados para el recuento microbiano después de 24 h en separa pocillos de una placa de 48 pozos estéril.
- Pipetear 150 μL de la suspensión microbiana en cada superficie de disco.
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Microbiana con el control y prueba de materiales (después de 24 h)
- Después de paso 4.1.6, incubar aeróbicamente los 4 discos de muestra en la placa de la pozo 48 a 37 ° C durante 24 h.
Nota: Este tiempo de incubación de 24 h puede ser modificado para estudiar la inhibición del crecimiento en épocas de mayor o menos. - Después de 24 h de incubación, pipetear 850 μl de PBS estéril sobre la superficie de los 4 discos de muestra y se mezcla con 150 μL de la suspensión microbiana.
- Para obtener la mezcla de suspensión microbiana/PBS y cada disco de la placa de 48 pozos y transferirlos a un tubo de 10 mL previamente esterilizados.
- Vórtice la mezcla de suspensión microbiana/PBS y cada disco por 1 min, someter a ultrasonidos lo a 50 Hz por 5 min y agitar nuevamente durante 1 minuto asegurar que no hay microorganismos viables adherido a la superficie del material.
- Realizar diluciones seriadas decimales de cada cultura sonicación en tubos de microcentrífuga estéril conteniendo TSB y difundir 100 μl del cultivo en placas de TSA e incubar aeróbicamente a 37 º C durante 24 h.
- Contar el número de colonias, que son el número de microorganismos viables en cada superficie de disco de muestra y control. Expresar este número de células viables (UFC/ml).
- Tomar una fotografía de la cultura microbiana final para la muestra y control.
- Después de paso 4.1.6, incubar aeróbicamente los 4 discos de muestra en la placa de la pozo 48 a 37 ° C durante 24 h.
5. Análisis de resultados antimicrobianos
Figura 1: medidas para el ancho normalizado de los antimicrobianos "halo". Este panel muestra el diámetro de la zona de inhibición (diz) y el diámetro del disco (d). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Análisis de resultados método de difusión
- Medir el diámetro de la zona de inhibición (diz) y el diámetro del disco (d) (ver figura 1) con un calibrador digital.
Nota: La inhibición de la zona o antimicrobiano "halo" se forma como consecuencia de la inhibición de crecimiento microbiano producida por el disco material antimicrobiano (ver figura 1). Es posible observar que existe una zona transparente anillo cerca de la muestra en comparación con el resto de la placa donde los microorganismos han crecido adecuadamente (zona opaca). - Determinar el ancho normalizado de los antimicrobianos "halo" (nwhalo) de cada disco, aplicando la ecuación (1).
(1)
- Determinar la media y desviación estándar del ancho normalizado de los valores de nwhalo antimicrobiana "halo" con el 4 determinado de cada muestra.
- Tomar una fotografía de la cultura microbiana final con el disco de material.
Nota: El diámetro de la zona de inhibición (diz) y el diámetro del disco (d) se pueden también medir de la fotografía tomada en el paso 5.1.4 mediante el uso de un software de procesamiento de imágenes adecuado.
- Medir el diámetro de la zona de inhibición (diz) y el diámetro del disco (d) (ver figura 1) con un calibrador digital.
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Análisis de resultados del método de contacto
- Determinar el número de microorganismos viables recuperadas según la ecuación (2).
(2)
Nota: Aquí, N es el número de microorganismos viables recuperadas por cm2 por probeta; C es el número de placa; D es el factor de dilución; A es la superficie de la probeta en cm2 con el diámetro del disco de muestra. - Determinar la pérdida de viabilidad (LV) para reflejar la inhibición del crecimiento celular mediante la aplicación de la ecuación (3).
(3)
Nota: Aquí, C es el número de microorganismos viables (N) promedio de UFC/mL•cm2, recuperado de los ejemplares de control después de 24 h; S es el número de microorganismos viables (N) en UFC/mL•cm2, recuperado de las probetas después de 24 h. - Determinar la media y desviación estándar de la pérdida de viabilidad con los 4 valores LV(%) determinados de cada muestra.
- Determinar el número de microorganismos viables recuperadas según la ecuación (2).
Representative Results
Este protocolo fue empleado, por ejemplo, para probar la capacidad antimicrobiana de 4 materiales con diferentes naturalezas químicas contra los 3 recomienda microorganismos: Staphylococcus aureus, Escherichia coliy Candida albicans . Los resultados de las pruebas de difusión del disco de agar (método de difusión) mostraron actividad antimicrobiana no para el primer material (M1) como ocurrió en el disco de control (C, no se muestra imagen) y el aumento de actividad antibacteriana contra bacterias grampositivas y gramnegativas bacterias de los otros 3 materiales M2, M3 y M4 (ver figura 2).
Figura 2: resultados del método de difusión antimicrobiana. Este panel muestra el método de difusión antimicrobiana para los 4 materiales (M1, M2, M3 y M4) discos (diámetro 10 mm x 1 mm de espesor) contra S. aureus y e. coli después de 24 h de incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La figura 3 muestra los anchos normalizados de los antimicrobianos "halo" (nwhalo) para el ejemplo diferentes materiales M1, M2, M3 y M4 contra bacterias Gram positivas y gram-negativos calculado con la ecuación (1). Sin embargo, ninguno de los 4 materiales fueron capaces de inhibir el crecimiento de la levadura Candida albicans (imágenes que no se muestran).
Figura 3: resultados de "Halo" de difusión antimicrobiana. Este panel muestra el normalizado "halo" (nwhalo) para cada material (M1, M2, M3 y M4) en disco (diámetro 10 mm x 1 mm de espesor) contra S. aureus y e. coli después de 24 h de incubación. Las diferencias son estadísticamente significativas (p < 0.01). Sin embargo, muestra M1 exhibió ninguna actividad antimicrobiana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los resultados del método contacto también exhibieron actividad no antimicrobiano para el primer material (M1) como ocurrió en el disco de control (C) y aumento de la actividad antibacteriana contra Grampositive y bacterias Gram-negativas para los otros 3 materiales (véase Figura 4).
Figura 4: antimicrobianos resultados método de contacto. Este panel muestra las placas respectivas de 90 mm de 4 materiales (M1, M2, M3 y M4) actividad antimicrobiana superficie ensayo según la ISO 22196:2007 después de 24 h de incubación para S. aureus y e. coli (factor de dilución de 10-4). C es la bacteria viable recuperada desde el disco de control después de 24 h de incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La pérdida de viabilidad (%) se determinó por la ecuación (2) y (3) como se indica en el presente Protocolo (ver figura 5).
Figura 5: pérdida de viabilidad por método de contacto. Este panel muestra la pérdida de viabilidad (%) de M1, M2, M3 y M4 frente a S. aureus y e. coli en las superficies materiales. Muestra M1 no exhibió ninguna actividad antimicrobiana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Sin embargo, ninguno de los 4 materiales fueron capaces de inhibir el crecimiento de la levadura Candida albicans por el método de contacto o (imágenes que no se muestra). Por lo tanto, 3 de estos 4 materiales avanzados demostró resultados positivos antimicrobianos contra bacterias Gram positivas y gram-negativas y así podría ser muy útil para muchas aplicaciones de Bioingeniería con requerimientos de alta actividad antibacteriana. Sin embargo, ninguno de los 4 materiales fueron capaces de inhibir el crecimiento de la levadura.
Discussion
La actividad antimicrobiana de los nuevos materiales avanzados puede ser analizada por este protocolo de fácil-a-sigue consistiendo en 2 procedimientos complementarios basados en los métodos existentes 2: la difusión de discos de agar prueba38 y la actividad antimicrobiana se mide en superficies según la ISO 22196:2007 norma39.
En este campo de investigación, muchos de los ensayos antimicrobianos divulgados en la literatura dependen en gran ensayo. Por lo tanto, es muy importante haber detallado y coherente protocolos en lugar a través de laboratorios. Este artículo es un paso en esa dirección. Además, podría ser muy útil para muchos de los investigadores menos experimentados en este campo y requieren procedimientos detallados, paso a paso a seguir para obtener resultados precisos.
Este protocolo puede utilizarse con muchos tipos de materiales recortados en formas de disco de 10 mm de diámetro. Materiales frágiles pueden estar inflamados en un solvente adecuado para 1 h hacer más fácil el proceso de corte. Así, materiales hidrofílicos tales como los alginatos pueden ser hidratados en agua destilada esterilizada. Pueden emplearse otros disolventes como etanol, cetonas, diclorometano, a hincharse materiales hidrofóbicos para 1 h antes de cortarlos. Sin embargo, algunos materiales como el poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) no es necesario estar inflamados y puede cortar directamente. Después de eso, es muy importante secar los discos de material de muestra en un horno de vacío y esterilizar cada muestra con etanol y la radiación UV durante 1 hora para evitar cualquier riesgo de contaminación.
Este protocolo recomienda TSA y TSB como medios de cultivo y el uso de cultivos puros de 3 microorganismos para llegar a una amplia gama de microorganismos: bacterias Gram positivas Staphylococcus aureus, bacteria gram negativa Escherichia coli, y la levadura Candida albicans. Sin embargo, medios de cultivo alternativos y otros microorganismos necesitan condiciones de incubación diferentes podrían usarse con este protocolo. A veces, solamente 1 microorganismo es probado para tener una idea inicial de la actividad antimicrobiana de un nuevo material.
Los materiales que muestra fuerte actividad antimicrobiana contra los 3 recomendados diferentes tipos de microorganismos también deben ser evaluados contra patógenos resistentes a los antibióticos como la meticilina-resistente Staphylococcus epidermidis (MRSE), que se han utilizado con éxito con este protocolo. Otros importantes microorganismos resistentes a los medicamentos que están causando mucha preocupación están el gram-positivas resistentes a la meticilina Staphylococcus aureus (MRSA) y vancomicina-resistente Enterococci (VRE) y las Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa40,41.
Inhibición de la biopelícula y la actividad antimicrobiana de materiales frente a otros tipos de microorganismos tales como virus y parásitos no pueden analizarse con este protocolo. Sin embargo, este protocolo proporciona un punto de partida muy útil para un estudio de antimicrobiano de un nuevo material avanzado.
En la prueba de difusión de discos de agar antimicrobianos, un paso crucial se produce cuando el disco de muestra debe colocarse en el centro de la placa porque algunos materiales doblan tan pronto como consiguen en contacto con los medios de agar. En este caso, se recomienda utilizar un par estéril de pinzas para desplegar cuidadosamente la muestra. Por otra parte, en el método de contacto, es fundamental para el control de lavado y discos de muestra muy bien con PBS mediante pipeteo les cuatro veces seguida por una vigorosa Vortex y sonicación para asegurarse de que no hay microorganismos viables permanecen adheridos al material superficie.
Este protocolo de video puede ser utilizado en muchas aplicaciones de bioingeniería, tales como ingeniería de bioprocesos, ingeniería de tejidos, el suministro de medicamentos controlados, materiales de empaque, tratamiento de aguas residuales y agricultura, que uso en biomateriales con un muy capacidad antimicrobiana deseable.
Los resultados obtenidos con este protocolo son cualitativos (las imágenes) y cuantitativo (el ancho normalizado de lo antibacteriano "halo" y la pérdida de viabilidad) con un buen análisis de la reproducibilidad (media ± desviación estándar). Al comparar diferentes materiales, estos valores medios obtenidos con el análisis de resultados método de difusión y contacto deben ser analizados por ANOVA unidireccional, seguido por el análisis post hoc de la de Turquía, para estudiar si son, estadísticamente, significativamente diferentes (p < 0.01).
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir para la ayuda financiera para este trabajo a través de la 001UCV-231-2017 y 2018-231-001UCV becas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylindrical punch | 10 mm diameter | ||
| Petri dishes | soria genlab | P101 | 90 mm diameter, sterile |
| Tryptic soy agar (TSA) | Liofilchem | 610052 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
| Tryptic soy broth (TSB) | Liofilchem | 610053 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
| Sterile cotton swab | EUTOTUBO | 300200 | |
| Centrifuge tubes | VIDRA FOC, SA | 429900 | 50 mL, sterile |
| Ethanol | VWR | 83813360 | Absolute ethanol |
| Sterile 48-wells plate | COSTAR | 3548 | Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene |
| A pair of tweezers | BRAUN | 24612036 | Toothless |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS). | VWR | E404-100TAPBS | |
| Vaccum oven with a connected vacuum pump | JP Selecta, SA | 5900620 | |
| Laminar flow hood | TELSTAR Technologies, SL | TELSTAR AH-100 | 12.0 W lamp of UV-C radiation |
| Class II Biological safety cabinet | LABOGENE | MARS 1200 | |
| Incubator | ASTEC CO, LTD | SCA-165DR | |
| Vortex mixer | Biosan | V-1 Plus | |
| Spectrophotometer | Macherey-Nagel, Germany | Nanocolor UV/VIS II | |
| Bunsen burner | JP Selecta, SA | 7001539 | |
| Alcohol burner | VIDRA FOC, SA | 1658/20 | In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet |
| Orbital shaker | sartorius stedim | 8864845 | |
| Sonicator | SELECTA | 3000617 | 50/60 Hz |
| Digital calliper | ACHA | 17-260 | 0-150 mm |
| Serological pipette | Fisherbrand | 13-678-11 | 25 mL, sterile |
| Serological pipette | VWR | 612-4950 | 5 mL, sterile |
| Serological pipette | VWR | 612-5541 | 10 mL, sterile |
| Micropipette | GILSON | FA10005P | Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL |
| Micropipette | GILSON | F123602 | Pipetman P1000, 200-1000 µL |
| Micropipette | GILSON | FA10016 | Pipetman L P12X300L, 20-300 µL |
| Micropipette tips | LABBOX | TIBP-200-960 | 2-200 µL |
| Micropipette tips | LABBOX | TIBP-1K0-480 | 100-1000 µL |
| Pre-sterilized tube | INSULAB | 301402 | 10 mL |
| Photo camera | Canon EOS 5D | Any camera with high resolution can also be utilized | |
| Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus | strain V329 | Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9), 2888–2896 (2001) | |
| Gram-negative bacteria Escherichia coli | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 101 | |
| Yeast Candida albicans | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 1394 | |
| Microcentrifuge tubes | DASLAB | 175508 | 1,5 mL |
| Autoclave | JP Selecta, SA | 4002136 | |
| Spectrophotometer-cuvettes | UVAT Bio CB | F-0902-02 | 4,5 mL |
| Drigalski spatula | LABBOX | SPRP-L05-1K0 | Sterile, disposable |
| glass balls (2 mm diameter) | Hecht Karl | 1401/2 | Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula |
| Autoclave bags | DELTALAB | 200318 | To sterilize microbiological residues or contaminated material |
| Electronic pipette filling device | JetPip | JET BIOFIL | |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-100-010 | 100 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-250-010 | 250 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-500-010 | 500 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-1K0-010 | 1000 mL, for autoclaving culture media |
| Latex gloves | DENIA | 2278000000 | |
| Indicator tape for sterilization | LABBOX | STAP-A55-001 | Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process. |
| Universal test tube rack | LABBOX | MTSP-001-001 | To hold centrifuge tubes |
| Microcentrifuge tube rack | VWR | 211-0210 | To hold microcentrifuge tubes |
| Sterile loop | ACEFE S.A. | 100140055 | 10 µL of capacity for microbial culture |
| Material M1 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 1 | |
| Material M2 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 2 | |
| Material M3 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type3 | |
| Material M4 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 4 | |
| Material C | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Control material |
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