Summary
פרוטוקול זה מספק גישה חסכונית כדי לבודד ולאפיין העכבר הראשי כליות צינורי תאים יכולים לאחר מכן להיות תת תרבותי להערכת תפקודים ביולוגיים כליות ex-vivo, כולל ביואנרגיה מיטוכונדריאלי.
Abstract
תפקוד מיטוכונדריאלי בתאי אפיתל אבובית הכליה (אקדח) יכול להוביל פיברוזיס כליות, מחלת כליות כרונית (CKD) הגורם העיקרי. לכן, הערכת פונקציית מיטוכונדריאלי אקדח העיקרי עשוי לספק תובנות בעלות ערך לתוך המצב bioenergetic של התאים, לספק תובנה הפתופיזיולוגיה של CKD. אמנם ישנם מספר פרוטוקולים מורכבים זמין עבור בידוד ולטיהור בקוריאנית proximal מינים שונים, השדה חסרה שיטה חסכונית אופטימיזציה עבור בידוד תא צינורי ללא צורך טיהור. כאן, אנו מספקים פרוטוקול בידוד המאפשרת עבור לימודי התמקדות בשני ראשי העכבר לקרע, אקדח כליות. בנוסף ריאגנטים חסכונית מינימלית הליכים בעלי חיים נדרש ב פרוטוקול זה, התאים מבודד לשמור על רמות אנרגיה גבוהות לאחר בידוד והוא יכול להיות תת תרבותי עד ארבעה קטעים, המאפשר לימודי מתמשך. יתר על כן, אנו באמצעות מנתח תפוקה גבוהה השטף חוץ-תאית, להעריך את הנשימה מיטוכונדריאלי ישירות ב- אקדח מבודד בצלחת 96-ובכן שעבורו אנו מספקים המלצות עבור אופטימיזציה צפיפות תא וריכוז מורכבים. מקרים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש בפרוטוקול זה ללימודי אבובית הכליה לשעבר vivo בהפקה עקבית, היטב מתוקננת של אקדח כליות. פרוטוקול זה עשוי להיות רחב יותר יישומים עתידיים ללמוד בתפקוד מיטוכונדריאלי הקשורים עם מחלות כליות גילוי תרופות או סמים אפיון למטרות.
Introduction
תפקוד תאי אפיתל אבובית הכליה (TEC) משויך בחריפות מצב הבריאות הכללית של הכליה. איתות פתולוגיים בכליה גורם dedifferentiation של אקדח, אשר ממלא תפקיד מרכזי כליות פיברוזיס ו כליות כרונית (CKD) המחלה1,2. כמו איבר מאוד אנרגטי, הכליה היא שנייה רק ללב בצריכת חמצן, בעיקר באמצעות זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי3. מיקרוסקופ אלקטרונים מחקרים גילו מתאם חיובי של שינויים מורפולוגיים מיטוכונדריאלי לאירועים פתולוגיים בקוריאנית כליות4. תפקוד מיטוכונדריאלי אקדח גורמת פיברוזיס הכליות דרך המעבר אפיתל כדי mesenchymal5 ו- חמצון חומצות שומן פגום6. פיברוזיס היא מחלה כליות מתקדמת, שתוצאתו CKD. לכן, הבנת המצב האנרגטי של אקדח כליות היא הכרח לגלות את הפתופיזיולוגיה של CKD.
ישנם סוגי תאים > 20 הכליה למבוגרים7. ללמוד את הפונקציה של אקדח, תרבות העיקרי של תאי אפיתל כליות נדרש כפלטפורמה עבור יישומים בביולוגיה מולקולרית כגון טיפולים כימיים שינויים גנטיים. חשוב, ניתן לבצע מניפולציות גנטיות ב- vivo בעכברים באמצעות transgenesis או באמצעות טכניקות מסירה ג'ין AAV8 כך התאים הראשי מבודד כבר להיות גנטית מניפולציות. בידודו של ראשי תאים הכרישים כליות עכברים9,10, חולדות11,12,13, ניבים14,15,ארנבים16, בני אדם17 ,18 דווחה בצעדים טיהור להניב טהור תאים צינורי הפרוקסימלית. בפרוטוקולים אלה שפורסמו קודם לכן להתמקד הבידוד של תאים צינורי צינתור, צנטריפוגה הדרגתיות ומיון הניסויים בוצעו עבור מטרות טיהור19. בעוד פרוטוקולים אלה הם בעלי ערך לימוד בקוריאנית צינתור, הן אינן מספיקות כאשר בקוריאנית הן לקרע, יש צורך ללמוד. לדוגמה, המחקר שלנו על תסמונת אלפורט חשף כי בקוריאנית כליות הן לקרע, תפקיד חשוב התקדמות המחלה20, לכן שני סוגי בקוריאנית כליות צריך להיחקר בתרבות. מחקר שנערך לאחרונה על רעילות פלואוריד כליות הראה גם כי שינויים פתולוגיים התקיים בשני בקוריאנית לקרע,21. לכן, פרוטוקול זה בידוד הוא עוצב באופן מיטבי עבור תאים צינורי הפרוקסימלית ו דיסטלי של העכבר הכליות בעלות מינימאלית של ריאגנטים, נהלים פשוטים. לחלופין, חוקרים יכולים עדיין לעקוב אחר הפרוטוקול עד שלב 3.1 ולהוסיף טיהור שלבים9 מעתה והלאה בידוד תאי צינורי proximal טהור.
התאים מבודד להציג רמות אנרגטיות גבוהות ולשמור על מאפייני האפיתל כליות לאחר תרבויות משנה כדי 4 מעברים. באמצעות מנתח תפוקה גבוהה השטף חוץ-תאית, נוכל להעריך את הנשימה מיטוכונדריאלי ישירות ב- אקדח מבודד בצלחת 96-ובכן, מה שמוביל תובנות נוספות לתוך התא צפיפות אופטימיזציה. מקרים אלה מצביעים על פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ללימודים אבובית הכליה לשעבר vivo בהפקה עקבית, היטב מתוקננת של אקדח כליות. משמעות נוספת של פרוטוקול זה הוא השימוש ריאלי ככלי תפוקה גבוהה שמחוץ אפיון ביואנרגיה מיטוכונדריאלי בתאים כליות לקרע, צינורי. לכן, הוא יכול לשמש כפלטפורמה גילוי תרופות או סמים למטרות אפיון של מחלות כליות.
Protocol
כל הניסויים המערבות בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו ועדת שימוש ב אוניברסיטת מיאמי, העומדות NIH הנחיות.
1. צלחת ציפוי והכנה של ריאגנטים
- להכנת ציפוי קולגן:
- להוסיף μL 35 של קולגן אני עד 2 מ"ל של פתרון חומצה אצטית מסונן מראש 20 מ מ על גבי צלחת פטרי יחיד 60 מ מ. דגירה זה בטמפרטורת החדר מאובטח, מילה נהדרת זה, לחשוף אותם בפני UV.
- לשטוף את הציפוי 3 x עם PBS כדי להסיר שאריות חומצה ולשמור אותו ב- 37 מעלות צלזיוס CO2-חממה התרבות התא חינם עד התאים מוכנים זריעה. הריכוז הסופי של הציפוי קולגן הוא 5 μg/ס מ2.
- הכנת מאגר זלוף: להוסיף 300 μL של פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) 30 מ של PBS, לחמם את התערובת בתוך אמבט מים 37 ° C עד הבידוד מתחילה.
- הכנת מאגר עיכול: להמיס 3.9 מ ג של collagenase מסוג 2 לתוך 30 מ של PBS, לסנן את הפתרון דרך מסנן בקבוק-העליון 0.2-μm, מחמם אותה באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C עד הבידוד מתחילה.
- הכן תא תרבות המדיה:
- להביא את תוספי לטמפרטורת החדר. ללא סינון, להוסיף את תוספת (0.05 מ"ל של עגל עוברית נסיוב, 10 ננוגרם למ"ל של גורם הגדילה באפידרמיס, 5 μg/mL של אינסולין, 0.5 μg/mL של אפינפרין, 36 ננוגרם למ"ל של הידרוקורטיזון, 5 μg/mL של transferrin 4 pg/mL של triiodo-L-thyronine) עד 500 מ"ל של הכליות תא אפיתל הבזליים מדיום הגידול 2.
- חממו המדיה בתוך אמבט מים 37 ° C עד שזה מוכן לשימוש.
- הכנת תרכובות: הכנת 50 מ מ FCCP, rotenone 10 מ מ, 10 מ מ oligomycin, antimycin 10 מ מ א, 50 מ"מ לקרניטין ו- 50 מ מ etomoxir במניה פתרונות בכל דימתיל סולפוקסיד, aliquot אותם, ולאחסן את תרכובות ב-20 ° C.
- להכין 2.5 מ"מ פלמיתד נתרן ב- 220 מ של פתרון NaCl 150-מ מ, לחמם את הפתרון באמבט מים 75 ° C עד פלמיתד מפורקת לחלוטין.
- להכין אלבומין שור (BSA): להכין 0.34 ממ ללא שומן BSA ב 250 מ של 150 מ מ NaCl. הפקד BSA משמש פקד שלילי עבור הפתרון דקל-BSA, שבו ניתן להכין צעד בעקבות 1.8.
- נזווג את פלמיתד ל BSA (דקל-BSA):
- הוסף את הפתרון פלמיתד בהדרגה לתוך הפתרון BSA עוד זה עדיין חם. לאחר מכן, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4 ומערבבים אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה להשלים את ההטיה.
- כאשר הבניין הושלם, להוסיף עוד 150 מ ל 150 מ מ NaCl הפתרון, מערבבים אותו היטב ולשמור את aliquots ב-20 ° C. הפתרון הסופי מכיל 1 מ"מ נתרן פלמיתד ו- 0.17 מ מ BSA, ישמש מצע חומצת שומן עבור תאים assay מבוסס על חומצת שומן השטף חוץ-תאית.
- הכן השטף חוץ-תאית assay הבזליים מדיה:
- להוסיף 1 שקית אבקת DMEM ו- 20 מ ל-200 מ מגלוטמין (4 מ מ הסופי) 1 ליטר של בלוק dH2O ומערבבים אותם בעדינות.
- ביום של הניסוי ביואנרגיה, להוסיף 100 מיקרומטר נתרן פירובט למדיה הבסיס מוכן על ההכנות עוקבות של השטף חוץ-תאית assay מדיה לשמש assay נשימה בהתבסס גלוקוז - או חומצת שומן.
- הכן גלוקוז מבוסס מדיה:
- כדי למדוד את יכולת הנשימה סלולר דרך גליקוליזה, להוסיף אבקת גלוקוז 17.5 מ מ, 100 מיקרומטר BSA (כפי שמתואר בשלב 1.7), ובקרה etomoxir 20 מיקרומטר (כדי לעכב את חמצון חומצות שומן) התקשורת הבזליים שתוארו לעיל בשלב 1.9.
- לחמם את התקשורת ב 37 מעלות צלזיוס, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4 ולשמור אותו באמבט מים 37 ° C עד שהוא משמש וזמינותו השטף חוץ-תאית.
- להכין מדיה מבוססי חומצת שומן:
- כדי למדוד את יכולת הנשימה סלולר באמצעות חמצון חומצות שומן, להוסיף 10 מ מ- 2D-גלוקוז אבקה (גלוקוז אנלוגי כדי לעכב גליקוליזה), 100 מיקרומטר דקל-BSA (כפי שמתואר בשלב 1.8) ולאחר 100 מיקרומטר L-carnitine למדיה הבזליים שתוארו לעיל בשלב 1.9.
- לחמם את התקשורת ב 37 מעלות צלזיוס, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4, ולשמור אותו באמבט מים 37 ° C עד שהוא משמש וזמינותו השטף חוץ-תאית.
2. זלוף, העיכול והכליות קציר של עכברים
- עזים ומתנגד את העכבר עם תזרים איזופלוריין ולתקן את זה במצב פרקדן. ודא שהבידוד מתחיל רק אחרי החיה מאבד את הרפלקסים שקמה בעצמה אחרי שמפילים שלה ואת העומק הרדמה מנוטרת על ידי צביטה הערכות באמצעות מלקחיים atraumatic לפני ובמהלך הליך22.
- הסר פרווה, שימוש בקרם depilatory, מהחזה של העכבר לאזור הבטן שלו לחטא אותה עם יוד, לנגב את שאריות יוד.
- אעשה חתך בבית החזה, לחתוך את העור כדי לפתוח את אזור הבטן כל ולחשוף את הכליות והלב.
- כוונן משאבה זלוף-32 mL/min ' להסיר את כל הבועות של הצנרת לפני שמתחילים את זלוף.
- להכניס מחט 27 ג'י לתוך החדר השמאלי דרך הלב השיא ברגע המאגר מתמלא הלב ולאחר לתקוע אטריום ימין כדי ליצור יציאה כדי המאגר זלוף מסחררת כמו משאבות הלב, בסופו של דבר יוסר מן היציאה אטריום ימין.
- לאחר זלוף, לעבור את מהירות המשאבה 30 mL/min לעיכול.
- לאחר 20 מ של מערכת העיכול הוא מאגר perfused דרך השיא, להסיר שתי הכליות בידוד תא צינורי.
3. ברקמה, ראשי צינורי תאי בידוד
- הסר את כמוסות כליות ואת לשד, מינצ שתי הכליות לחתיכות קטנות, דגירה אותם ב 10 מ"ל של מאגר עיכול בתנור 37 ° C עם סיבוב עדין במשך 5 דקות.
- הסר כל רקמות כליה מעוכל על ידי עובר המאגר דרך מסנן 70-μm. להוסיף 10 מ של תרבות התקשורת כדי לעצור את העיכול.
- כדי לאסוף תאים צינורי, centrifuge התליה תא המסוננות ב g x 50 עבור 5 דקות כדי לאסוף את גלולה ראשונה. להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש ולהוסיף 5 מ של תרבות התקשורת, צנטריפוגה זה 50 גרם x עבור 5 דקות כדי להבטיח כל התאים צינורי נאספים לתוך בגדר השני.
צנטריפוגה זה בקצב נמוך כדי בעיקר הצניפה בקוריאנית כבד. מאוחר יותר, לאחר התאים להתאושש הבידוד, התרבות צינורי טהור הוא centrifuged במהירות גבוהה יותר במהלך תרבויות משנה. - Resuspend בגדר הראשון ב- 20 מ של תרבות התקשורת, centrifuge זה ב g x 50 עבור 5 דקות כדי לאסוף בגדר השלישי.
- Resuspend כדורי השני והשלישי ב 1 מ"ל של תרבות התקשורת. µL מיקס 10 של התליה תא עם 10 µL של Trypan blue, לטעון את התערובת אל תוך חדר A של ספירה שקופיות ושיא הכדאיות תא מ אוטומטית תא מונה (ראה טבלה של חומרים).
- הזרע עד 107 תאים (אוכלוסיה הטרוגנית) על גבי צלחת 60 מ מ אחד מצופה מראש עם קולגן ולתת את התאים צינורי לצרף בן לילה.
4. ראשי צינורי תאים תת תרבות ואפיון
- ביום 1 לאחר הבידוד, לאסוף את תרבות המדיה, centrifuge זה ב g x 50 עבור 5 דקות כדי הצניפה כל בקוריאנית צף. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב- mL 4 צלחת אותו בחזרה אותה המנה תרבות ומדיה תרבות טריים.
- יום 4 לאחר הבידוד, מסיר את המדיה התרבות העתיקה והוסף מדיה טריים.
- ביום 7 לאחר הבידוד, ניתוק התאים על ידי המקננת בהם ב- 37 מעלות צלזיוס ב 2 מ של 0.25% טריפסין-EDTA עבור 5 דק להוסיף 3 מ"ל של תרבות התקשורת כדי לעצור את התגובה ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב g x 250 למשך 5 דקות.
- תת תרבות, לאפיין את התאים P0 ל- P1, זרע תאים 5,000 לכל טוב על צלחת 24-ובכן מצופה קולגן אני כמתואר לעיל.
- 24 שעות לאחר שלב 4.4, לתקן את התאים ב- P1 עם 4% PFA למשך 10 דקות, permeabilize אותם עם 0.2% טריטון X-100 למשך 3 דקות, ולחסום אותם עם 10% חמור סרום (DS) לשעה בטמפרטורת החדר.
- לדלל בטחונות ב 10% DS, כל אחד החלבונים הבאים: angiotensinogen הפרוקסימלית סמני צינורי (של AGT) ואת aquaporin 1 (AQP1); דה מרקר צינורי דיסטלי E-קדהרין; דה מרקר mesangial CD90/Thy1; ו הקולטן mucin דמוי הורמון סמני EGF כמו מודול המכיל מקרופאג-כמו 1 (F4/80) ואשכול של בידול 68 (CD68), ואני דגירה אותם עם תאים בן לילה על 4 מעלות צלזיוס.
- למחרת, לזהות כל מכתים באמצעות 1:200 אנטי-ארנב, אנטי עכבר או אנטי חולדה פלורסנט משני נוגדנים למשך 45 דקות. קח תמונות תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאשר את הביטוי של הסמנים, כפי שמוצג באיור 2A.
- ביום השלישי לאחר תת התרבות של P1, לנתק את התאים עבור תרבות משנה עם אפיון-P2 מאת צביעת סמני צינורי, mesangial ו מקרופאג שמתואר בשלב 4.5. תמונה ההכתמה תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאשר את הביטוי של הסמנים, כפי שמוצג באיור 2A.
- ביום השלישי לאחר תת התרבות של P2, לנתק את התאים עבור תרבות משנה עם אפיון-P3 מאת צביעת סמני צינורי, mesangial ו מקרופאג שמתואר בשלב 4.5. תמונה ההכתמה תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאשר את הביטוי של הסמנים, כפי שמוצג באיור 2A.
- הכן ההכתמה רקמות:
- מילה נהדרת.. מוקפאים פראי-סוג ושקופיות Col4a3- / - כליות לשעה בטמפרטורת החדר ולתקן אותם עם 4% מחברים עבור 10 דקות Permeabilize אותם עם 0.2% טריטון X-100 10 דקות ולחסום אותם עם 10% חמור סרום (DS) לשעה בטמפרטורת החדר. מוסיפים נוגדנים נגד החלבונים סמן שמתואר בשלב 4.5-1:200, דגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, לזהות כל מכתים עם 1:200 נגד הארנב, אנטי עכבר או אנטי חולדה פלורסנט משני נוגדנים למשך 45 דקות. קח תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לאשר את הביטוי של הסמנים, כפי שמוצג דמויות 2B ו- 2 C.
5. המיטוכונדריה ביואנרגיה Assay
- זרע P1 תאים צינורי 20,000, 30,000 או תאים 40,000 לכל באר μL 100 של תרבות התקשורת על גבי microplate 96-ובכן מראש מצופה 5 μg/cm2 קולגן אני שלשום מבחני השטף חוץ-תאית.
- עבור הידרציה של מיכל הדיו חיישן, הרם את מחסנית חיישן, למלא כל אחד טוב של הצלחת עם 200 μL של פתרון כיול. בזהירות לטעון את המחסנית כדי להטביע את החיישנים בפתרון כיול. הכנס את מיכל הדיו תנור 37 ° C ללא CO2 לפחות 7 שעות לפני השימוש.
לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מומלץ לילה הידרציה מחסנית. - הכנת תרכובות: להכין מיקרומטר oligomycin 8, 9 מיקרומטר FCCP ו 20 מיקרומטר תערובת rotenone/antimycin של גלוקוז (שמתואר בשלב 1.10) והן חומצת שומן (שלב ב- 1.11) שטף חוץ-תאית assay מדיה.
- לשנות את המדיה: האחות התקשורת התרבות תאים, להוסיף µL 175 של מדיה assay גלוקוז או חומצת שומן (תלויה המתחם זה להיות עבד, ראה שלב 5.3), דגירה אותם עבור 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס CO2-חממה חינם.
- לטעון את היציאות מחסנית עם 25 µL של תרכובות הבאים: oligomycin 8 μM עבור יציאה A להשיג ריכוז סופי של 1 מיקרומטר (הערה: כל אחד טוב יכיל µL 175 של מדיה, המתחם יקבל 8 מדולל x), 9 μM FCCP בנמל B כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מיקרומטר (הערה: כל אחד טוב יכיל µL 175 של מדיה פלוס 25 µL של הפתרון מוזרק מ ליציאה A, המתחם יקבל 9 מדולל x), ו- 20 מיקרומטר rotenone/antimycin A בנמל C כדי להשיג ריכוז סופי של 2 מיקרומטר עבור כל המתחם (שים לב : כמו כל טוב יכיל µL 175 של מדיה פלוס 50 µL של הפתרון מוזרק של יציאות A ו- B, המתחם תקבלו 10 מדולל x).
- להוסיף מים בארות כל נמל D ויציאות אחרים כל הבארות רקע (ללא תאים). דגירה הדיו 37 ° C CO2-חממה חינם למשך 10 דקות.
- להפעיל את מנתח השטף חוץ-תאית לבין הבקר.
- לפתוח את התוכנה מנתח ולהזין את פרוטוקול הבאים:
- לבחור Assay סטנדרטי. לחץ על אשף וזמינותו. באמצעות הכרטיסיה תרכובות , להקצות את הפריסה מורכבים, השתמש בכרטיסיה קבוצות ותוויות כדי לתייג את הקבוצות ניסיוני. זכור להקצות הבארות ריקים (ללא תאים) כרקע.
- תחת הכרטיסיה פרוטוקול , הגדר במחזורים מיקס ולמדוד הבאים להשתמש בפקודות הזמינות כמצוין בטבלה1: כיול, מערבבים למשך 2 דקות, להמתין 2 דקות, מדד 3 דקות (חזור על מחזור זה x 2-3); להזריק יציאה A, מערבבים למשך 2 דקות, לחכות 2 דקות, מדד 3 דקות (חוזר מחזור זה x 2-3); להזריק יציאה B, מערבבים למשך 2 דקות, להמתין 2 דקות, מדד 3 דקות (חוזר מחזור זה x 2-3); להזריק יציאה C, מערבבים למשך 2 דקות, להמתין 2 דקות, מדד 3 דקות (חוזר מחזור זה x 2-3). הקש End אשף. . זה גם ניתן להציל את התבנית הנוכחית לשימוש עתידי.
- הקש על התחל כדי להתחיל את הכיול. במנתח ואז באופן אוטומטי פולט את לוחית ומבקש הצלחת מחסנית שיוכנס.
- כאשר השלב הכיול נעשה (בדרך כלל ב- 20-25 דקות), הקש בשורת הפקודה כדי לשנות את הצלחת מחסנית לצלחת תא ולהמשיך לרוץ.
- כאשר ההפעלה הושלם, להעביר את הנתונים, הסר את לוחית 96-ובכן. להוסיף כל הבארות assay Hoechst (1:1, 000), דגירה אותם למשך 5 דקות ב 37 º C. לנרמל את הנתונים OCR ספירת תאים על-ידי יחידת מידה זריחה Hoechst קריאה של עירור 355-nm, פליטה של 460-nm.
Representative Results
זלוף הכליות והעיכול תשואות מאוד קיימא בתאי אפיתל הכרישים:
תאים אפיתל אבובית הכליה העכבר היו מבודדים בהתאם לשלבים המפורטים בסעיפים 1-3 של הפרוטוקול המתואר לעיל.
לאחר digestions, אוכלוסיה הטרוגנית של תאי הכליה, כי מתעכל בקוריאנית, ופסולת אחרת רקמות פחות מיקרומטר 70 מצופים על המנה תרבות ביום בידוד. שינויים מיום 0 יום 1 לאחר הבידוד צפויים בדרך כלל ניתן לראות רק את הקובץ המצורף תא במקום את גדילת התאים. רק כמה תאים צינורי עוברת האוכלוסייה heterogenous צף, היו קשורים יום 1 (איור 1 א'). אוסף מחדש של התאים-יום 1, צנטריפוגה ציפוי מחדש של עזר הסרת לכלוך אור ולהתיישב החלקים צנורית קטן עבור מהדורת תא צינורי. מיום 1 ליום 3, צפויים שינויים לא רק קובץ מצורף תא טוב יותר אלא גם קצב צמיחה משופרת להפליא תא שנצפתה עם צפיפות שולש תא לעומת יום 1 (איור 1 א'). בשלב הצמיחה הראשוני, התאים הקימו מושבות מספר ואוכלס סביב המושבות. מנקודה זו ואילך, מבודד התאים היו החלים לחלוטין ומוצג בתי־ספר בריא. ביום 5, התאים היו 80-90% confluency בצלוחית 60 מ מ עם כמה רווחים בין לתא המושבה אל המושבה (איור 1 א').
תרבות משנה ואפיון התאים צינורי מבודד:
היו מבודדים כליות בתאי אפיתל צינורי תת תרבותי עבור קהל מעריצים אפיון השלבים המפורטים בסעיף 4 של הפרוטוקול המתואר לעיל.
מיום 5, התאים באופן מלא התאוששה הבידוד והחלו להתרבות נמרצות. שבוע אחרי הבידוד, התאים גדלה confluency בצלחת פטרי 60 מ מ. אחרי שבוע 1 בתרבות-המעבר 0, התאים היו מוכנים להיות תת תרבותי אל מעבר 1 ובהמשך, 2 קטעים נוספים. דפוסי הצמיחה דומים נצפו מעבר 1, פסקה 2. בדרך כלל, זה לוקח פחות משבוע עבור תאים על המעבר 1 ו- 2 כדי לגדול confluency עבור עוד תתי תרבויות (איור 1B). התרבות רציפה של confluent תאים מן המעבר 0 למצב המעבר 2 הראו על כיפת נרחב היווצרות23,24 (איור 1B), רומז כי התאים מבודד מתוחזק בריאה איפה שהם מופרשים נוזלים דומה כדי מצב ויוו . זה גרם של טפט של התאים כדי להרים רלוונטי אבל להישאר מחוברים באמצעות צמתי צר.
כדי לאפיין את התאים בתרבות, ביצענו immunofluorescent מכתים את התאים בתרבית מ מעבר 1 באמצעות מעבר 4, כמו גם של שליטה תא קו-אנושי proximal כליות HK-2 תאים אפיתל. צינתור סמני צינורי, aquaporin 1 (AQP1)25 ו- angiotensinogen (של AGT)9, E-קדהרין סמן צינורי דיסטלי25, את סמן אפיתל שריר חלק אקטין (SMA)26,27,28, מקרופאג סמני F4/8029 CD6830, ואני אנטיגן בידול 1 (Thy1/CD90) thymocyte סמן mesangial9 שימשו המחקרים אפיון. שני חלבונים צינורי מקורב AQP1, של AGT באו לידי ביטוי באופן עקבי מאוד בתאים צינורי מבודד מן המעבר 1 מעבר 4 גם כן כמו בקרה חיובית HK-2 proximal בתאי אפיתל (איור 2 א). החלבון צינורי דיסטלי E-קדהרין בא לידי התאים צינורי מבודדים באמצעות מעבר 4, נצפתה גם בתאים HK-2 (איור 2 א). SMA בוטאה בשפע בתאים צינורי מבודד, תאי בקרה HK-2, בקנה אחד עם דיווחים שפורסמו26,27. מצד שני, mesangial חלבון Thy1 וחלבון מקרופאג F4/80 נעדרו התאים צינורי מבודד והן תאי בקרה HK-2 (איור 2 א). CD68 הראה ביטוי מינימלי בתאים HK-2 והפך בתאים צינורי מבודד-מעבר 1, פסקה 2, ולאחר מכן הביטוי שלה לגילוי מן המעבר 3 באמצעות מעבר 4 (איור 2 א). התוצאות להציע התאים מבודד בעקבות פרוטוקול זה הם שילוב של תאים צינורי הפרוקסימלית ו דיסטלי. כדי להשוות בין הביטויים של אלה סמן חלבונים ויוו, ביצענו מכתים ברקמות הכליה קפוא. סמנים צינורי, כולל חלבון AQP1, של AGT, ו- E-קדהרין ו mesangial Thy1 נמצאו מאוד שבאה לידי ביטוי הכליות שנקטפו עכבר בריא פראי-סוג (איור 2B). ביטויים נמוכה של F4/80 ו- CD68 היו נצפו הכליות פראי-סוג אך באה לידי ביטוי בהרחבה בכליות שנקטפו Col4a3- / - עכבר פיתח אי ספיקת כליות עם מקרופאג הסתננות20,31 ( איור 2C).
ביואנרגיה מיטוכונדריאלי Assay בתאי צינורי העיקרי מבודד:
השלבים assay נשימה מיטוכונדריאלי מתוארים בסעיף 5 של הפרוטוקול המתואר לעיל.
הנשימה מיטוכונדריאלי של תאים בודדים צינורי העיקרי נמדד על ידי ניתוח חוץ-תאית השטף של קצב צריכת החמצן (OCR)-ציפוי שונים צפיפות. כדי titrate את צפיפות יופיצ, 20,000, 30,000 40,000 אקדח העיקרי לכל טוב היו נזרע על גבי microplate XF96 96-ובכן יום לפני (כ 20 שעות לפני) וזמינותו השטף חוץ-תאית (איור 3 א). לאחר ניתוח השטף חוץ-תאית, המדידות OCR היו אז מנורמל ל ספירת מאת כימות Hoechst מכתים. ציפוי של אקדח בגובה 20,000. רגל, 30,000 או 40,000 תאים/טוב, גרמו OCR הבזליים ממוצע של 25, 45 או 50 pmol/דקה, בהתאמה (איור 3 א). יתר על כן, תמונות מיקרוסקופי של תאים מצופים חשף כי 40,000 תאים/טוב מכוסה השטח כולו של החלק תחתון של הבארות microplate יותר טוב הצפיפויות ציפוי אחרים (איור 3B). אף-על-פי OCR מקסימלי לא להגביר באמצעות תאים 40,000 לעומת הצפיפות של תאים 30,000, אנו ממליצים על צפיפות התאים של בסביבות 40,000 תאים/טוב עבור אינטראקציות אופטימלי בין תאים תרכובות.
יתר על כן, בניסויים שלנו, ריכוז אופטימלי של תרכובות מעכבות/uncoupler הוצגה להיות 1 מיקרומטר oligomycin, 1 מיקרומטר FCCP ו 2 מיקרומטר rotenone/antimycin-A (הפרוטוקולים של וזמינותו השטף חוץ-תאית, זריקות היציאה מפורטים טבלה 1 ; הניסויים אופטימיזציה אינם מוצגים). עם זאת, מומלץ עבור כל המשתמשים לבצע בדיקה ראשונית עם ריכוזים שונים של תרכובות אלו, באופן אידיאלי נמוכות וגבוהות יותר לאור הערכים, כדי להצדיק את התוצאות הטובות ביותר.
Assay השטף חוץ-תאית מניבה מספר פרמטרים חשובים להערכת את ביואנרגיה של אקדח כליות. למשל, כפי שמוצג חמצון חומצות שומן להיות פגום במיוחד באקדח, השימוש של המדיה המכילה חומצות שומן המצע (פלמיתד) יחד עם החומר המדכא של גליקוליזה (2 די. ג'י) יכול לשמש ככלי שימושי להעריך ישירות חמצון חומצות שומן אקדח ב פסקאות 1 ו- 2 (איור 3C). במקרה של פיברוזיס כליות, יכולת הנשימה הכוללת של התאים צפוי להיות נמוך יותר מזה של כליה חדשה למרות התקשורת מבוססת-גלוקוז לא עשוי לחשוף את כל ההבדלים.
יחדיו, וזמינותו השטף חוץ-תאית, במיוחד כדי להעריך את יכולת חמצון חומצות שומן, יכול להיות מנוצל כאמצעי אינפורמטיבי כדי להעריך את המצב האנרגטי של אקדח כליות ב אילו שינויים פתולוגיים המשפיעים על המחזה פרופיל ביואנרגיה תפקיד מרכזי סיסטיק כליות, את התקדמות לאי ספיקת כליות.
| צעדים | הזמן (דקות) |
| כיול | |
| Equilibrate: | 12: 00:00 |
| מדידה 1 | 3 לולאות |
| מיקס | 02: 00:00 |
| . חכה | 02: 00:00 |
| מדד | 03: 00:00 |
| מיקס | 02: 00:00 |
| . חכה | 02: 00:00 |
| מדד | 03: 00:00 |
| מיקס | 02: 00:00 |
| . חכה | 02: 00:00 |
| מדד | 03: 00:00 |
| להזריק פורט (Oligomycin 1 μM) | 2 לולאות |
| מיקס | 02: 00:00 |
| . חכה | 02: 00:00 |
| מדד | 03: 00:00 |
| מיקס | 02: 00:00 |
| . חכה | 02: 00:00 |
| מדד | 03: 00:00 |
| להזריק יציאה B (1 μM FCCP) | 2 לולאות |
| מיקס | 02: 00:00 |
| . חכה | 02: 00:00 |
| מדד | 03: 00:00 |
| מיקס | 02: 00:00 |
| . חכה | 02: 00:00 |
| מדד | 03: 00:00 |
| להזריק יציאה C (2 μM Rotenon/Antimycin) | 2 לולאות |
| מיקס | 02: 00:00 |
| . חכה | 02: 00:00 |
| מדד | 03: 00:00 |
| מיקס | 02: 00:00 |
| . חכה | 02: 00:00 |
| מדד | 03: 00:00 |
טבלה 1. סטנדרטיזציה ניתוח השטף חוץ-תאית פועל פרוטוקול למדידות OCR אופטימלית בתאים צינורי העיקרי.
איור 1. תא התרבות של תאים בודדים צינורי העיקרית. (א) התאים מבודד צינורי העיקרי לצרף מוקדם ביום 1 ולגדול robustly מיום 3 יום 5. התמונות נלקחים מתחת לגיל 10 X ויעדים X 20. (B) לוח זה מציג תרבות משנה מבודד התאים צינורי העיקרי מן המעבר 0 עד מעבר 3. התמונות נלקחים מתחת לגיל 10 X ויעדים X 20 על החזיונות של הכיפות של התא, ותחת מטרה X 40 עבור חזון של שינויים מורפולוגיים דרך מעברי. Scalebar = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. אפיון של תאים בודדים צינורי העיקרית. (א) Immunostaining עם נוגדנים נגד proximal חלבונים צינורי (AQP1, של AGT), חלבון צינורי הדיסטלי (E-קדהרין), של חלבון אפיתל (SMA), חלבון mesangial (Thy1), חלבונים מקרופאג (F4/80, CD68) מראים העיקרית מבודד תאים צינורי תרבויות המשנה הבאים טהור לקרע, תאים צינורי בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. (B) לוח זה מראה על צביעת של המקורבת, צנורית הדיסטלי, mesangial חלבונים ברקמות הכליה של עכבר בריא פראי-סוג פקד חיובית, פקד ראשי לא שלילי. (ג) לוח זה מראה על צביעת של החלבונים מקרופאג F4/80 ו- CD68 ברקמת הכליה שנאסף עכבר Col4a3- / - כפקד חיובי. Scalebar = 20 מיקרומטר. דאפי מוצג בצבע כחול. החלבונים סמן מוצגים בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. השטף חוץ-תאית assay בתאים צינורי מבודד ראשי-ציפוי שונים צפיפויות. (א) Increasing הסלולר יופיצ צפיפות משפר את רמות נשימה הבזליים בתאים צינורי העיקרי, לא נוסו. מעבר 3. (B) לוח זה מציג תמונות מיקרוסקופי של תאים צינורי העיקרי בתרבית microplate XF96 נזרע על 20,000, 30,000 40,000 צפיפות התאים/טוב. Scalebar = 100 מיקרומטר. (ג) לוח זה מראה את assay השטף חוץ-תאית חומצת שומן או גלוקוז מבוססת בתאים צינורי ראשי-קטעים 2 ו-1. הנתונים הם זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
אנו ממוטב פרוטוקול המאפשר בידוד יעיל של העכבר כליות צינורי בתאי אפיתל (אקדח), הראה כי התאים יכולים להיות תת תרבותי עבור ניתוח השטף חוץ-תאית להעריך את הנשימה מיטוכונדריאלי בנוכחות חומצה שומן- ו/או מבוסס-גלוקוז סובסטרטים. פרוטוקול זה מיועד עבור לימודי התמקדות תאים צינורי הן לקרע, ומשמש מסגרת שבה לבנות ניסויים מורכבים יותר להבנת מחלות הקשורות הפתולוגיה הכליה טק. לעומת פרוטוקולים שפורסמו בעבר9,10,19, שיטה זו אינה דורשת הפרדות צבע עם זמן צנטריפוגה פעמים או השימוש של נוגדן בשפע למיון ומציעה, לכן, יותר מדריך יעיל אופטימיזציה עבור חוקרים הפועלים בשטח מטבולית אבובית הכליה. ישנם מספר שלבים קריטיים פרוטוקול זה, כולל עיכול, אוסף מחדש, ואת צפיפות יופיצ, מתחם למיטוב וזמינותו השטף חוץ-תאית.
בחירת סוג collagenase וריכוז אופטימלי הנכון הוא המפתח לעיכול מוצלחת, דיסוציאציה של התאים צינורי רקמות הכליה. לעומת סוגים אחרים של collagenases, collagenase מסוג 2 מכיל רמות גבוהות יחסית של פעילות פרוטאז, מסוגל בריא מבנים כליות קומפקטי. כדי לצמצם את הסיכון של זיהום כתוצאה זלוף ממושכת זמן עיכול, collagenase מסוג 2 0.013% היה perfused ב- 30 מ ל/דקה. הקפסולה כליות הוסרה רק לאחר שתי הכליות היו מן החיה והעבירו לתוך ברדס תרבות תא מעוקר. הכליות היו כתוש לחתיכות קטנות והמשיך שלהם דגירה עם 10 מ"ל של מאגר לעיכול עבור עוד 5 דקות לעיכול מלאה, שחרור מקסימלי של התאים צינורי.
למרות זאת, לאחר העיכול, ההשעיה רקמות מועברת דרך מסנן 70-מיקרומטר להסיר חתיכות רקמה גדול מאוד, עדיין יהיה מעוכל בקוריאנית זה לעבור דרך המסנן, כשנקבע התליה תא, מקבל מצופה על המנה תרבות. זה לוקח זמן רב יותר מהרגיל עבור אלה בקוריאנית לשחרר את התאים צינורי ולצרף בחוזקה לצלחת תרבות. לכן, חשוב למדי לאסוף התליה תא centrifuge כדי הצניפה בקוריאנית כעיגולים בצבע של תאים ביום השני לאחר ציפוי התא. שלב זה צנטריפוגה במהירות נמוכה יותר מסיר סוגי תאים אחרים, כי הם קלים יותר תאים צינורי ומאפשר בקוריאנית כעיגולים בצבע ותאים צינורי להתיישב.
הזיהוי של צפיפות התא הנכון הוא הצעד הראשון, מפתח עבור וזמינותו השטף חוץ-תאית מוצלחת. התוצאות הראו כי 40,000 תאים לכל טוב על microplate XF96 הינו אידיאלי עבור ראשי תאים צינורי חומצת שומן והן וזמינותו של נשימה המבוסס על גלוקוז (איור 3C). ב פרוטוקול זה, תאים בודדים צינורי שימשו את השטף חוץ-תאית assay בבית פסקאות 1 ו- 2. התאים תת תרבותי אל מעבר 3, למרות שמר על ביטוי של הסמנים צינורי (איור 2), ביצועים סבירים, מבחני ביואנרגיה (איור 3 א) והם הראו רמות נשימה הבזליים ירידה לעומת מעבר 2 (מוצג על-ידי השוואת OCR הפאנלים הימניות של איור 3A כדי דמות 3C). ירידה זו לא משפיעה על תאים צינורי בריאים באופן משמעותי (למשל, אלה מבודד עכברים צעירים פראי-סוג). אולם, ללימודים על תאים מבודד בדגמי העכבר CKD כבר של נשימה מופחתת מיטוכונדריאלי, מעברים גבוה יותר של התאים עלול לגרום לירידה נוספת נשימה הבזליים אשר ישפיע על התוצאות של וזמינותו השטף חוץ-תאית. במחקרים שנערכו כאן, התאים מעבר 1 והן מעבר 2 הראו גבוהה נשימה הבזליים רמות. לכן, בעקבות פרוטוקול זה, אנו ממליצים להשתמש אלה שתי פסקאות מוקדמות ללימודי מיטוכונדריאלי נשימה עם תאים מבודדים מבעלי חיים בריאים וחולים. תאים מן המעבר 2 צריך עדיין לקחת בחשבון אם התרבות המשנה מעבר 1 אינה נותנת מספיק תאים עבור וזמינותו השטף. בנוסף לימודי ביואנרגיה, מחקרים קודמים שלנו מראה כי ראשי אקדח-מעבר 3 יכול להיות מאוד שימושי עבור טיפולים עם תרכובות ואחריו חלבון ולימודי RNA (נתונים לא מוצג). עם זאת, אנו ממליצים חוקרים באמצעות פרוטוקול זה בידוד תאי צינורי צריך לבחור בקפידה את המעבר אופטימלית עבור יישומי מחקר שונים.
עקרון הפעולה של ניתוח השטף חוץ-תאית מבוססת על האינטראקציות בין תרכובות מוזרק ולא את מתחמי שרשרת הנשימה ואת השפעת uncoupler. Oligomycin הוא מעכב של מורכבות החמישי (ATP סינתאז) והוא משמש כדי להבחין בין צריכת החמצן מקושרים-ATP ואת צריכת החמצן הדרושה כדי להתגבר על הדליפה פרוטון רגיל על פני הממברנה הפנימית מיטוכונדריאלי32. FCCP uncouples צריכת החמצן של ייצור ATP על ידי לשבש את הקרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים. לפיכך, הוא מספק מידה לקיבולת מירבית נשימה כמו זה עוקף את קיבולת מוגבלת של בזרימת יון פרוטון מאת ATP סינתאז בכך שהוא מאפשר הובלה פרוטון דרך הקרום. Antimycin-A, מעכב השלישי מורכב, ולא rotenone, מתחם אני חוסם, משמשים בשילוב לסגור את הנשימה מיטוכונדריאלי כולו ומאפשר הבחנה בין מיטוכונדריאלי לעומת צריכת חמצן מיטוכונדריאלי ב התאים. תרכובות אלו צריך תמיד להיות טיטרציה עבור סוג תא מסוים לפני וזמינותו השטף חוץ-תאית לקבוע ריכוז אופטימלי המניבים את עקומות OCR אופטימלית. כאן, אנו ממליצים 1 מיקרומטר של oligomycin, 1 מיקרומטר של FCCP ו 2 מיקרומטר של rotenone/antimycin A עבור וזמינותו השטף חוץ-תאית-אקדח העיקרי.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה וחסכונית לבודד כליות העיקרי לקרע, צינורי תאים אפיתל שיכול לשמש להערכת ביואנרגיה מיטוכונדריאלי ex-vivo. בעוד פרוטוקול זה יכול להיות שימושי מגוון רחב של לימודי ביולוגיה מולקולרית לחקור את תפקוד הכליות תאי אפיתל צינורי ביולוגי, אנו להכיר מגבלותיו בעת החלתו על מחקרים הזקוקים בקוריאנית צינתור או דיסטלי טהור. לדוגמה, מחקרים על התסמונת לאו, סלקטיבי בתפקוד צינורי הפרוקסימלית של33או מחקרים על דיסטלי חמצת אבובית הכליה, תפקוד צינורי דיסטלי34, ידרוש פרוטוקול מתוחכמים יותר לבידוד תא ו טיהור. עם זאת, עבור רוב המחקרים המשווים בקוריאנית לעומת glomeruli, ללימודי למסך הרגולטורים פוטנציאל הנשימה מיטוכונדריאלי בתאים צינורי באופן כללי, הפרוטוקול מספקת גישה אפשרית תפוקה גבוהה. לכן, פרוטוקול זה ייתכן יישומים רבים ללמוד בתפקוד מיטוכונדריאלי הקשורים עם מחלות כליות למטרות אימות גילוי או היעד סמים.
Disclosures
המחברים יש ריהצהל.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים כדי שחאדה א לינה: את המכון הלאומי לבריאות (R56HL132209 ו- 1R01HL140468), מכון המחקר של הלב מיאמי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
| Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
| 2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
| Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
| DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
| Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
| TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
| MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
| Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |
References
- Bielesz, B., et al. Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 4040-4054 (2010).
- Fabian, S. L., et al. Hedgehog-Gli pathway activation during kidney fibrosis. American Journal of Pathology. 180 (4), 1441-1453 (2012).
- Forbes, J. M. Mitochondria-power players in kidney function. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (7), 441-442 (2016).
- Suzuki, T., Furusato, M., Takasaki, S., Ishikawa, E. Giant mitochondria in the epithelial cells of the proximal convoluted tubules of diseased human kidneys. Laboratory Investigation. 33 (6), 578-590 (1975).
- Yuan, Y., et al. Mitochondrial dysfunction accounts for aldosterone-induced epithelial-to-mesenchymal transition of renal proximal tubular epithelial cells. Free Radical Biology & Medicine. 53 (1), 30-43 (2012).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nature Medicine. 21 (1), 37-46 (2015).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney International. 61 (2), 387-395 (2002).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Kamiyama, M., Garner, M. K., Farragut, K. M., Kobori, H. The establishment of a primary culture system of proximal tubule segments using specific markers from normal mouse kidneys. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 5098-5111 (2012).
- Terryn, S., et al. A primary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), F476-F485 (2007).
- Tang, M. J., Suresh, K. R., Tannen, R. L. Carbohydrate metabolism by primary cultures of rabbit proximal tubules. American Journal of Physiology. 256, C532-C539 (1989).
- Gesek, F. A., Wolff, D. W., Strandhoy, J. W. Improved separation method for rat proximal and distal renal tubules. American Journal of Physiology. 253, F358-F365 (1987).
- Vinay, P., Gougoux, A., Lemieux, G. Isolation of a pure suspension of rat proximal tubules. American Journal of Physiology. 241 (4), F403-F411 (1981).
- Taub, M., Chuman, L., Saier, M. H., Sato, G. Growth of Madin-Darby canine kidney epithelial cell (MDCK) line in hormone-supplemented, serum-free medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3338-3342 (1979).
- Chung, S. D., Alavi, N., Livingston, D., Hiller, S., Taub, M. Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium. Journal of Cell Biology. 95 (1), 118-126 (1982).
- Rubera, I., et al. Chloride currents in primary cultures of rabbit proximal and distal convoluted tubules. American Journal of Physiology. 275, F651-F663 (1998).
- Inoue, C. N., et al. Use of cultured tubular cells isolated from human urine for investigation of renal transporter. Clinical Nephrology. 53 (2), 90-98 (2000).
- Van der Hauwaert, C., et al. Isolation and characterization of a primary proximal tubular epithelial cell model from human kidney by CD10/CD13 double labeling. PLoS One. 8 (6), e66750 (2013).
- Helbert, M. J., Dauwe, S. E., Van der Biest, I., Nouwen, E. J., De Broe, M. E. Immunodissection of the human proximal nephron: flow sorting of S1S2S3, S1S2 and S3 proximal tubular cells. Kidney International. 52 (2), 414-428 (1997).
- Wen Ding, K. Y., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Quadri, J. A., et al. Fluoride-associated ultrastructural changes and apoptosis in human renal tubule: a pilot study. Human & Experimental Toxicology. , (2018).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Condorelli, L., et al. Effect of fluid shear stress on tubular kidney epithelial cell structure. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. 25 (10), 50-52 (2009).
- Aschauer, L., et al. Delineation of the key aspects in the regulation of epithelial monolayer formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (13), 2535-2550 (2013).
- George, S. K., et al. Potential use of autologous renal cells from diseased kidneys for the treatment of renal failure. PLoS One. 11 (10), e0164997 (2016).
- Elberg, G., et al. MKL1 mediates TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression in human renal epithelial cells. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 294 (5), F1116-F1128 (2008).
- Elberg, G., Guruswamy, S., Logan, C. J., Chen, L., Turman, M. A. Plasticity of epithelial cells derived from human normal and ADPKD kidneys in primary cultures. Cell and Tissue Research. 331 (2), 495-508 (2008).
- Cai, Q., et al. Toxicity of acetaminophen, salicylic acid, and caffeine for first-passage rat renal inner medullary collecting duct cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 306 (1), 35-42 (2003).
- Zhao, Y., et al. Isolation and epithelial co-culture of mouse renal peritubular endothelial cells. BMC Cell Biology. 15, 40 (2014).
- Barros, M. H., Hauck, F., Dreyer, J. H., Kempkes, B., Niedobitek, G. Macrophage polarisation: An immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages. PLoS One. 8 (11), e80908 (2013).
- Kim, M., et al. Progression of Alport kidney disease in Col4a3 knock out mice is independent of sex or macrophage depletion by clodronate treatment. PLoS One. 10 (11), e0141231 (2015).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B.
- Bockenhauer, D., et al. Renal phenotype in Lowe Syndrome: a selective proximal tubular dysfunction. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 3 (5), 1430-1436 (2008).
- Ranawaka, R., Dayasiri, K., Gamage, M. A child with distal (type 1) renal tubular acidosis presenting with progressive gross motor developmental regression and acute paralysis. BMC Research Notes. 10 (1), 618 (2017).
