Summary
Vi presenterar ett protokoll för antimikrobiell karakterisering av avancerade material. Här, antimikrobiella aktivitet på materiella ytor mäts genom två metoder som kompletterar varandra: en är baserad på agar disk diffusion test, och den andra är ett standardförfarande baserat på ISO 22196:2007 normen.
Abstract
Utveckling av nya avancerade material med förbättrade egenskaper blir mer och mer viktigt i en brett användningsområde bioteknik. Många nya biomaterial är således utformas för att efterlikna specifika miljöer krävs för biomedicinska tillämpningar såsom vävnadsteknik och kontrollerad narkotika leverans. Utveckling av material med förbättrade egenskaper för immobilisering av celler eller enzymer är också ett aktuellt forskningsområde i bioprocess engineering. En av de mest önskvärda egenskaperna av ett materiellt i dessa applikationer är dock antimikrobiell kapacitet att undvika eventuella oönskade infektioner. För detta presenterar vi lätt-till-följa protokoll för antimikrobiell karakterisering av material baserade på a agar disk diffusion test (diffusion metod) och (ii) ISO 22196:2007 normen att mäta antimikrobiella aktivitet på materiella ytor (kontakt metod). Detta protokoll måste utföras med hjälp av grampositiva och gramnegativa bakterier och jäst för att täcka ett brett spektrum av mikroorganismer. Som ett exempel testas 4 material med olika kemiska natur efter detta protokoll mot stafylokocker, Escherichia colioch Candida albicans. Resultaten av dessa tester uppvisar icke-antimikrobiell aktivitet för första materialet och öka antibakteriell aktivitet mot grampositiva och gramnegativa bakterier för de andra 3 material. Ingen av de 4 material är dock kunna hämma tillväxten av Candida albicans.
Introduction
Implantat misslyckande är ofta en följd av mikrobiella infektioner som uppstår trots antimikrobiell profylax och aseptiska förhållanden. Problemet orsakar mycket höga sjukvårdskostnader och är beklämmande bland patienter1. Viktigt bakterier såsom stafylokocker är för närvarande anses mycket farliga patogener i nosokomiala infektioner associerade med katetrar och andra medicinska implantat och de viktigaste föroreningarna av medicinska instrument2. Utvecklingen av nya antimikrobiella strategier behövs därför snarast för både daglig och medicinska användningsområden.
Antimikrobiella medel inkluderar antibiotika3, Kvartära ammoniumföreningar4, joner/metalloxider5och antimikrobiella peptider (ampere)6. Antibiotika gradvis blir mindre effektiva på grund av bakteriell resistens7, som är på uppgång på grund av antibiotika överanvändning8. Kvartära ammoniumföreningar är bara mycket effektiva för en kortvarig användning på grund av mikrobiell resistens9. Joner/metalloxider har länge använts som mycket effektiva antimikrobiella medel och används i många vanliga kommersiella produkter inklusive bandage, vattenfilter, färger, etc.10,11,12. Det har dock visats att dessa typer av föreningar kan vara giftigt för vissa typer av däggdjursceller13.
Ampere visar utmärkt antimikrobiella och immunmodulerande egenskaper14,15, och bakterier verkar få det mycket svårt att utveckla ett motstånd mot dem16. Processen för att producera ren ampere är dock dyra; Därför är en storskalig produktion inte lönsamt. Således utvecklat strategier för att motverka problemen i producerar ampere har varit (t.ex., små molekylära antibakteriella peptoid härmar17, peptoids18, α-peptider19 och β-peptider20). Form-slutade polypeptider och polypeptoids har syntetiserats för antimikrobiella och antifouling coatings21.
Utvecklingen av nya antimikrobiella medel såsom avancerade material i ren eller hybridform, kunna förebygga och behandla multiresistenta infektioner, blir alltmer nödvändigt. Ett brett utbud av nya avancerade material för många bioengineering fält såsom vävnad och bioprocess konstruktion har utvecklats med förbättrad kemiska och fysikaliska egenskaper i de sista årtiondena genom flera metoder: plasma-polymerisation ympning på en hydrofob substrat22,23,24, skräddarsy crosslinking densitet25,26, polymerisation i lösning27,28,29 , 30, porogen upplösning31,32, och vid inkorporeringen av nanomaterial som grafen oxid (gå)33,34,35,36 och Carbon nanofibrer (CNFs)37.
Studien av dessa nya material antimikrobiell kapacitet exponentiellt kunde öka deras potentiella bioengineering tillämplighet och har därför blivit nödvändigt. Vi presenterar ett lätt-att-följa-protokoll för att kvantifiera den antimikrobiella aktiviteten av sådana nya avancerade material. Här, efter provberedningen, två kompletterande metoder följs: först bygger på agar disk diffusion test38 (diffusion metod) och andra är baserad på den ISO 22196:2007 norm39 att mäta antimikrobiella aktivitet på material ytor (kontakt metod).
Protocol
1. provberedning
- Skär materialprov i 10 mm diameter diskar med en 10 mm diameter cylindriska punch.
Obs: Spröda material kan mjukas upp i lämpliga sterila lösningsmedel för 1 h och sedan skär i skivor. Till exempel hydrofila material såsom zink alginat testades efter detta protokoll och var fuktad i Ånghärdad vatten innan du skär dem för att undvika prov bryta. Andra hydrofoba material såsom poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) behöver dock inte någon form av tidigare svullnad för att skäras korrekt. - Torka prov material diskarna vid 60 ° C i vakuumugn (< 10-2 Torr) för 24 h.
Obs: Vissa material kan behöva en hög torkning temperatur. Det är dock viktigt att inte uppnår en temperatur som termiskt kan försämra materialet. - Mäta de materiella filmar tjocklekar med en digital skjutmått.
Obs: Detta protokoll rekommenderar utnyttjandet av materiella filmer med konstant och liknande tjocklekar när man jämför antimikrobiella aktivitet av olika material. - Sterilisera varje prov genom nedsänkning i etanol 70% för 10 min och efterföljande ultraviolett (UV) strålning för 1 h per varje sida.
Obs: UV-strålning kan utföras att placera varje prov i en steril petriskål inuti en LAF med en 12.0 W lampa av UV-C-strålning.
FÖRSIKTIGHET: Forskare bör inte utsätta sig för UV-strålning, eftersom det är mutagena. - Utför steg 1.1, 1.2, 1.3 och 1.4. med kontroll material diskar.
Obs: Polyetentereftalat (PET) eller alternativa icke antimikrobiellt material kunde användas som kontroll diskar i metoden diffusion och kontakt. Dessutom när kännetecknar nanokompositer eller behandlade material, bör grundmaterialet användas som kontrollmaterial.
2. Rekommenderad mikroorganismer
Obs: Vi rekommenderar användning av 3 olika mikroorganismer att studera antimikrobiell kapacitet av testade material mot ett brett spektrum av mikroorganismer.
- Använd rena kulturer av 3 mikroorganismer: de grampositiva bakterierna Staphylococcus aureusoch gramnegativa bakterien Escherichia colijästen Candida albicans.
Obs: Andra mikroorganism arter kan också testas med detta protokoll genom att ändra villkoren för inkubation vid behov.
FÖRSIKTIGHET: Krävs biosäkerhet mätningarna måste följas beroende på typ av mikroorganism som anställd i detta protokoll. - Arbeta med pre sterila eller autoklaveras material och använda en bunsenbrännare under hela processen av mikrobiell manipulation eller en biologisk säkerhet skåp (om nödvändigt) att säkerställa aseptiska förhållanden.
Obs: Rekommenderade autoklav villkor är 121 ° C under 15 min för kultur medier och 121 ° C under 20 min för arbetsmaterial och biologiska rester.
3. agar Disk Diffusion Test (Diffusion metod)
Obs: När en flytande diffusion av antimikrobiella föreningar kan vara den viktigaste antimikrobiella mekanismen av avancerade material, metoden diffusion kan ge mycket värdefull information om antimikrobiell kapacitet av dessa material. Den materiella disken ligger i centrum av agarplattan kan bilda en genomskinlig ring zon (halo) där en tillväxthämning av mikroorganismer uppstår efter 24 h av kultur (se figur 1).
-
Diffusion testförfarande
- Förbereda och autoklav tryptic soy agar (TSA) efter tillverkarens anvisningar.
- Häll TSA i sterila petriskålar under aseptiska förhållanden med hjälp av en bunsenbrännare eller en LAF.
Obs: TSA plattorna måste vara 4 – 6 mm tjockt. - Kultur i olika mikroorganismer ska testas aerobt för 18 – 24 h i Petriskålarna med TSA i en inkubator vid 37 ° C.
- Förbereda och autoklav tryptic soy buljong (TSB) efter tillverkarens anvisningar.
- Häll TSB i ett 50 mL steriliserat centrifugrör med försteriliserade serologiska pipett under aseptiska förhållanden med hjälp av en bunsenbrännare eller en LAF.
- Återsuspendera några kolonier från steg 3.1.3 i 25 mL av TSB som ingår i ett sterilt centrifugrör med hjälp av en steril bomullspinne och vortex dem för 1 min att uppnå en enhetlig blandning.
- Justera absorbans (vid 540 nm) av kulturen med en spektrofotometer med lämpliga antalet kolonibildande enheter (CFU) per mL: ca 1,5 x 108 CFU/mL bakterier och från 1 x 106 till 5 x 106 CFU/mL för jäst.
Obs: Kultur och kyvetten volymerna att mäta absorbansen måste väljas beroende på typ av spektrofotometer som används. - Vortex mikrobiell buljong i 5 sekunder för att förbättra den mikroorganism spridningen och kort dränka en steril bomullspinne i denna mikrobiella suspension. Ta bort överskottet av vätska från pinnen genom att trycka den mot rörväggen som innehåller kultur.
- Jämnt strimma mikrobiell buljong fjädringen med den steril bomullspinne på ytan av TSA plattorna i 3 plan att täcka hela ytan med mikroorganism och låt den torka i 5 min efter inympningen.
Obs: För att avlägsna fukt, TSA plattorna placeras öppet i inverterat läge vid 37 ° C i 10 – 15 min före inokuleringen. - Sterilisera ett par pincett genom att doppa dem i en bägare med etanol 96% och sedan flammande dem med en bunsenbrännare eller spritbrännaren.
- Placera provet diskarna för att testas och kontrollera disk i mitten av TSA plattorna med hjälp av para av steril pincett.
- Inkubera aerobt TSA plattorna i en inverterad position vid 37 ° C under 24 h.
Obs: För att undvika kontaminering, rekommenderas att ruva TSA plattorna i inverterat läge. Men om provet disken lossnar från TSA plattorna, utför inte detta steg i inverterat läge. I detta fall rekommenderas det att torka plattorna i LAF. Detta antimikrobiella test måste utföras minst i quadriplicate på olika dagar för att säkerställa reproducerbarhet.
-
Kontroll av mikrobiell suspension koncentration och renhet
Obs: Följande steg är nödvändiga för att kontrollera att mikrobiell koncentration bestäms med spektrofotometer i steg 3.1.7 är korrekt och att det fanns ingen mikrobiell kontaminering från miljön. En mikrobiell kontaminering från miljön kan enkelt upptäckas genom uppkomsten av olika typer av mikrobiell kolonier efter 24 h av kultur. Dessutom säkerställas ingen mikrobiell kontamination av TSB medium under dess behandlig i de decimala seriespädningar med en negativ TSB kontrollplattan.- Fördela den sterila TSB (bereddes i steg 3.1.4) i steril mikrocentrifugrör med hjälp av en mikropipett med lämplig Ånghärdad tips under aseptiska förhållanden. En av dem kommer att kunna utnyttjas som en negativ TSB-kontroll.
- Utföra decimal seriespädningar med mikrobiell buljong fjädringen utnyttjas i steg 3.1.9 i sterila mikrocentrifugrör innehållande TSB.
- Sprida 100 µL av varje utspädning på TSA tallrikar använder försteriliserade Drigalski spatel eller ett alternativt instrument. Även Sprid 100 μL av TSB medium utan mikroorganism (bereddes i steg 3.2.1) på en TSA-platta som en negativ TSB kontrollplattan.
- Inkubera aerobt TSA plattorna aerobt vid 37 ° C under 24 h.
- Räkna antalet kolonier att kontrollera att de CFU/mL är liknande den som anges i steg 3.1.7.
- Kontrollera att det finns ingen mikrobiell kontaminering från miljön på TSA plattorna med endast en typ av kolonier.
- Kontrollera att det finns ingen mikrobiell kontamination på TSB negativ kontrollplattan visar inga kolonier
4. mätning av antimikrobiell aktivitet på materiella ytor (kontakt metod)
Obs: När kontakt kan vara den viktigaste antimikrobiella mekanismen av några avancerade material, kontaktmetoden kan ge mycket användbar information om antimikrobiell kapacitet av dessa material. I denna metod, mikroorganismerna är placerade direkt på materialets yta och deras tillväxthämning kan bestämmas efter en viss tid.
-
Ursprungliga förfarandet
- Förbereda och autoklavera TSB efter tillverkarens anvisningar.
- Häll TSB i ett 50 mL steriliserat centrifugrör med försteriliserade serologiska pipett under aseptiska förhållanden med hjälp av en bunsenbrännare eller en LAF.
- Kultur i olika mikroorganismer ska testas aerobt övernattning i röret med TSB i orbitalskak (140 rpm) vid 37 ° C.
- Späd den nattliga kulturen i 20 mL TSB i ett steriliserat centrifugrör 50 mL till en koncentration på cirka 106 CFU/mL (bestäms med en spektrofotometer vid 540 nm).
Obs: Kultur och kyvetten volymerna att mäta absorbansen måste väljas beroende på typ av spektrofotometer som används. - Utföra decimal seriespädningar av denna kultur i sterila mikrocentrifugrör innehållande TSB. Sprida 100 µL av kulturen på TSA tallrikar och inkubera det aerobt vid 37 ° C under 24 h.
- Räkna antalet kolonier att säkerställa en initial cell koncentration av cirka 1 x 106 CFU/mL
- Plats 4 kontroll diskar för mikrobiell inventering efter 24 h och 4 prov diskar av varje typ av de testa materialen för mikrobiell räknar efter 24 h i separerar brunnar i en steril 48-väl-plattan.
- Pipettera 150 µL av mikrobiell upphängning på varje disk yta.
-
Mikrobiell räknar kontroll och testade material (efter 24 h)
- Efter steg 4.1.6 aerobt Inkubera 4 prov diskarna kvar i 48-väl plattan vid 37 ° C under 24 h.
Observera: Denna 24 h inkubationstiden kan ändras för att studera tillväxthämning på kortare eller längre tider. - Efter 24 h inkubation, Pipettera 850 µL sterilt PBS på ytan av 4 prov diskarna och blanda det med de 150 µL av den mikrobiella suspensionen.
- Samla in PBS/mikrobiell suspension blandningen och varje disk från 48-väl plattan och överföra dem till en 10 mL steriliserat röret.
- Vortex PBS/mikrobiell suspension blandningen och varje disk för 1 min, Sonikera det vid 50 Hz för 5 min och vortex det igen för 1 min att säkerställa att inga livsdugliga mikroorganismer förblir anslutit sig till materialets yta.
- Utföra decimal seriespädningar av varje sonicated kultur i sterila mikrocentrifugrör innehållande TSB och sprida 100 µL av kulturen på TSA tallrikar och inkubera det aerobt vid 37 ° C under 24 h.
- Räkna antalet kolonier, som är antalet livsdugliga mikroorganismer på varje prov och kontroll disken yta. Uttrycka detta antalet livskraftiga celler i (CFU/mL).
- Ta ett fotografi av den slutliga mikrobiella kulturen för prov och kontroll diskar.
- Efter steg 4.1.6 aerobt Inkubera 4 prov diskarna kvar i 48-väl plattan vid 37 ° C under 24 h.
5. antimikrobiella resultat analys
Figur 1: mätningar för normaliserade bredden av det antimikrobiella medlet uteslutande ”halo”. I denna panel visas diametern på zonen hämning (diz) och disk diameter (d). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
-
Diffusion metod resultat analys
- Mät diametern på zonen hämning (diz) och disk diameter (d) (se figur 1) med en digital skjutmått.
Obs: Hämning zon eller antimikrobiella ”halo” bildas till följd av mikrobiell tillväxthämning produceras av antimikrobiell materiella disken (se figur 1). Det är möjligt att konstatera att det är en genomskinlig ring zon nära provet i jämförelse med resten av plattan där mikroorganismerna har växt ordentligt (ogenomskinlig zon). - Bestämma normaliserade bredden på det antimikrobiella medlet uteslutande ”halo” (nwhalo) av varje disk genom att använda ekvation (1).
(1)
- Bestämma medelvärdet och standardavvikelsen av antimikrobiell ”halo” med 4 bestäms nwhalo värdena för varje prov normaliserade bredd.
- Ta ett fotografi av den slutliga mikrobiella kulturen med den materiella disken.
Obs: Diametern på zonen hämning (diz) och disk diameter (d) kan också mätas från den fotografi taget i steg 5.1.4 med hjälp av en lämplig bildbehandlingsprogram.
- Mät diametern på zonen hämning (diz) och disk diameter (d) (se figur 1) med en digital skjutmått.
-
Kontaktmetod resultat analys
- Bestämma antalet livsdugliga mikroorganismer återvinnas enligt ekvation (2).
(2)
Obs: Här, N är antalet livsdugliga mikroorganismer återvinnas per cm2 per provkroppen; C är plate count; D är utspädningsfaktorn; A är ytan av provstycket i cm2 bestäms med prov disk diameter. - Fastställa förlusten av livskraft (LV) att återspegla hämning av celltillväxt genom att använda ekvation (3).
(3)
Obs: Här, C är det genomsnittliga antalet livsdugliga mikroorganismer (N) i CFU/mL•cm2, återhämtade sig från kontroll exemplaren efter 24 h; S är antalet livsdugliga mikroorganismer (N) i CFU/mL•cm2, återhämtade sig från provstyckena efter 24 h. - Bestämma medelvärdet och standardavvikelsen för förlusten av livskraft med 4 beslutsamma LV(%) värdena för varje prov.
- Bestämma antalet livsdugliga mikroorganismer återvinnas enligt ekvation (2).
Representative Results
Detta protokoll var anställd, som ett exempel, att testa antimikrobiell kapacitet 4 material med olika kemiska natur mot 3 rekommenderas mikroorganismer: stafylokocker, Escherichia colioch Candida albicans . Resultaten av agar disk diffusion testerna (diffusion method) uppvisade icke antimikrobiellt aktivitet för det första materialet (M1) som det inträffade i kontroll disk (C, inte bilden) och öka antibakteriell aktivitet mot grampositiva och gramnegativa bakterier för de andra 3 material M2, M3 och M4 (se figur 2).
Figur 2: antimikrobiella diffusion metod resultat. I denna panel visas metoden antimikrobiella diffusion för 4 material (M1, M2, M3 och M4) diskar (10 mm diameter x 1 mm tjocklek) mot S. aureus och E. coli efter 24 h inkubation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 visar de olika normaliserade bredderna av det antimikrobiella medlet uteslutande ”halo” (nwhalo) för olika exempel material M1, M2, M3 och M4 mot grampositiva och gramnegativa bakterier beräknas med ekvation (1). Ingen av de 4 material var dock kunna hämma tillväxten av jästsvampen Candida albicans (bilder inte visas).
Figur 3: antimikrobiella diffusion ”halo” resultat. I denna panel visas de normaliserade ”halon” (nwhalo) för varje materiell (M1, M2, M3 och M4) disk (10 mm diameter x 1 mm tjocklek) mot S. aureus och E. coli efter 24 h inkubation. Skillnaderna är statistiskt signifikanta (p < 0,01). Men uppvisade provet M1 ingen antimikrobiell aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Resultaten av kontaktmetoden också uppvisade icke antimikrobiellt aktivitet för det första materialet (M1) som det inträffade i kontroll disk (C) och ökande antibakteriell aktivitet mot Grampositive och gramnegativa bakterier för de andra 3 material (se (Se figur 4).
Figur 4: antimikrobiella kontakta metod resultat. I denna panel visas respektive 90 mm plåtar 4 material (M1, M2, M3 och M4) ytan antimikrobiell aktivitet analysen enligt de ISO-22196:2007 efter 24 h inkubation för S. aureus och E. coli (utspädningsfaktorn för 10-4). C är livskraftiga bakterier återhämtade sig från kontroll disken efter 24 h inkubation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Förlusten av livskraft (%) bestämdes av ekvation (2) och (3) som anges i detta protokoll (se figur 5).
Figur 5: förlust av lönsamheten av kontaktmetod. I denna panel visas förlusten av livskraft (%) för M1, M2, M3 och M4 mot S. aureus och E. coli på materiella ytor. Prov M1 uppvisade ingen antimikrobiell aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ingen av de 4 material var dock kunna hämma tillväxten av jästsvampen Candida albicans av metoden kontakt antingen (bilder inte visas). Därför, 3 av dessa 4 avancerade material visade positiva antimikrobiella resultat mot grampositiva och gramnegativa bakterier och därmed kan vara mycket användbar för många bioengineering applikationer med krav på hög antibakteriell aktivitet. Ingen av de 4 material var dock kunna hämma jäst tillväxt.
Discussion
Antimikrobiella aktivitet av nya avancerade material kan analyseras med lätt att följa protokollet bestående av 2 kompletterande förfaranden som grundas på 2 befintliga metoder: agar disk diffusion testa38 och antimikrobiella aktivitet mätas på material ytor enligt ISO 22196:2007 norm39.
I detta forskningsområde är många av de antimikrobiella tester som rapporterats i litteraturen starkt beroende av analysens. Därför är det mycket viktigt att ha detaljerade och konsekvent protokoll på plats över laboratorier. Denna artikel är ett steg i den riktningen. Dessutom kan det vara mycket bra för många forskare som är mindre erfaren inom detta område och kräver djupgående, stegvisa procedurer att följa för korrekta resultat.
Detta protokoll kan användas med många typer av material som skär i disk former av 10 mm diameter. Spröda material kan vara svullna i lämpligt lösningsmedel för 1 h att göra bearbetningsprocessen lättare. Hydrofila material såsom alginater kan således vara hydrerade i Ånghärdad destillerat vatten. Andra lösningsmedel, såsom etanol, keton och diklormetan, kan vara anställd att svälla hydrofoba material för 1 h innan du skär dem. Men vissa material såsom poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) behöver inte vara svullen och kan kapas direkt. Efter det är det mycket viktigt att torka prov material diskarna i vakuumugn och sterilisera varje prov med etanol och UV-strålning för 1 h för att undvika kontaminering.
Detta protokoll rekommenderar TSA och TSB som kultur media och användning av rena kulturer av 3 mikroorganismer att nå ett brett spektrum av mikroorganismer: grampositiva bakterier Staphylococcus aureus, gramnegativa bakterien Escherichia coli, och jästen Candida albicans. Alternativa kultur media och andra mikroorganismer i behov av olika inkubationsförhållanden kan dock också användas med detta protokoll. Ibland är endast 1 mikroorganism testat för att ha en idé av den antimikrobiella aktiviteten i ett nytt material.
De material som visar stark antimikrobiella aktivitet mot den rekommendera 3 olika typer av mikroorganismer bör också testas mot antibiotikaresistens patogener såsom meticillinresistenta Staphylococcus epidermidis (MRSE), som har använts framgångsrikt med detta protokoll. Andra viktiga resistenta mikroorganismer som orsakar mycket oro är den grampositiva meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) och vankomycinresistenta enterokocker (VRE) och den gramnegativa Pseudomonas aeruginosa40,41.
Biofilm hämning och antimikrobiell aktivitet av material mot andra typer av mikroorganismer som virus och parasiter kan inte testas med detta protokoll. Men ger detta protokoll en mycket bra utgångspunkt för en antimikrobiell studie av en ny avancerad material.
I antimikrobiell agar disk diffusion test inträffar ett kritiskt steg när provet disken måste placeras i mitten av plattan eftersom vissa material vik så snart de komma i kontakt med agar media. I detta fall är det rekommenderat att använda ett sterila par pincett att veckla försiktigt ut provet. Däremot, i kontakt-metoden är det viktigt att tvätta kontroll och prov diskar mycket väl med PBS av pipettering dem fyra gånger följt av en kraftig vortexa och ultraljudsbehandling för att säkerställa att inga livsdugliga mikroorganismer förbli vidhäftat till materialet yta.
Detta video protokoll kan användas i många bioengineering applikationer, såsom bioprocess engineering, vävnadsteknik, kontrollerad narkotika leverans, förpackningsmaterial, avloppsvatten och jordbruk, som använder biomaterial med en mycket önskvärda antimikrobiell kapacitet.
Resultat av detta protokoll är kvalitativa (bilderna) och kvantitativa (normaliserade bredden på antibakteriella ”Hålön” och förlusten av livskraft) med en bra analys av dess reproducerbarhet (medelvärde ± standardavvikelse). När man jämför olika material, måste dessa medelvärden som erhållits med diffusion och kontakt metod resultat analys analyseras med envägs ANOVA, följt av Turkiets post hoc analys, för att studera om de är statistiskt signifikant olika (p < 0,01).
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna det Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir för ekonomiskt stöd för detta arbete genom den 2017-231-001UCV och 2018-231-001UCV bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylindrical punch | 10 mm diameter | ||
| Petri dishes | soria genlab | P101 | 90 mm diameter, sterile |
| Tryptic soy agar (TSA) | Liofilchem | 610052 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
| Tryptic soy broth (TSB) | Liofilchem | 610053 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
| Sterile cotton swab | EUTOTUBO | 300200 | |
| Centrifuge tubes | VIDRA FOC, SA | 429900 | 50 mL, sterile |
| Ethanol | VWR | 83813360 | Absolute ethanol |
| Sterile 48-wells plate | COSTAR | 3548 | Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene |
| A pair of tweezers | BRAUN | 24612036 | Toothless |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS). | VWR | E404-100TAPBS | |
| Vaccum oven with a connected vacuum pump | JP Selecta, SA | 5900620 | |
| Laminar flow hood | TELSTAR Technologies, SL | TELSTAR AH-100 | 12.0 W lamp of UV-C radiation |
| Class II Biological safety cabinet | LABOGENE | MARS 1200 | |
| Incubator | ASTEC CO, LTD | SCA-165DR | |
| Vortex mixer | Biosan | V-1 Plus | |
| Spectrophotometer | Macherey-Nagel, Germany | Nanocolor UV/VIS II | |
| Bunsen burner | JP Selecta, SA | 7001539 | |
| Alcohol burner | VIDRA FOC, SA | 1658/20 | In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet |
| Orbital shaker | sartorius stedim | 8864845 | |
| Sonicator | SELECTA | 3000617 | 50/60 Hz |
| Digital calliper | ACHA | 17-260 | 0-150 mm |
| Serological pipette | Fisherbrand | 13-678-11 | 25 mL, sterile |
| Serological pipette | VWR | 612-4950 | 5 mL, sterile |
| Serological pipette | VWR | 612-5541 | 10 mL, sterile |
| Micropipette | GILSON | FA10005P | Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL |
| Micropipette | GILSON | F123602 | Pipetman P1000, 200-1000 µL |
| Micropipette | GILSON | FA10016 | Pipetman L P12X300L, 20-300 µL |
| Micropipette tips | LABBOX | TIBP-200-960 | 2-200 µL |
| Micropipette tips | LABBOX | TIBP-1K0-480 | 100-1000 µL |
| Pre-sterilized tube | INSULAB | 301402 | 10 mL |
| Photo camera | Canon EOS 5D | Any camera with high resolution can also be utilized | |
| Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus | strain V329 | Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9), 2888–2896 (2001) | |
| Gram-negative bacteria Escherichia coli | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 101 | |
| Yeast Candida albicans | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 1394 | |
| Microcentrifuge tubes | DASLAB | 175508 | 1,5 mL |
| Autoclave | JP Selecta, SA | 4002136 | |
| Spectrophotometer-cuvettes | UVAT Bio CB | F-0902-02 | 4,5 mL |
| Drigalski spatula | LABBOX | SPRP-L05-1K0 | Sterile, disposable |
| glass balls (2 mm diameter) | Hecht Karl | 1401/2 | Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula |
| Autoclave bags | DELTALAB | 200318 | To sterilize microbiological residues or contaminated material |
| Electronic pipette filling device | JetPip | JET BIOFIL | |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-100-010 | 100 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-250-010 | 250 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-500-010 | 500 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-1K0-010 | 1000 mL, for autoclaving culture media |
| Latex gloves | DENIA | 2278000000 | |
| Indicator tape for sterilization | LABBOX | STAP-A55-001 | Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process. |
| Universal test tube rack | LABBOX | MTSP-001-001 | To hold centrifuge tubes |
| Microcentrifuge tube rack | VWR | 211-0210 | To hold microcentrifuge tubes |
| Sterile loop | ACEFE S.A. | 100140055 | 10 µL of capacity for microbial culture |
| Material M1 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 1 | |
| Material M2 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 2 | |
| Material M3 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type3 | |
| Material M4 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 4 | |
| Material C | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Control material |
References
- Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
- Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668 (2016).
- Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104 (2011).
- Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
- Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
- Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).
- Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
- Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
- Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
- Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
- Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
- Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
- Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
- Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
- McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
- Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
- Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
- Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
- Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565 (2000).
- Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
- Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
- Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
- Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
- Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
- Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
- Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
- Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
- Serrano-Aroca, Á, Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
- Serrano-Aroca, Á, Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
- Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
- Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
- Serrano-Aroca, Á, Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684 (2017).
- Serrano-Aroca, Á, Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).
- Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
- Serrano-Aroc, Á, Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
- Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, Á Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).
- Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
- ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).
- Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
- Boucher, H. W., et al. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).
