Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

مضادات الميكروبات توصيف المواد المتقدمة لتطبيقات الهندسة الحيوية

Published: August 4, 2018 doi: 10.3791/57710
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Facultad de Veterinaria y Ciencias Experimentales, Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir
* These authors contributed equally

Summary

نقدم بروتوكول لتوصيف المواد المتطورة المضادة للميكروبات. هنا، ونشاط مضادات الميكروبات على الأسطح المادية يقاس بطريقتين التي يكمل كل منهما الآخر: واحد يستند إلى اختبار نشر القرص أجار، والآخر إجراء قياسي استناداً إلى المعيار ISO 22196:2007.

Abstract

تطوير مواد جديدة متقدمة مع خصائص محسنة أصبحت أكثر وأكثر أهمية في مجموعة واسعة من تطبيقات الهندسة الحيوية. هكذا، يجري تصميم العديد من المواد الحيوية رواية لمحاكاة البيئات المحددة المطلوبة للتطبيقات الطبية الحيوية مثل هندسة الأنسجة وإيصال الأدوية الخاضعة للرقابة. تطوير مواد ذات خصائص محسنة لتجميد الخلايا أو الإنزيمات أيضا موضوع أبحاث الحالية في مجال الهندسة البيولوجية. واحدة من الخصائص الأكثر استصواباً لمادة في هذه التطبيقات غير أن قدرة مضادات الميكروبات لتجنب أي عدوى غير مرغوبة. لهذا، فإننا نقدم بروتوكولات سهلة لمتابعة للميكروبات توصيف المواد استناداً إلى الاختبار (ط) نشر القرص أجار (طريقة الانتشار) و (الثاني) المعيار ISO 22196:2007 لقياس نشاط مضادات الميكروبات على الأسطح المادية (جهة الاتصال الأسلوب). يجب تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام والخميرة لتغطية مجموعة واسعة من الكائنات الدقيقة. على سبيل مثال، يتم اختبار المواد 4 مع الطبيعة الكيميائية مختلفة عقب هذا البروتوكول ضد الإشريكيّة القولونية، المكوّرات العنقودية الذهبيةو المبيضات البيض. نتائج هذه الاختبارات معرض النشاط غير مضادات الميكروبات للمادة الأولى وزيادة النشاط المضاد للبكتيريا ضد الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام للمواد الأخرى 3. إلا أن أيا من هذه المواد 4 قادرون على تحول دون نمو المبيضات البيض.

Introduction

فشل عملية الزرع في كثير من الأحيان نتيجة للعدوى الميكروبية التي تحدث على الرغم من ظروف العمل العقيم والاتقاء بمضادات الميكروبات. هذه المشكلة تسبب تكاليف الرعاية الصحية مرتفعة جداً والمحزن بين المرضى1. أهمية البكتيريا مثل المكوّرات العنقودية الذهبية هي حاليا تعتبر مسببات الأمراض الخطرة جداً في العداوي المستشفوية المرتبطة بالقسطرة ويزرع الطبية الأخرى وهي الملوثات الرئيسية للأدوات الطبية2. ولذلك، وضع استراتيجيات مضادة للميكروبات رواية مطلوب على وجه السرعة للاستخدامات اليومية والطبية على حد سواء.

وتشمل مضادات الجراثيم المضادات الحيوية3ومركبات الأمونيوم الرباعية4، الأيونات المعدنية/أكاسيد5ومضادات الميكروبات الببتيدات (الامبير)6. وأصبحت تدريجيا أقل كفاءة بسبب مقاومة البكتريا7، الذي أخذ في الازدياد بسبب الإفراط في استخدام المضادات الحيوية8المضادات الحيوية. مركبات الأمونيوم الرباعية فقط فعالة جداً لاستخدام قصيرة الأجل بسبب المقاومة الميكروبية9. الأيونات المعدنية/أكاسيد استخدمت طويلاً كعوامل مضادة للميكروبات فعالة جداً، وتستخدم في العديد من المنتجات التجارية المشتركة بما في ذلك ضمادات، مرشحات المياه، والدهانات، إلخ10،،من1112. ومع ذلك، وقد ثبت أن هذه الأنواع من المركبات يمكن أن تكون سامة لبعض أنواع خلايا الثدييات13.

إظهار الامبير مضادات الميكروبات ممتازة وخصائص إيمونومودولاتوري14،15، والبكتيريا ويبدو أن تجد من الصعب جداً تطوير مقاومة ضدها16. عملية لإنتاج الامبير نقية غير مكلفة؛ ولذلك، إنتاج على نطاق واسع غير قابلة للبقاء. وهكذا، وضع استراتيجيات للتصدي للمشاكل في إنتاج الامبير كانت (مثلاً، بيبتويد المضادة للبكتيريا الجزيئات الصغيرة يقلد17، بيبتويدس18, α-الببتيدات19 و β-الببتيدات20). البروتينية انتهت الميثاكريليت وبوليبيبتويدس قد تم تصنيعه ل طلاء مضادات الميكروبات والمضادة للحشف على السفن21.

تطوير مضادات الجراثيم الجديدة مثل المواد المتقدمة في نقية أو النموذج الهجين، قادرة على منع وعلاج الالتهابات المقاوم للأدوية المتعددة، وضروري بشكل متزايد. وضعت مجموعة واسعة من مواد متقدمة جديدة للعديد من حقول الهندسة الحيوية مثل الأنسجة والهندسة البيولوجية مع تحسين الخواص الكيميائية والفيزيائية في العقود الماضية من خلال عدة أساليب: البلازما--البلمرة تطعيم على الركازة مسعور22،،من2324، والخياطة crosslinking الكثافة،من25إلى26، البلمرة في الحل27،،من2829 , 30, بورجين انحلال3231،، وعن طريق إدماج المواد النانوية مثل الجرافين أوكسيد (GO)33،34،،من3536 و الكربون النانو (كنفس)37.

دراسة قدرة الميكروبات من هذه المواد الجديدة يمكن أن تزيد أضعافاً مضاعفة على إمكانية تطبيق الهندسة الحيوية و، ولذلك أصبح من الضروري. نقدم بروتوكولا سهلة المتابعة لقياس نشاط مضادات الميكروبات من هذه المواد المتقدمة الجديدة. هنا، بعد إعداد نموذج، يتم اتباع أسلوبين من أساليب تكميلية: الأولى يستند أجار القرص نشر اختبار38 (طريقة الانتشار) والثاني يستند إلى ال ISO 22196:2007 المعيار39 لقياس نشاط مضادات الميكروبات في الأسطح المادية (أسلوب الاتصال).

Protocol

1. إعداد نموذج

  1. قطع عينات المواد إلى أقراص قطرها 10 ملم يبلغ قطرها 10 ملم لكمه أسطواني.
    ملاحظة: يمكن خففت في المذيبات معقمة مناسبة ح 1 مواد هشة وقطع ثم إلى الأقراص. على سبيل المثال، المواد ماء مثل الزنك الجينات تم اختبارها بعد هذا البروتوكول وكان مبلل في الماء يعقم قبل قصها تفاديا لكسر عينة. ومع ذلك، لا تحتاج مواد أخرى مسعور مثل poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) أي نوع من تورم السابقة من أجل أن تقطع بشكل صحيح.
  2. الجاف للأقراص عينة المادية عند 60 درجة مئوية في فرن فراغ (< 10-2 ميلليمتر زئبق) ح 24.
    ملاحظة: قد تحتاج بعض مواد تجفيف ارتفاع في درجة حرارة. ومع ذلك، من المهم ليس للوصول إلى درجة حرارة التي يمكن أن تتحلل حرارياً بالمواد.
  3. قياس سمك المواد الفيلم مع قدمه ذات الورنيّة رقمية.
    ملاحظة: هذا البروتوكول وتوصي باستخدام الأفلام المادية مع سمك ثابت ومماثلة عند مقارنة نشاط مضادات الميكروبات لمواد مختلفة.
  4. تعقيم كل عينة بالانغماس في الإيثانول 70% لمدة 10 دقائق واللاحقة البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) ح 1 في كل جانب.
    ملاحظة: يمكن إجراء الأشعة فوق البنفسجية وضع كل عينة في طبق بتري معقم داخل غطاء الاندفاق الصفحي مع مصباح ث 12.0 لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية-ج.
    تنبيه: الباحثين ينبغي عدم تعريض أنفسهم للأشعة فوق البنفسجية، لأنها مطفرة.
  5. نفذ الخطوات 1.1، 1.2، 1.3 و 1.4. مع الأقراص السيطرة المادية.
    ملاحظة: البولي ايثلين (PET) أو مواد بديلة غير مضادات الميكروبات يمكن كأقراص التحكم في أسلوب نشرها والاتصال. وعلاوة على ذلك، عندما وصف نانومترى أو مواد المعالجة، ينبغي استخدام المواد الأساسية كمواد لعنصر التحكم.

2-الموصى به الكائنات الحية الدقيقة

ملاحظة: نوصي باستخدام 3 الكائنات الحية الدقيقة المختلفة لدراسة قدرة الميكروبات المواد المختبرة ضد طائفة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة.

  1. استخدام الثقافات نقية للكائنات الدقيقة 3: البكتيريا إيجابية المكوّرات العنقودية الذهبيةوالبكتيريا سلبية الغرام الإشريكيّة القولونيةوالخميرة المبيضات البيض.
    ملاحظة: أنواع الكائنات الدقيقة الأخرى يمكن أيضا اختبار مع هذا البروتوكول عن طريق تعديل شروط الحضانة إذا لزم الأمر.
    تنبيه: يجب أن يتبع مقاييس السلامة المطلوبة وفقا للنوع من الكائنات الدقيقة المستخدمة في هذا البروتوكول.
  2. العمل مع المواد المعقمة مسبقاً أو يعقم واستخدام موقد بنسن خلال العملية برمتها من التلاعب بالميكروبات أو خزانة سلامة بيولوجية (إذا لزم الأمر) لضمان ظروف معقمة.
    ملاحظة: شروط اﻷوتوكﻻف الموصى بها 121 درجة مئوية خلال 15 دقيقة لوسائل الثقافة و 121 درجة مئوية خلال 20 دقيقة للعامل المادي والمخلفات البيولوجية.

3-أجار القرص نشر الاختبار (طريقة الانتشار)

ملاحظة: عند انتشار سائل من المركبات المضادة للميكروبات قد تكون الميكروبات هي الآلية الرئيسية للمواد المتقدمة، يمكن أن توفر طريقة نشر معلومات مفيدة جداً حول قدرة الميكروبات من هذه المواد. القرص مادية تقع في وسط اللوحة أجار يمكن أن تشكل منطقة الطوق شفافة (هالة) حيث يحدث تثبيط نمو الكائنات الدقيقة بعد 24 ساعة ثقافة (انظر الشكل 1).

  1. نشر الاختبار الداخلي
    1. الإعداد وفول الصويا تريبتيك اﻷوتوكﻻف أجار (TSA) اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    2. من أجل السياحة في أطباق بتري معقمة تحت ظروف معقمة باستخدام موقد بنسن أو غطاء الاندفاق الصفحي.
      ملاحظة: يجب أن تكون لوحات حساب السياحة الفرعي 4-6 مم.
    3. الثقافة الكائنات الحية الدقيقة المختلفة لفحصها هوائيا ح 18 – 24 في أطباق بتري بحساب السياحة الفرعي في حاضنة في 37 درجة مئوية.
    4. إعداد ومرق الصويا تريبتيك اﻷوتوكﻻف (TSB) اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    5. من أجل TSB في أنبوب الطرد مركزي قبل تعقيم 50 مل مع ماصة معقمة قبل مصلية تحت ظروف معقمة باستخدام موقد بنسن أو غطاء الاندفاق الصفحي.
    6. ريسوسبيند مستعمرات قليلة من الخطوة 3.1.3 في 25 مل من TSB الواردة في أنبوب عقيم للطرد مركزي باستخدام مسحه القطن المعقمة ودوامه لهم لمدة 1 دقيقة لتحقيق خلط موحدة.
    7. ضبط امتصاص (في 540 نانومتر) الثقافة مع جهاز المطياف الضوئي لعدد مناسب من مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) كل مل: حوالي 1.5 × 108 زيمبابوي/مل للبكتيريا ومن 1 × 106 إلى 5 × 106 زيمبابوي/مل للخميرة.
      ملاحظة: يجب تحديد حجم الثقافة وومبومو لقياس امتصاص وفقا لنوع جهاز المطياف الضوئي تستخدم.
    8. دوامة مرق الميكروبية لمدة 5 ثوان لتحسين تشتت الكائنات الدقيقة وتغرق بإيجاز مسحه القطن معقمة في هذا التعليق للميكروبات. إزالة فائض السائل من المسحة بالضغط عليه ضد جدار الأنبوبة التي تحتوي على الثقافة.
    9. خط تعليق مرق الميكروبية مع مسحه القطن معقم على سطح اللوحات حساب السياحة الفرعي في 3 طائرات لتغطية سطحها كله مع الكائنات الدقيقة وأتركها تجف لمدة 5 دقائق بعد التطعيم بالتساوي.
      ملاحظة: لإزالة أي رطوبة، لوحات السياحة يجب أن توضع مفتوحة في وضع مقلوب عند 37 درجة مئوية لمدة 10 – 15 دقيقة قبل التلقيح.
    10. تعقيم زوج من ملاقط أغرق لهم في كوب مع الإيثانول 96% ويلهب لهم ثم مع موقد بنسن أو موقد الكحول.
    11. ضع الأقراص العينة لاختبار ومراقبة القرص في وسط لوحات حساب السياحة الفرعي باستخدام زوج ملاقط معقمة.
    12. احتضان هوائيا لوحات حساب السياحة الفرعي في وضع مقلوب عند 37 درجة مئوية ح 24.
      ملاحظة: لتفادي أي خطر التلوث، ينصح لاحتضان لوحات حساب السياحة الفرعي في وضع مقلوب. ومع ذلك، إذا كان القرص العينة يفصل من لوحات حساب السياحة الفرعي، غير تنفيذ هذه الخطوة في وضع مقلوب. في هذه الحالة، من المستحسن أن تجف اللوحات في هود الاندفاق الصفحي. يجب إجراء هذا الاختبار مضادات الميكروبات في كوادريبليكاتي على الأقل في أيام مختلفة لضمان إمكانية تكرار نتائج.
  2. فحص تركيز تعليق الميكروبية ونقاء
    ملاحظة: الخطوات التالية ضرورية من أجل التحقق من أن تركيز الميكروبية مصممة مع جهاز المطياف الضوئي في خطوة 3.1.7 الصحيح، وضمان عدم وجود أي تلوث البيئة الميكروبية. ويمكن الكشف عن تلوث البيئي الميكروبات بسهولة بظهور أنواع مختلفة من المستعمرات الجرثومية بعد 24 ساعة ثقافة. وعلاوة على ذلك، يجب أن يكفل أي تلوث الميكروبية المتوسطة TSB خلال التلاعب به في تخفيف المسلسل عشرية مع لوحة تحكم TSB سلبية.
    1. الاستغناء عن TSB العقيمة (أعد الخطوة 3.1.4) في أنابيب معقمة ميكروسينتريفوجي باستخدام ميكروبيبيتي مع نصائح يعقم مناسبة في ظروف معقمة. واحد منهم سوف تستخدم كعنصر تحكم TSB سلبية.
    2. إجراء تخفيف المسلسل عشرية مع تعليق مرق الميكروبية المستخدمة في الخطوة 3.1.9 في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة التي تتضمن TSB.
    3. نشر 100 ميليلتر من كل تمييع في لوحات حساب السياحة الفرعي باستخدام ملعقة دريجالسكي قبل تعقيم أو أداة بديلة. وانتشرت أيضا 100 ميكروليتر من المتوسطة TSB دون الكائنات الدقيقة (أعد الخطوة 3.2.1) على طبق حساب السياحة الفرعي كلوحة تحكم TSB سلبية.
    4. احتضان هوائيا لوحات تسا هوائيا في 37 درجة مئوية ح 24.
    5. حساب عدد المستعمرات للتحقق من أن زيمبابوي/مل مماثلة لتلك المحددة في الخطوة 3.1.7.
    6. تحقق من أنه لا يوجد أي تلوث البيئة الميكروبية على لوحات حساب السياحة الفرعي بنوع واحد فقط من المستعمرات.
    7. تحقق من أنه لا يوجد أي تلوث جرثومي على لوحة التحكم السلبي TSB عرض لا مستعمرات

4-قياس نشاط مضادات الميكروبات على الأسطح المادية (أسلوب الاتصال)


ملاحظة: عند الاتصال السطحية قد تكون الميكروبات هي الآلية الرئيسية لبعض المواد المتقدمة، يمكن أن توفر وسيلة الاتصال معلومات مفيدة جداً حول قدرة الميكروبات من هذه المواد. في هذا الأسلوب، والكائنات الحية الدقيقة وتوضع مباشرة على سطح المادة ويمكن تحديده تثبيط النمو بعد فترة معينة من الزمن.

  1. الإجراءات الأولية
    1. إعداد والاوتوكلاف TSB اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    2. من أجل TSB في أنبوب الطرد مركزي قبل تعقيم 50 مل مع ماصة معقمة قبل مصلية تحت ظروف معقمة باستخدام موقد بنسن أو غطاء الاندفاق الصفحي.
    3. الثقافة الكائنات الحية الدقيقة المختلفة اختبار هوائيا بين عشية وضحاها في الأنبوب مع TSB في شاكر مداري (140 لفة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية.
    4. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 20 مل TSB في أنبوب الطرد مركزي قبل تعقيم 50 مل بتركيز من ما يقرب من 106 زيمبابوي/مليلتر (مصممة مع جهاز المطياف الضوئي في 540 نانومتر).
      ملاحظة: يجب تحديد حجم الثقافة وومبومو لقياس امتصاص وفقا لنوع جهاز المطياف الضوئي تستخدم.
    5. إجراء تخفيف المسلسل العشرية لهذه الثقافة في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة التي تتضمن TSB. نشر 100 ميليلتر للثقافة في لوحات حساب السياحة الفرعي واحتضان أنه هوائيا في 37 درجة مئوية ح 24.
    6. حساب عدد المستعمرات لضمان تركيز خلية أولية زيمبابوي/mL تقريبا 1 × 106
    7. 4 مكان مراقبة الأقراص للعد الميكروبي بعد 24 ساعة و 4 أقراص عينة من كل نوع من المواد المختبرة للعد الميكروبي بعد يفصل ح 24 في الآبار للوحة 48-جيدا العقيمة.
    8. "الماصة؛" 150 ميليلتر من تعليق الميكروبية على كل سطح القرص.
  2. الميكروبية تعتمد على مراقبة واختبار مواد (بعد 24 ساعة)
    1. بعد خطوة 4.1.6، احتضان هوائيا الأقراص العينة 4 المتبقية في لوحة 48-جيدا في 37 درجة مئوية ح 24.
      ملاحظة: يمكن تعديل هذا الوقت حضانة 24 ساعة من أجل دراسة تثبيط النمو في أوقات أقصر أو أطول.
    2. بعد 24 ساعة حضانة، "الماصة؛" ميليلتر 850 من PBS العقيمة على سطح الأقراص العينة 4 ومزجها مع 150 ميليلتر من تعليق الميكروبية.
    3. جمع الخليط تعليق برنامج تلفزيوني/الميكروبية وكل قرص من لوحة 48-جيدا وتحويلها إلى أنبوب معقم قبل 10 مل.
    4. دوامة الخليط تعليق برنامج تلفزيوني/الميكروبية وكل قرص لمدة 1 دقيقة، sonicate أنه في 50 هرتز لمدة 5 دقائق ودوامه مرة أخرى 1 دقيقة لضمان بقاء الكائنات الدقيقة قادرة على البقاء لا تلتزم بسطح المادة.
    5. إجراء تخفيف المسلسل العشرية لكل ثقافة سونيكاتيد في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة التي تتضمن TSB وانتشر 100 ميليلتر للثقافة في لوحات حساب السياحة الفرعي واحتضان أنه هوائيا في 37 درجة مئوية ح 24.
    6. حساب العدد المستعمرات، وهي عدد الكائنات الدقيقة قابلة للتطبيق على كل سطح القرص العينة والتحكم. أعرب عن هذا العدد من الخلايا قادرة على البقاء في (زيمبابوي/mL).
    7. التقاط صورة الثقافة الميكروبية النهائي للأقراص العينة والتحكم.

5-الميكروبات نتائج التحليل

Figure 1
رقم 1: قياسات للعرض تم تسويتها لمضادات الميكروبات "هالو". ويبين هذا الفريق قطر منطقة تثبيط (دعز) وقطر القرص (d). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. نشر أسلوب تحليل النتائج
    1. قياس قطر منطقة تثبيط (دعز) وقطر القرص (د) (انظر الشكل 1) مع قدمه ذات الورنيّة رقمية.
      ملاحظة: يتم تشكيل تثبيط المنطقة أو مضادات الميكروبات "هالو" نتيجة لتثبيط نمو الجراثيم التي تنتجها الميكروبات القرص المادية (انظر الشكل 1). من الممكن أن نلاحظ أن هناك منطقة الطوق شفافة قريبة من العينة بالمقارنة مع بقية اللوحة فيها الكائنات الحية الدقيقة قد نمت بشكل صحيح (منطقة معتمة).
    2. تحديد عرض مضادات الميكروبات "هالو" (شمال غربهالو) لكل قرص تم تسويتها عن طريق تطبيق المعادلة (1).
      (1)Equation 1
    3. تحديد المتوسط والانحراف المعياري لعرض القيم nwهالة الميكروبات "هالو" مع 4 يحدد لكل عينة تم تسويتها.
    4. التقاط صورة من ثقافة الميكروبية النهائي مع القرص المادية.
      ملاحظة: قطر منطقة تثبيط (دعز) وقطر القرص (د) يمكن أيضا أن يقاس من الصورة المأخوذة في الخطوة 5.1.4 باستخدام برامج معالجة صور مناسبة.
  2. تحليل نتائج أسلوب الاتصال
    1. تحديد عدد الكائنات الدقيقة قادرة على البقاء استردادها وفقا للمعادلة (2).
      (2)Equation 2
      ملاحظة: هنا، N هو عدد الكائنات الدقيقة قابلة للتطبيق استرداد كل سم2 لكل عينة الاختبار؛ ج هو تعداد الصحن؛ د هو عامل التخفيف؛ (أ) هو المساحة السطحية لاختبار العينة في سم2 مصممة مع قطر القرص عينة.
    2. تحديد فقدان الصلاحية (LV) تعكس تثبيط نمو الخلايا عن طريق تطبيق المعادلة (3).
      (3)Equation 3
      ملاحظة: هنا، هو ج في زيمبابوي/mL•cm2، تعافي من العينات المراقبة بعد 24 ساعة؛ متوسط عدد الكائنات الدقيقة قادرة على البقاء (N) S هو عدد الكائنات الدقيقة قادرة على البقاء (N) في زيمبابوي/mL•cm2، تعافي من عينات الاختبار بعد 24 ساعة.
    3. تحديد المتوسط والانحراف المعياري الخسارة للبقاء مع القيم LV(%) العزم 4 لكل عينة.

Representative Results

كان يعمل هذا البروتوكول، على سبيل مثال، لاختبار قدرة الميكروبات المواد 4 مع الطبيعة الكيميائية المختلفة ضد 3 يوصي بالكائنات الدقيقة: الإشريكيّة القولونية، المكوّرات العنقودية الذهبيةو المبيضات البيض . أظهرت نتائج الاختبارات نشر القرص أجار (طريقة الانتشار) النشاط غير مضادات الميكروبات للمواد الأولى (M1) كما أنه حدث في قرص التحكم (C، لا تظهر الصورة) وزيادة النشاط المضاد للبكتيريا ضد إيجابية وسلبية الغرام البكتيريا للمواد الأخرى 3 M2, M3 و M4 (انظر الشكل 2).

Figure 2
رقم 2: نتائج أسلوب نشر الميكروبات. يظهر هذا الفريق طريقة نشر الميكروبات 4 المادية (M1, M2, M3 و M4) الأقراص (قطرها 10 مم × سمك 1 مم) ضد س المذهبة و كولاي بعد 24 ساعة حضانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويبين الشكل 3 عروض طبيعية مختلفة من مضادات الميكروبات "هالو" (شمال غربهالو) مثال مختلف المواد M1، M2 و M3 و M4 ضد الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام محسوبة بالمعادلة (1). ومع ذلك، لم يستطع تعوق نمو الخميرة المبيضات البيض (الصور لا تظهر) أي المواد 4.

Figure 3
الشكل 3: نتائج انتشار الميكروبات "هالو". ويبين هذا الفريق تطبيع "هالو" (شمال غربهالو) لكل المواد (M1, M2, M3 و M4) القرص (قطرها 10 مم × سمك 1 مم) ضد س المذهبة و كولاي بعد 24 ساعة حضانة. الاختلافات معتدا به إحصائيا (p < 0.01). ومع ذلك، أظهرت العينة M1 أي نشاط مضادات الميكروبات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كما سجلت نتائج أسلوب الاتصال نشاط غير مضادات الميكروبات للمواد الأولى (M1) كما أنه حدث في عنصر تحكم القرص (ج) وتزايد النشاط المضاد للبكتيريا ضد جرامبوسيتيفي والبكتيريا سلبية الغرام لغيرها من المواد 3 (انظر الشكل 4).

Figure 4
الشكل 4: الميكروبات الاتصال نتائج الأسلوب. ويبين هذا الفريق لوحات كل منها 90 مم 4 المادية (M1, M2, M3 و M4) نشاط مضادات الميكروبات السطحية المقايسة وفقا ISO 22196:2007 بعد 24 ساعة من الحضانة س المذهبة و كولاي (عامل التخفيف من 10-4). ج من البكتيريا قادرة على البقاء استردادها من القرص التحكم بعد 24 ساعة حضانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مصممة فقدان الصلاحية (%) حسب المعادلة (2) و (3) كما هو مبين في هذا البروتوكول (انظر الشكل 5).

Figure 5
الرقم 5: فقدان الصلاحية بأسلوب الاتصال- ويبين هذا الفريق فقدان الصلاحية (%) M1 و M2 M3 M4 ضد س المذهبة و كولاي على أسطح المواد. أظهرت العينة M1 أي نشاط مضادات الميكروبات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ومع ذلك، لم يستطع تعوق نمو الخميرة المبيضات البيض بطريقة الاتصال أما (الصور لا تظهر) أي المواد 4. ولذلك، 3 من هذه المواد المتقدمة 4 أظهرت نتائج إيجابية مضادات الميكروبات ضد الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام وهكذا يمكن أن تكون مفيدة جداً للعديد من تطبيقات الهندسة الحيوية مع متطلبات عالية النشاط المضاد للبكتيريا. ومع ذلك، لم يستطع تعوق نمو الخميرة أي المواد 4.

Discussion

يمكن تحليل نشاط مضادات الميكروبات لمواد متقدمة جديدة بموجب هذا البروتوكول سهلة لمتابعة تتكون من 2 إجراءات تكميلية تستند إلى الأساليب القائمة 2: نشر القرص أجار اختبار38 وقياس نشاط مضادات الميكروبات في مواد السطوح وفقا للمعيار ISO 22196:200739.

في هذا المجال البحثي، العديد من اختبارات مضادات الميكروبات التي ذكرت في الأدبيات تعتمد اعتماداً كبيرا على المقايسة. ولذلك، من المهم أن تكون مفصلة جداً ويتفق البروتوكولات في مكان عبر المختبرات. هذه المادة خطوة في هذا الاتجاه. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تكون مفيدة جداً للعديد من الباحثين الذين هم أقل خبرة في هذا الميدان وتتطلب إجراءات معمقة، خطوة بخطوة لمتابعة لنتائج دقيقة.

يمكن استخدام هذا البروتوكول مع العديد من أنواع المواد يقتطع من الأشكال القرص قطرها 10 ملم. يمكن تورم المواد هشة في مذيب مناسب ح 1 لجعل عملية القطع أسهل. وهكذا، يمكن رطب ماء مواد مثل الجيناتيس في الماء المقطر يعقم. ويمكن استخدام المذيبات الأخرى، مثل الإيثانول، كيتون، والميثان، إلى تضخم المواد عمود المصباح ح 1 قبل قصها. ومع ذلك، لا تحتاج بعض المواد مثل poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) منتفخة وأنها يمكن أن تخفض مباشرة. بعد ذلك، من المهم جداً لتجف الأقراص المادية العينة في فرن فراغ وتعقيم كل عينة مع الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية ح 1 لتجنب أي خطر التلوث.

هذا البروتوكول وتوصي إدارة أمن النقل و TSB كثقافة وسائل الإعلام، واستخدام الثقافات نقية للكائنات الدقيقة 3 للوصول إلى مجموعة واسعة من الكائنات الدقيقة: البكتيريا إيجابية البكتيريا سلبية الغرام الإشريكيّة القولونية، المكوّرات العنقودية الذهبية، والخميرة المبيضات البيض. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام وسائل الإعلام الثقافة البديلة والكائنات الحية الدقيقة الأخرى التي تحتاج إلى احتضان مختلف الظروف مع هذا البروتوكول. في بعض الأحيان، يتم اختبار الكائنات الدقيقة 1 فقط الحصول على فكرة أولية لنشاط مضادات الميكروبات من مادة جديدة.

المواد التي تبين نشاط مضادات الميكروبات قوية ضد 3 الموصى بها مختلفة ينبغي اختبار أنواع من الكائنات الحية الدقيقة ضد العوامل الممرضة المقاومة للمضادات الحيوية مثل مقاومة للميثيسيلين ابيديرميديس المكوّرات العنقودية (مرسى)، التي وقد استخدمت بنجاح مع هذا البروتوكول. أخرى الكائنات الدقيقة المقاومة للعقاقير الهامة التي تتسبب في الكثير من القلق هي مثسلين مقاومة إيجابية المكوّرات العنقودية الذهبية (الجرثومة) ومقاومة للفانكوميسين انتيروكوكساي (فري) و الغرام الزائفة الزّنجاريّة40،41.

لا يمكن اختبار تثبيط بيوفيلم ونشاط مضادات الميكروبات لمواد ضد أنواع أخرى من الكائنات المجهرية مثل الفيروسات والطفيليات مع هذا البروتوكول. ومع ذلك، يوفر هذا البروتوكول نقطة انطلاق مفيدة للغاية لدراسة الميكروبات جديدة متقدمة المواد.

في اختبار نشر القرص أجار مضادات الميكروبات، يحدث خطوة حاسمة عندما القرص عينة أن توضع في وسط اللوحة لأن بعض المواد أمثال حالما تحصل على اتصال مع وسائط الإعلام أجار. وفي هذه الحالة، من المستحسن استخدام زوج عقيمة من ملاقط تتكشف العينة بعناية. من ناحية أخرى، في أسلوب الاتصال، من الأهمية بمكان أن يغسل عنصر التحكم والأقراص العينة جيدا مع برنامج تلفزيوني قبل بيبيتينج منهم أربع مرات يليه فورتيكسينج قوية و sonication بغية التأكد من أن لا من الكائنات الدقيقة قابلة للتطبيق تظل يلتزم بالمواد السطح.

ويمكن استخدام هذا البروتوكول الفيديو في العديد من تطبيقات الهندسة الحيوية، مثل الهندسة البيولوجية وهندسة الأنسجة وتسليم العقاقير الخاضعة للمراقبة، ومواد التعبئة والتغليف، ومعالجة مياه الصرف الصحي والزراعة التي تستخدم المواد الحيوية مع درجة عالية قدرة الميكروبات المرغوب فيه.

النتائج التي تم الحصول عليها مع أحكام هذا البروتوكول النوعية (الصور) والكمية (عرض طبيعية للبكتيريا "هالو"، وفقدان الصلاحية) مع تحليل جيد في إمكانية تكرار نتائج لها (يعني ± الانحراف المعياري). عند مقارنة مختلف المواد، يجب تحليل هذه القيم الوسطية التي تم الحصول عليها مع تحليل نتائج أسلوب نشرها والاتصال باتجاه واحد ANOVA، يليها تحليل الوظائف المخصصة لتركيا، من أجل دراسة إذا كانوا، إحصائيا، إلى حد كبير مختلفة (ف < 0.01).

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

منح 2018-231-001UCV والمؤلفين يود أن يعترف الجامعة الكاثوليكية دي فالنسيا سان فيسنتي مارتير للدعم المالي لهذا العمل من خلال 2017-231-001UCV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cylindrical punch  10 mm diameter
Petri dishes soria genlab P101 90 mm diameter, sterile
Tryptic soy agar (TSA) Liofilchem 610052 Dehydrated medium 500 g (powder)
Tryptic soy broth (TSB) Liofilchem 610053 Dehydrated medium 500 g (powder)
Sterile cotton swab EUTOTUBO 300200
Centrifuge tubes VIDRA FOC, SA 429900 50 mL, sterile
Ethanol VWR 83813360 Absolute ethanol
Sterile 48-wells plate COSTAR 3548 Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene
A pair of tweezers BRAUN 24612036 Toothless
Sterile phosphate buffered saline (PBS). VWR E404-100TAPBS
Vaccum oven with a connected vacuum pump JP Selecta, SA 5900620
Laminar flow hood TELSTAR Technologies, SL TELSTAR AH-100 12.0 W lamp of UV-C radiation
Class II Biological safety cabinet LABOGENE MARS 1200
Incubator ASTEC CO, LTD SCA-165DR
Vortex mixer Biosan V-1 Plus
Spectrophotometer Macherey-Nagel, Germany Nanocolor UV/VIS II
Bunsen burner JP Selecta, SA 7001539
Alcohol burner VIDRA FOC, SA 1658/20 In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet
Orbital shaker sartorius stedim 8864845
Sonicator SELECTA 3000617 50/60 Hz
Digital calliper ACHA 17-260 0-150 mm
Serological pipette Fisherbrand 13-678-11 25 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-4950 5 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-5541 10 mL, sterile
Micropipette GILSON FA10005P Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL
Micropipette GILSON F123602 Pipetman P1000, 200-1000 µL
Micropipette  GILSON FA10016 Pipetman L P12X300L, 20-300 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-200-960 2-200 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-1K0-480 100-1000 µL
Pre-sterilized tube  INSULAB 301402 10 mL 
Photo camera Canon EOS 5D Any camera with high resolution can also be utilized
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus  strain V329 Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),  2888–2896 (2001)
Gram-negative bacteria Escherichia coli Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 101
Yeast Candida albicans Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 1394
Microcentrifuge tubes  DASLAB 175508 1,5 mL
Autoclave JP Selecta, SA 4002136
Spectrophotometer-cuvettes UVAT Bio CB F-0902-02 4,5 mL
Drigalski spatula LABBOX SPRP-L05-1K0 Sterile, disposable 
glass balls (2 mm diameter) Hecht Karl 1401/2 Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula
Autoclave bags DELTALAB 200318 To sterilize microbiological residues or contaminated material
Electronic pipette filling device JetPip JET BIOFIL
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-100-010 100 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-250-010 250 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-500-010 500 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-1K0-010 1000 mL, for autoclaving culture media
Latex gloves DENIA 2278000000
Indicator tape for sterilization LABBOX STAP-A55-001 Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.
Universal test tube rack LABBOX MTSP-001-001 To hold centrifuge tubes
Microcentrifuge tube rack VWR 211-0210 To hold microcentrifuge tubes
Sterile loop ACEFE S.A. 100140055 10 µL of capacity for microbial culture 
Material M1 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 1 
Material M2 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 2 
Material M3 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type3
Material M4 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 4 
Material C Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Control material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
  2. Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668 (2016).
  3. Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104 (2011).
  4. Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
  5. Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
  6. Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).
  7. Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
  8. Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
  9. Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
  10. Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
  11. Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
  12. Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
  13. Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  14. Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
  15. McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
  16. Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
  17. Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
  18. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  19. Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
  20. Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565 (2000).
  21. Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
  22. Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
  23. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
  24. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
  25. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
  26. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
  27. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
  28. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
  29. Serrano-Aroca, Á, Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
  30. Serrano-Aroca, Á, Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
  31. Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
  32. Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
  33. Serrano-Aroca, Á, Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684 (2017).
  34. Serrano-Aroca, Á, Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).
  35. Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
  36. Serrano-Aroc, Á, Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
  37. Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, Á Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).
  38. Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
  39. ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).
  40. Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
  41. Boucher, H. W., et al. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).

Tags

الهندسة الحيوية، 138 قضية، المواد المتقدمة، ومضادات الميكروبات، وتوصيف، نشر القرص، المواد السطحية، والهندسة الحيوية
مضادات الميكروبات توصيف المواد المتقدمة لتطبيقات الهندسة الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martí, M., Frígols, B.,… More

Martí, M., Frígols, B., Serrano-Aroca, A. Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications. J. Vis. Exp. (138), e57710, doi:10.3791/57710 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter