Vi presentiamo un protocollo per la caratterizzazione antimicrobica dei materiali avanzati. Qui, l’attività antimicrobica su superfici di materiale viene misurata dai due metodi che si completano a vicenda: uno si basa su test di diffusione del disco di agar, e l’altra è una procedura standard in base alla norma ISO 22196: 2007.
Lo sviluppo di nuovi materiali avanzati con proprietà migliorate sta diventando sempre più importante in una vasta gamma di applicazioni di bioingegneria. Così, molti nuovi biomateriali sono stati progettati per simulare ambienti specifici richiesti per applicazioni biomediche quali ingegneria tissutale e somministrazione controllata. Lo sviluppo di materiali con proprietà migliorate per l’immobilizzazione di cellule o di enzimi è anche un argomento di ricerca corrente in ingegneria dei bioprocessi. Tuttavia, una delle proprietà più desiderabile di un materiale in queste applicazioni è la capacità antimicrobica per evitare eventuali infezioni indesiderate. Per questo, vi presentiamo facile da seguire protocolli per la caratterizzazione antimicrobica dei materiali basata (i) il test di diffusione disco agar (metodo di diffusione) e (ii) la norma ISO 22196: 2007 per misurare l’attività antimicrobica su superfici di materiale (contatto Metodo). Questo protocollo deve essere eseguito usando batteri Gram-positivi e Gram-negativi e lieviti per coprire un’ampia gamma di microrganismi. Ad esempio, 4 materiali con diversa natura chimica sono testati seguendo questo protocollo contro lo Staphylococcus aureus, Escherichia colie Candida albicans. I risultati di questi test mostrano attività non antimicrobico per il primo materiale e aumentando l’attività antibatterica contro i batteri Gram-positivi e Gram-negativi per gli altri 3 materiali. Tuttavia, nessuno dei 4 materiali sono in grado di inibire la crescita di Candida albicans.
Fallimento dell’impianto è spesso una conseguenza di infezioni microbiche che si verificano nonostante la profilassi antimicrobica e condizioni di lavoro asettico. Questo problema è causando costi sanitari molto elevati ed è angosciante tra pazienti1. Importanti batteri come Staphylococcus aureus sono attualmente considerati molto pericolosi agenti patogeni nelle infezioni nosocomial connesse con cateteri e altri impianti medici e sono i principali contaminanti di strumenti medici2. Di conseguenza, lo sviluppo di nuove strategie antimicrobiche è urgente per usi sia giornalieri che medicali.
Agenti antimicrobici includono antibiotici3, composti di ammonio quaternario4, ioni/ossidi metallici5e peptidi antimicrobici (amp)6. Gli antibiotici sono gradualmente sempre meno efficienti a causa della resistenza batterica7, che è in aumento a causa di un uso eccessivo di antibiotici8. Composti di ammonio quaternario sono solo molto efficienti per un uso a breve termine a causa della resistenza microbica9. Gli ioni/ossidi metallici sono stati a lungo utilizzati come agenti antimicrobici molto efficaci e sono utilizzati in molti prodotti commerciali comuni tra cui bende, filtri per l’acqua, vernici, ecc.10,11,12. Tuttavia, è stato dimostrato che questi tipi di composti possono essere tossici per alcuni tipi di cellule di mammifero13.
Amplificatori Visualizza eccellente antimicrobico e immunomodulatori proprietà14,15, e batteri sembrano trovare molto difficile sviluppare una resistenza contro di loro16. Tuttavia, il processo per produrre puro AMPs è costoso; di conseguenza, una produzione su larga scala non è praticabile. Quindi, strategie per contrastare i problemi nella produzione di amplificatori sono stati sviluppati (ad es., piccolo molecolare antibatterico peptoid imita17, peptoids18, α-peptidi19 e β-peptidi20). Polypeptoids e si è conclusa in metacrilato polipeptidi sono stati sintetizzati per rivestimenti antimicrobici e antivegetativa21.
Lo sviluppo di nuovi agenti antimicrobici quali materiali avanzati in puro o la forma ibrida, in grado di prevenire e curare le infezioni multidrug-resistente, è sempre più necessario. Una vasta gamma di nuovi materiali avanzati per molti campi di bioingegneria come tessuto e ingegneria di bioprocess sono stati sviluppati con proprietà chimiche e fisiche migliorate negli ultimi decenni attraverso diversi metodi: polimerizzazione al plasma innesto un substrato idrofobo22,23,24, sartoria di reticolazione densità25,26, polimerizzazione in soluzione27,28,29 , 30, porogen dissoluzione31,32e dall’incorporazione di nanomateriali quali grafene ossido (GO)33,34,35,36 e carbonio nanofibre (CNFs)37.
Lo studio della capacità antimicrobica di questi nuovi materiali potrebbe aumentare in modo esponenziale il loro potenziale applicabilità di Bioingegneria e ha, pertanto, diventano essenziale. Vi presentiamo un protocollo facile da seguire per quantificare l’attività antimicrobica di tali nuovi materiali avanzati. Qui, dopo la preparazione del campione, sono seguiti due metodi complementari: il primo si basa su agar diffusione test disco38 (metodo di diffusione) e la seconda si basa sulla norma ISO 22196: 200739 per misurare l’attività antimicrobica su superfici del materiale (metodo di contatto).
L’attività antimicrobica dei nuovi materiali avanzati possa essere analizzato dal presente protocollo facile da seguire che consiste di 2 procedure complementari basate su 2 metodi esistenti: la diffusione del disco di agar test38 e l’attività antimicrobica misurata su superfici del materiale secondo la ISO 22196: 2007 norma39.
In questo campo di ricerca, molte delle prove antimicrobiche segnalate nella letteratura sono altamente dipendenti dal dosaggio. Pertanto, è molto importante avere precise e coerenti protocolli in luogo attraverso laboratori. Questo articolo è un passo in quella direzione. Inoltre, esso potrebbe essere molto utile per molti ricercatori che sono meno esperti in questo campo e richiedono approfondite, passo dopo passo le procedure da seguire per ottenere risultati accurati.
Questo protocollo può essere usato con molti tipi di materiali tagliati in forme di disco del diametro di 10 mm. Materiali fragili possono essere gonfiati in un solvente adatto per 1 h rendere più facile il processo di taglio. Così, materiali idrofili quali alginati possono essere idratate in acqua distillata in autoclave. Altri solventi, quali etanolo, chetone, diclorometano e possono essere impiegati a gonfiarsi materiali idrofobi per 1 h prima di tagliarli. Tuttavia, non è necessario che alcuni materiali come poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) essere gonfio e possono essere tagliate direttamente. Dopo di che, è molto importante asciugare i dischi di materiale campione in un forno sottovuoto e sterilizzare ogni esemplare con etanolo e raggi UV per 1 h per evitare qualsiasi rischio di contaminazione.
Questo protocollo raccomanda TSA e TSB come terreni di coltura e l’uso di colture pure di 3 microrganismi per raggiungere un’ampia gamma di microrganismi: i batteri Gram-positivi Staphylococcus aureus, i batteri gram-negativi Escherichia coli, e il lievito Candida albicans. Tuttavia, media alternativi di cultura e altri microrganismi che hanno bisogno di condizioni di incubazione diversi potrebbero essere usati anche con questo protocollo. A volte, solo 1 microorganismo è testato per avere un’idea iniziale dell’attività antimicrobica di un nuovo materiale.
I materiali mostrando forte attività antimicrobica contro i consigliati 3 diversi tipi di microrganismi devono essere testati anche contro gli agenti patogeni antibiotico-resistenti come meticillina-resistente Staphylococcus epidermidis (MRSE), che sono stati utilizzati con successo con questo protocollo. Altri importanti microrganismi farmaco-resistenti che sono causa di molta preoccupazione sono i gram-positivi meticillino-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) e vancomicina-resistenti enterococchi (VRE) e il gram-negativi Pseudomonas aeruginosa40,41.
Inibizione di biofilm e l’attività antimicrobica dei materiali contro altri tipi di microrganismi come virus e parassiti non possono essere testati con questo protocollo. Tuttavia, questo protocollo fornisce un punto di partenza molto utile per uno studio antimicrobico di un nuovo materiale avanzato.
Nel test di diffusione disco antimicrobico agar, un passaggio critico si verifica quando il disco campione deve essere posto al centro della piastra perché alcuni materiali piegare appena contatto con i media di agar. In questo caso, è consigliabile utilizzare una coppia sterile di pinzette per spiegare accuratamente il campione. D’altra parte, nel metodo di contatto, è fondamentale per il controllo di lavare e dischi di campione molto bene con PBS pipettando li quattro volte seguita da una vigorosa agitazione e sonicazione per non garantire che nessun microrganismi vitali rimangono aderiti al materiale superficie.
Questo video protocollo può essere utilizzato in molte applicazioni di bioingegneria, quali ingegneria dei bioprocessi, ingegneria tissutale, controllata di farmaci, materiali da imballaggio, trattamento delle acque reflue e l’agricoltura, che utilizzare biomateriali con un altamente capacità antimicrobica desiderabile.
I risultati ottenuti con questo protocollo sono qualitativi (le immagini) e quantitativa (la larghezza normalizzata di antibatterico “halo” e la perdita di attuabilità) con una buona analisi della sua riproducibilità (media ± deviazione standard). Quando si confrontano diversi materiali, questi valori medi ottenuti con l’analisi di risultati metodo di diffusione e contatto devono essere analizzati da One-way ANOVA, seguita da analisi post hoc, della Turchia, al fine di studiare se essi sono, statisticamente, significativamente differenti (p < 0,01).
The authors have nothing to disclose.
Gli autori si desidera ringraziare la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir per il supporto finanziario per questo lavoro attraverso la 001UCV-231-2017 e 2018-231-001UCV concede.
Cylindrical punch | 10 mm diameter | ||
Petri dishes | soria genlab | P101 | 90 mm diameter, sterile |
Tryptic soy agar (TSA) | Liofilchem | 610052 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Tryptic soy broth (TSB) | Liofilchem | 610053 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Sterile cotton swab | EUTOTUBO | 300200 | |
Centrifuge tubes | VIDRA FOC, SA | 429900 | 50 mL, sterile |
Ethanol | VWR | 83813360 | Absolute ethanol |
Sterile 48-wells plate | COSTAR | 3548 | Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene |
A pair of tweezers | BRAUN | 24612036 | Toothless |
Sterile phosphate buffered saline (PBS). | VWR | E404-100TAPBS | |
Vaccum oven with a connected vacuum pump | JP Selecta, SA | 5900620 | |
Laminar flow hood | TELSTAR Technologies, SL | TELSTAR AH-100 | 12.0 W lamp of UV-C radiation |
Class II Biological safety cabinet | LABOGENE | MARS 1200 | |
Incubator | ASTEC CO, LTD | SCA-165DR | |
Vortex mixer | Biosan | V-1 Plus | |
Spectrophotometer | Macherey-Nagel, Germany | Nanocolor UV/VIS II | |
Bunsen burner | JP Selecta, SA | 7001539 | |
Alcohol burner | VIDRA FOC, SA | 1658/20 | In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet |
Orbital shaker | sartorius stedim | 8864845 | |
Sonicator | SELECTA | 3000617 | 50/60 Hz |
Digital calliper | ACHA | 17-260 | 0-150 mm |
Serological pipette | Fisherbrand | 13-678-11 | 25 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-4950 | 5 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-5541 | 10 mL, sterile |
Micropipette | GILSON | FA10005P | Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL |
Micropipette | GILSON | F123602 | Pipetman P1000, 200-1000 µL |
Micropipette | GILSON | FA10016 | Pipetman L P12X300L, 20-300 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-200-960 | 2-200 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-1K0-480 | 100-1000 µL |
Pre-sterilized tube | INSULAB | 301402 | 10 mL |
Photo camera | Canon EOS 5D | Any camera with high resolution can also be utilized | |
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus | strain V329 | Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9), 2888–2896 (2001) | |
Gram-negative bacteria Escherichia coli | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 101 | |
Yeast Candida albicans | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 1394 | |
Microcentrifuge tubes | DASLAB | 175508 | 1,5 mL |
Autoclave | JP Selecta, SA | 4002136 | |
Spectrophotometer-cuvettes | UVAT Bio CB | F-0902-02 | 4,5 mL |
Drigalski spatula | LABBOX | SPRP-L05-1K0 | Sterile, disposable |
glass balls (2 mm diameter) | Hecht Karl | 1401/2 | Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula |
Autoclave bags | DELTALAB | 200318 | To sterilize microbiological residues or contaminated material |
Electronic pipette filling device | JetPip | JET BIOFIL | |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-100-010 | 100 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-250-010 | 250 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-500-010 | 500 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-1K0-010 | 1000 mL, for autoclaving culture media |
Latex gloves | DENIA | 2278000000 | |
Indicator tape for sterilization | LABBOX | STAP-A55-001 | Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process. |
Universal test tube rack | LABBOX | MTSP-001-001 | To hold centrifuge tubes |
Microcentrifuge tube rack | VWR | 211-0210 | To hold microcentrifuge tubes |
Sterile loop | ACEFE S.A. | 100140055 | 10 µL of capacity for microbial culture |
Material M1 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 1 | |
Material M2 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 2 | |
Material M3 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type3 | |
Material M4 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 4 | |
Material C | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Control material |