Vi presenterar ett protokoll för antimikrobiell karakterisering av avancerade material. Här, antimikrobiella aktivitet på materiella ytor mäts genom två metoder som kompletterar varandra: en är baserad på agar disk diffusion test, och den andra är ett standardförfarande baserat på ISO 22196:2007 normen.
Utveckling av nya avancerade material med förbättrade egenskaper blir mer och mer viktigt i en brett användningsområde bioteknik. Många nya biomaterial är således utformas för att efterlikna specifika miljöer krävs för biomedicinska tillämpningar såsom vävnadsteknik och kontrollerad narkotika leverans. Utveckling av material med förbättrade egenskaper för immobilisering av celler eller enzymer är också ett aktuellt forskningsområde i bioprocess engineering. En av de mest önskvärda egenskaperna av ett materiellt i dessa applikationer är dock antimikrobiell kapacitet att undvika eventuella oönskade infektioner. För detta presenterar vi lätt-till-följa protokoll för antimikrobiell karakterisering av material baserade på a agar disk diffusion test (diffusion metod) och (ii) ISO 22196:2007 normen att mäta antimikrobiella aktivitet på materiella ytor (kontakt metod). Detta protokoll måste utföras med hjälp av grampositiva och gramnegativa bakterier och jäst för att täcka ett brett spektrum av mikroorganismer. Som ett exempel testas 4 material med olika kemiska natur efter detta protokoll mot stafylokocker, Escherichia colioch Candida albicans. Resultaten av dessa tester uppvisar icke-antimikrobiell aktivitet för första materialet och öka antibakteriell aktivitet mot grampositiva och gramnegativa bakterier för de andra 3 material. Ingen av de 4 material är dock kunna hämma tillväxten av Candida albicans.
Implantat misslyckande är ofta en följd av mikrobiella infektioner som uppstår trots antimikrobiell profylax och aseptiska förhållanden. Problemet orsakar mycket höga sjukvårdskostnader och är beklämmande bland patienter1. Viktigt bakterier såsom stafylokocker är för närvarande anses mycket farliga patogener i nosokomiala infektioner associerade med katetrar och andra medicinska implantat och de viktigaste föroreningarna av medicinska instrument2. Utvecklingen av nya antimikrobiella strategier behövs därför snarast för både daglig och medicinska användningsområden.
Antimikrobiella medel inkluderar antibiotika3, Kvartära ammoniumföreningar4, joner/metalloxider5och antimikrobiella peptider (ampere)6. Antibiotika gradvis blir mindre effektiva på grund av bakteriell resistens7, som är på uppgång på grund av antibiotika överanvändning8. Kvartära ammoniumföreningar är bara mycket effektiva för en kortvarig användning på grund av mikrobiell resistens9. Joner/metalloxider har länge använts som mycket effektiva antimikrobiella medel och används i många vanliga kommersiella produkter inklusive bandage, vattenfilter, färger, etc.10,11,12. Det har dock visats att dessa typer av föreningar kan vara giftigt för vissa typer av däggdjursceller13.
Ampere visar utmärkt antimikrobiella och immunmodulerande egenskaper14,15, och bakterier verkar få det mycket svårt att utveckla ett motstånd mot dem16. Processen för att producera ren ampere är dock dyra; Därför är en storskalig produktion inte lönsamt. Således utvecklat strategier för att motverka problemen i producerar ampere har varit (t.ex., små molekylära antibakteriella peptoid härmar17, peptoids18, α-peptider19 och β-peptider20). Form-slutade polypeptider och polypeptoids har syntetiserats för antimikrobiella och antifouling coatings21.
Utvecklingen av nya antimikrobiella medel såsom avancerade material i ren eller hybridform, kunna förebygga och behandla multiresistenta infektioner, blir alltmer nödvändigt. Ett brett utbud av nya avancerade material för många bioengineering fält såsom vävnad och bioprocess konstruktion har utvecklats med förbättrad kemiska och fysikaliska egenskaper i de sista årtiondena genom flera metoder: plasma-polymerisation ympning på en hydrofob substrat22,23,24, skräddarsy crosslinking densitet25,26, polymerisation i lösning27,28,29 , 30, porogen upplösning31,32, och vid inkorporeringen av nanomaterial som grafen oxid (gå)33,34,35,36 och Carbon nanofibrer (CNFs)37.
Studien av dessa nya material antimikrobiell kapacitet exponentiellt kunde öka deras potentiella bioengineering tillämplighet och har därför blivit nödvändigt. Vi presenterar ett lätt-att-följa-protokoll för att kvantifiera den antimikrobiella aktiviteten av sådana nya avancerade material. Här, efter provberedningen, två kompletterande metoder följs: först bygger på agar disk diffusion test38 (diffusion metod) och andra är baserad på den ISO 22196:2007 norm39 att mäta antimikrobiella aktivitet på material ytor (kontakt metod).
Antimikrobiella aktivitet av nya avancerade material kan analyseras med lätt att följa protokollet bestående av 2 kompletterande förfaranden som grundas på 2 befintliga metoder: agar disk diffusion testa38 och antimikrobiella aktivitet mätas på material ytor enligt ISO 22196:2007 norm39.
I detta forskningsområde är många av de antimikrobiella tester som rapporterats i litteraturen starkt beroende av analysens. Därför är det mycket viktigt att ha detaljerade och konsekvent protokoll på plats över laboratorier. Denna artikel är ett steg i den riktningen. Dessutom kan det vara mycket bra för många forskare som är mindre erfaren inom detta område och kräver djupgående, stegvisa procedurer att följa för korrekta resultat.
Detta protokoll kan användas med många typer av material som skär i disk former av 10 mm diameter. Spröda material kan vara svullna i lämpligt lösningsmedel för 1 h att göra bearbetningsprocessen lättare. Hydrofila material såsom alginater kan således vara hydrerade i Ånghärdad destillerat vatten. Andra lösningsmedel, såsom etanol, keton och diklormetan, kan vara anställd att svälla hydrofoba material för 1 h innan du skär dem. Men vissa material såsom poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) behöver inte vara svullen och kan kapas direkt. Efter det är det mycket viktigt att torka prov material diskarna i vakuumugn och sterilisera varje prov med etanol och UV-strålning för 1 h för att undvika kontaminering.
Detta protokoll rekommenderar TSA och TSB som kultur media och användning av rena kulturer av 3 mikroorganismer att nå ett brett spektrum av mikroorganismer: grampositiva bakterier Staphylococcus aureus, gramnegativa bakterien Escherichia coli, och jästen Candida albicans. Alternativa kultur media och andra mikroorganismer i behov av olika inkubationsförhållanden kan dock också användas med detta protokoll. Ibland är endast 1 mikroorganism testat för att ha en idé av den antimikrobiella aktiviteten i ett nytt material.
De material som visar stark antimikrobiella aktivitet mot den rekommendera 3 olika typer av mikroorganismer bör också testas mot antibiotikaresistens patogener såsom meticillinresistenta Staphylococcus epidermidis (MRSE), som har använts framgångsrikt med detta protokoll. Andra viktiga resistenta mikroorganismer som orsakar mycket oro är den grampositiva meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) och vankomycinresistenta enterokocker (VRE) och den gramnegativa Pseudomonas aeruginosa40,41.
Biofilm hämning och antimikrobiell aktivitet av material mot andra typer av mikroorganismer som virus och parasiter kan inte testas med detta protokoll. Men ger detta protokoll en mycket bra utgångspunkt för en antimikrobiell studie av en ny avancerad material.
I antimikrobiell agar disk diffusion test inträffar ett kritiskt steg när provet disken måste placeras i mitten av plattan eftersom vissa material vik så snart de komma i kontakt med agar media. I detta fall är det rekommenderat att använda ett sterila par pincett att veckla försiktigt ut provet. Däremot, i kontakt-metoden är det viktigt att tvätta kontroll och prov diskar mycket väl med PBS av pipettering dem fyra gånger följt av en kraftig vortexa och ultraljudsbehandling för att säkerställa att inga livsdugliga mikroorganismer förbli vidhäftat till materialet yta.
Detta video protokoll kan användas i många bioengineering applikationer, såsom bioprocess engineering, vävnadsteknik, kontrollerad narkotika leverans, förpackningsmaterial, avloppsvatten och jordbruk, som använder biomaterial med en mycket önskvärda antimikrobiell kapacitet.
Resultat av detta protokoll är kvalitativa (bilderna) och kvantitativa (normaliserade bredden på antibakteriella ”Hålön” och förlusten av livskraft) med en bra analys av dess reproducerbarhet (medelvärde ± standardavvikelse). När man jämför olika material, måste dessa medelvärden som erhållits med diffusion och kontakt metod resultat analys analyseras med envägs ANOVA, följt av Turkiets post hoc analys, för att studera om de är statistiskt signifikant olika (p < 0,01).
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna det Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir för ekonomiskt stöd för detta arbete genom den 2017-231-001UCV och 2018-231-001UCV bidrag.
Cylindrical punch | 10 mm diameter | ||
Petri dishes | soria genlab | P101 | 90 mm diameter, sterile |
Tryptic soy agar (TSA) | Liofilchem | 610052 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Tryptic soy broth (TSB) | Liofilchem | 610053 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Sterile cotton swab | EUTOTUBO | 300200 | |
Centrifuge tubes | VIDRA FOC, SA | 429900 | 50 mL, sterile |
Ethanol | VWR | 83813360 | Absolute ethanol |
Sterile 48-wells plate | COSTAR | 3548 | Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene |
A pair of tweezers | BRAUN | 24612036 | Toothless |
Sterile phosphate buffered saline (PBS). | VWR | E404-100TAPBS | |
Vaccum oven with a connected vacuum pump | JP Selecta, SA | 5900620 | |
Laminar flow hood | TELSTAR Technologies, SL | TELSTAR AH-100 | 12.0 W lamp of UV-C radiation |
Class II Biological safety cabinet | LABOGENE | MARS 1200 | |
Incubator | ASTEC CO, LTD | SCA-165DR | |
Vortex mixer | Biosan | V-1 Plus | |
Spectrophotometer | Macherey-Nagel, Germany | Nanocolor UV/VIS II | |
Bunsen burner | JP Selecta, SA | 7001539 | |
Alcohol burner | VIDRA FOC, SA | 1658/20 | In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet |
Orbital shaker | sartorius stedim | 8864845 | |
Sonicator | SELECTA | 3000617 | 50/60 Hz |
Digital calliper | ACHA | 17-260 | 0-150 mm |
Serological pipette | Fisherbrand | 13-678-11 | 25 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-4950 | 5 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-5541 | 10 mL, sterile |
Micropipette | GILSON | FA10005P | Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL |
Micropipette | GILSON | F123602 | Pipetman P1000, 200-1000 µL |
Micropipette | GILSON | FA10016 | Pipetman L P12X300L, 20-300 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-200-960 | 2-200 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-1K0-480 | 100-1000 µL |
Pre-sterilized tube | INSULAB | 301402 | 10 mL |
Photo camera | Canon EOS 5D | Any camera with high resolution can also be utilized | |
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus | strain V329 | Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9), 2888–2896 (2001) | |
Gram-negative bacteria Escherichia coli | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 101 | |
Yeast Candida albicans | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 1394 | |
Microcentrifuge tubes | DASLAB | 175508 | 1,5 mL |
Autoclave | JP Selecta, SA | 4002136 | |
Spectrophotometer-cuvettes | UVAT Bio CB | F-0902-02 | 4,5 mL |
Drigalski spatula | LABBOX | SPRP-L05-1K0 | Sterile, disposable |
glass balls (2 mm diameter) | Hecht Karl | 1401/2 | Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula |
Autoclave bags | DELTALAB | 200318 | To sterilize microbiological residues or contaminated material |
Electronic pipette filling device | JetPip | JET BIOFIL | |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-100-010 | 100 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-250-010 | 250 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-500-010 | 500 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-1K0-010 | 1000 mL, for autoclaving culture media |
Latex gloves | DENIA | 2278000000 | |
Indicator tape for sterilization | LABBOX | STAP-A55-001 | Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process. |
Universal test tube rack | LABBOX | MTSP-001-001 | To hold centrifuge tubes |
Microcentrifuge tube rack | VWR | 211-0210 | To hold microcentrifuge tubes |
Sterile loop | ACEFE S.A. | 100140055 | 10 µL of capacity for microbial culture |
Material M1 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 1 | |
Material M2 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 2 | |
Material M3 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type3 | |
Material M4 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 4 | |
Material C | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Control material |