Summary
Detta protokoll ger en kostnadseffektiv metod för att isolera och karakterisera mus primära renal tubulär celler som senare kan vara sub odlas för att bedöma njurfunktion biologiska funktioner ex vivo, inklusive mitokondriell bioenergetik.
Abstract
Mitokondriell dysfunktion i de renala tubulära epitelcellerna (TECs) kan leda till nedsatt fibros, en viktig orsak till kronisk njursjukdom (CKD). Därför kan bedömer mitokondriefunktion i primära TECs ge värdefull insikt i bioenergetiska status av cellerna, som ger insikt i patofysiologin av CKD. Medan det finns ett antal komplexa protokoll finns för isolering och rening av proximala tubuli hos olika arter, saknar fältet en kostnadseffektiv metod som optimerats för tubulär cell isolering utan behov av rening. Här ger vi en isolering protokoll som möjliggör studier med fokus på både primär mus proximal och distal renal TECs. Förutom kostnadseffektiva reagenser och minimal djur förfaranden som krävs i detta protokoll, isolerade celler upprätthålla höga energinivåer efter isolering och kan vara sub odlade upp till fyra passager, vilket möjliggör kontinuerlig studier. Dessutom bedömer vi använder en hög genomströmning extracellulära flux analyzer, mitokondriell respirationen direkt i de isolerade TECs i en plattan med 96 brunnar som ger vi rekommendationer för optimering av cell densiteten och sammansatta koncentration. Dessa observationer tyder på att detta protokoll kan användas för renal tubulär ex vivo -studier med en konsekvent och väl standardiserad produktion av nedsatt TECs. Detta protokoll kan ha bredare framtida tillämpningar att studera mitokondriell dysfunktion är associerad med njursjukdomar för läkemedelsutveckling eller drogen karakterisering ändamål.
Introduction
Renal tubulär epitelial (TEC) cellfunktion är starkt förknippat med det övergripande hälsotillståndet i njuren. Patologisk signalering i njuren orsakar den Dedifferentiering av TECs, som spelar en viktig roll i njure fibros och kronisk sjukdom (CKD)1,2. Som en mycket energisk organ är njuren näst efter hjärtat syreförbrukning, främst genom mitokondriell oxidativ fosforylering3. Elektronmikroskopi studier har visat en positiv korrelation av mitokondriell morfologiska förändringar till patologiska händelser i njurtubuli4. Mitokondriell dysfunktion i TECs orsakar nedsatt fibros genom epitelial till mesenkymala övergången5 och defekta fettsyra oxidation6. Fibros är en progressiv nedsatt patologi som resulterar i CKD. Förstå nedsatt TECs energisk status är därför en nödvändighet för att avslöja patofysiologin av CKD.
I den vuxna njur7finns > 20 celltyper. För att studera funktionen av TECs, behövs en primär kultur av nedsatt epitelceller som en plattform för molekylärbiologi applikationer såsom kemiska behandlingar och genetiska manipulationer. Ännu viktigare, kan genetiska manipulationer göras i vivo i möss via genmodifiering eller via AAV gen leverans tekniker8 så att de isolerade primära cellerna skulle redan vara genetiskt manipulerade. Isolering av primära renal tubulär celler från möss9,10, råttor11,12,13, hörntänder14, kaniner15,16och människor17 ,18 har rapporterats med reningssteg ge ren proximala tubulära cellerna. I dessa tidigare publicerade protokoll som fokuserar på isoleringen av proximala tubulära cellerna, utfördes gradient centrifugering och sortering experiment för rening ändamål19. Medan dessa protokoll är värdefulla för att studera proximala tubuli, är de inte tillräckligt när både proximala och distala tubuli behövs studeras. Till exempel har vår studie om den Alport syndromet avslöjat både proximala och distala njurtubuli spelar viktiga roller i sjukdomsprogression20, som alltså båda sorters i njurtubuli bör utredas i kultur. En färsk studie om nedsatt fluor toxicitet visade också att patologiska förändringar ägde rum i både den proximala och distala tubuli21. Därför är detta isolering protokoll utformade och optimerade för både proximala och distala tubulära celler från mus njurarna med en minimal kostnad av reagenser och enkla rutiner. Alternativt kan utredarna fortfarande följa protokollet fram steg 3.1 och lägga till rening steg9 från denna punkt framåt för isolering av ren proximala tubulära cellerna.
De isolerade cellerna presentera hög energisk nivåer och behålla nedsatt epitelial egenskaper efter sub kulturer till 4 passager. Använder en hög genomströmning extracellulära flux analyzer kan bedöma vi mitokondriell respirationen direkt i de isolerade TECs i en plattan med 96 brunnar, vilket leder till ytterligare insikter i cell densiteten optimering. Dessa observationer tyder på att detta protokoll kan tillämpas på renal tubulär ex vivo -studier med en konsekvent och väl standardiserad produktion av nedsatt TECs. En extra betydelsen av detta protokoll är dess genomförbar användning som en hög genomströmning verktyg för ex vivo karakterisering av mitokondriell blockeringar i nedsatt proximala och distala tubulära cellerna. Därför kan det tjäna som en plattform för läkemedelsutveckling eller drogen karakterisering av njursjukdomar.
Protocol
Alla experiment med djur godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén vid University of Miami, som överensstämmer med NIH riktlinjer.
1. platta beläggning och beredning av reagens
- Förbereda kollagen beläggning:
- Tillsätt 35 μl av kollagen I till 2 mL ättiksyra en pre filtrerade 20 mM på en enda 60mm petriskål. Odla den i rumstemperatur för 1 h, lufttorka det och utsätta det för UV.
- Tvätta beläggning 3 x med PBS ta bort sura rester och spara det i en 37 ° C CO2-fri cell kultur inkubator tills cellerna är klar för sådd. Den slutliga koncentrationen av kollagen beläggningen är 5 μg/cm2.
- Förbereda perfusion buffert: Tillsätt 300 μL av penicillin-streptomycin (P/S) till 30 mL PBS och värma blandningen upp i 37 ° C vattenbad tills isoleringen börjar.
- Förbereda matsmältningen buffert: Lös 3,9 mg kollagenas typ 2 till 30 mL PBS, filtrera lösningen genom ett filter med 0,2-μm i flaska-top och värma upp i ett vattenbad vid 37 ° C tills isoleringen börjar.
- Förbereda cell kulturmassmedia:
- Ta kosttillskott till rumstemperatur. Utan filtrering, lägga till tillägget (0,05 mL av fetalt kalvserum, 10 ng/mL av epidermal tillväxtfaktor, 5 μg/mL av insulin, 0,5 μg/mL adrenalin, hydrokortison, 5 μg/mL av transferrin och 4 pg/mL triiodo-L-thyronine 36 ng/mL) till 500 mL njur epitelceller basala odlingsmedium 2.
- Värm upp media i 37 ° C vattenbad tills den är klar att använda.
- Förbereda föreningar: förbereda 50 mM FCCP, 10 mM rotenon, 10 mM oligomycin, 10 mM antimycin A, 50 mM L-karnitin, 50 mM etomoxir lagerför lösningar allt i DMSO, alikvotens dem och lagra föreningarna vid-20 ° C.
- Förbereda 2,5 mM natrium palmitat i 220 mL av en 150-mM NaCl-lösning och värma lösningen upp i 75 ° C vattenbad tills paliperidonpalmitat är helt upplöst.
- Förbereda bovint serumalbumin (BSA): förbereda 0,34 mM fettfri BSA i 250 mL 150 mM NaCl. Kontrollen BSA fungerar som en negativ kontroll för den palm-BSA-lösning som kan förberedas genom att följa steg 1,8.
- Konjugat av paliperidonpalmitat till BSA (Palm-BSA):
- Tillsätt gradvis palmitat lösningen i BSA lösningen medan den fortfarande är varm. Sedan justera pH till 7,4 och blanda dem vid 37 ° C i minst 1 h att slutföra konjugationen.
- När konjugationen är klar, lägga till ytterligare 150 mL 150 mM NaCl i lösningen, blanda väl och spara alikvoter vid-20 ° C. Den slutliga lösningen innehåller 1 mM natrium palmitat och 0.17 mM BSA och kommer att användas som fettsyra substrat för cellerna i en fettsyra-baserade extracellulära flux-analys.
- Förbereda extracellulära flux assay basala media:
- Tillsätt 1 påse DMEM pulver och 20 mL 200 mM L-glutamin (4 mM slutlig) till 1 L av Ånghärdad dH2O och blanda försiktigt.
- På dagen för bioenergetik experimentet, lägga till 100 µM natrium pyruvat beredda basala media för efterföljande beredningar av extracellulära flux assay media som ska användas i en glukos- eller fettsyra - baserade respiration-analys.
- Förbereda glukos-baserad media:
- För att mäta cellandningen kapacitet genom glykolys, lägga till 17,5 mM glukos pulver, 100 µM kontroll BSA (som beskrivs i steg 1,7) och 20 µM etomoxir (som hämmar fettsyra oxidation) till basala media beskrivs ovan i steg 1,9.
- Värm upp media vid 37 ° C, justera pH till 7,4 och hålla det i 37 ° C vattenbad tills den används i ett extracellulära flux test.
- Förbereda fettsyra-baserade medier:
- För att mäta cellandningen kapacitet genom fettsyra oxidation, lägga till 10 mM 2D-glukos pulver (glukos analoga hämma glykolys), 100 µM Palm-BSA (som beskrivs i steg 1,8) och 100 µM L-carnitin till basala media ovan beskrivna i steg 1,9.
- Värma upp media vid 37 ° C, justera pH till 7,4 och hålla det i 37 ° C vattenbad tills den används i extracellulär flux-analysen.
2. perfusion, matsmältning och skörd njurar från möss
- Söva musen med ett isofluran flöde och fixa det i ryggläge. Kontrollera att isoleringen börjar endast efter djuret förlorar dess rätande reflexer och bedövningsmedel djupet övervakas av nypa bedömningar med atraumatiska pincett före och under förfarandet22.
- Ta bort päls, med en hårborttagningsprodukter kräm, från musens bröstet till dess buken, desinficera det med jod och torka det jod rest.
- Gör ett snitt i bröstet, skära huden för att öppna hela buken och exponera hjärta och njurar.
- Ställ in en perfusion pump vid 32 mL/min och ta bort eventuella bubblor i slangen innan du börjar perfusionen.
- Infoga en 27-G nål i den vänstra ventrikeln genom hjärtat apexen så snart bufferten fylls med hjärtat och peta höger förmak för att skapa en exit så perfusion bufferten cirkulerar som hjärtat pumpar och så småningom blir bort från avfarten höger förmak.
- Efter perfusionen, växla pumpens varvtal till 30 mL/min för matsmältningen.
- Efter matsmältningen 20 mL buffert är perfusion genom apexen, ta bort båda njurarna för tubulär cell isolering.
3. vävnad behandling och primär tubulär celler isolering
- Ta bort nedsatt kapslar och medulla, finhacka båda njurarna i små bitar och inkubera dem i 10 mL av matsmältningen buffert i 37 ° C ugn med varsam rotering för 5 min.
- Ta bort alla osmält njure vävnad genom att passera bufferten genom ett 70-μm filter. Tillsätt 10 mL odlingssubstrat att stoppa matsmältningen.
- Samla in tubulära cellerna, Centrifugera filtrerade cellsuspension vid 50 x g i 5 min till samla den första pelleten. Överför supernatanten till en ny tub och tillsätt 5 mL odlingssubstrat, Centrifugera det vid 50 x g i 5 min att säkerställa alla tubulär celler samlas i andra pelleten.
Centrifugeringen är vid en lägre hastighet till primärt pellet tunga tubuli. Senare, efter cellerna återhämta sig från isolering, är ren tubulär kulturen centrifugeras vid en högre hastighet under subkulturer. - Återsuspendera första pelleten i 20 mL odlingssubstrat och centrifugera det 50 x g för 5 min att samla den tredje pelleten.
- Återsuspendera andra och tredje pellets i 1 mL odlingssubstrat. Blanda 10 µL cellsuspension med 10 µL Trypan blå, Fyll blandningen i A handelskammaren en räknande bild och post cellernas viabilitet från automatiskt cell counter (se Tabell för material).
- Utsäde upp till 107 celler (en heterogen befolkning) på en enda 60 mm skål pre belagd med kollagen och låt de tubulära cellerna bifoga övernattning.
4. primär tubulära cellerna subkultur och karakterisering
- Dag 1 efter isolering, samla kultur media och centrifugera det 50 x g för 5 min till pellet någon flytande tubuli. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 4 mL färsk kultur media och plattan tillbaka till samma kultur skålen.
- På dag 4 efter isolering, ta bort gamla kultur media och lägga till färska media.
- Dag 7 efter isolering, lossa cellerna genom inkubering vid 37 ° C i 2 mL av 0,25% trypsin-EDTA för 5 min. Tillsätt 3 mL odlingssubstrat att stoppa reaktionen och samla cellerna genom centrifugering vid 250 x g i 5 min.
- För att sub kultur och karakterisera cellerna från P0 till P1, belagd utsäde 5.000 celler per brunn på 24-väl plåt med kollagen jag som beskrivs ovan.
- 24 h efter steg 4,4, fixa cellerna på P1 med 4% PFA för 10 min, permeabilize dem med 0,2% Triton x-100 för 3 min, och blockera dem med 10% åsna serum (DS) för 1 h i rumstemperatur.
- Späd, till 1: 100 i 10% DS, var och en av de följande proteinerna: den proximala tubulära markörer angiotensinogen (AGT) och akvaporinet 1 (AQP1); den distala tubulära markören E-cadherin; systemet markören CD90/Thy1; och den makrofag markörer EGF-liknande modul som innehåller mucin-liknande hormonreceptor-som 1 (F4/80) och kluster av differentiering 68 (CD68), och inkubera dem med celler över natten vid 4 ° C.
- Nästa dag, upptäcka någon färgning använda 1: 200 anti-kanin, antimus eller anti råtta fluorescerande sekundära antikroppar för 45 min. Ta bilder under konfokalmikroskopi bekräfta uttrycket av markörer, som visas i figur 2A.
- Dag 3 efter subkultur av P1, lossa cellerna för en subkultur och karakterisering på P2 genom en färgning av tubulär, systemet och makrofag markörerna beskrivs i steg 4,5. Bilden är infärgning under konfokalmikroskopi bekräfta uttrycket av markörer, som visas i figur 2A.
- Dag 3 efter subkultur av P2, lossa cellerna för en subkultur och karakterisering på P3 genom en färgning av tubulär, systemet och makrofag markörerna beskrivs i steg 4,5. Bilden är infärgning under konfokalmikroskopi bekräfta uttrycket av markörer, som visas i figur 2A.
- Förbered den vävnad färgning:
- Lufttorka frysta vildtyp och Col4a3- / - njure diabilder för 1 h i rumstemperatur och fixa dem med 4% PFA för 10 min. Permeabilize dem med 0,2% Triton x-100 i 10 min och blockera dem med 10% åsna serum (DS) för 1 h i rumstemperatur. Lägg till antikroppar mot de markör-proteiner som beskrivs i steg 4,5 på 1: 200 och inkubera dem vid 4 ° C över natten.
- Nästa dag, upptäcka någon färgning med 1: 200 anti-kanin, antimus eller anti råtta fluorescerande sekundära antikroppar för 45 min. Ta bilder under en confocal Mikroskop till bekräfta uttrycket av markörer, som visas i siffror 2B och 2 C.
5. mitokondrier bioenergetik Assay
- Utsäde P1 tubulära cellerna på 20 000, 30 000 eller 40 000 celler per brunn i 100 μL av kultur media till en 96 brunnar mikroplattan belagd pre med 5 μg/cm2 kollagen jag dagen innan de extracellulära flux analyserna.
- För hydratisering av sensorn patronen, lyft patronen sensor och fylla varje väl av plattan med 200 μL av en kalibreringslösning. Noggrant läsa kassetten tillbaka att dränka sensorer i kalibreringslösningen. Placera kassetten i en 37 ° C ugn utan CO2 för minst 7 h före användning.
För bästa resultat rekommenderas övernattning patron återfuktning. - Förbereda föreningarna: förbereder 8 µM oligomycin, 9 µM FCCP och 20 µM Rotenon/antimycin A blandningen i både glukos (som beskrivs i steg 1.10) och fettsyror (beskrivs i steg 1.11) extracellulära flux assay media.
- Ändra media: aspirera cell kulturmassmedia, tillsätt 175 µL av glukos eller fettsyra assay media (beroende av den förening som är arbetas i, se steg 5.3), och inkubera dem för 1 h i en 37 ° C CO2-gratis inkubator.
- Ladda kassetten hamnarna med 25 µL av de följande föreningarna: 8 μM oligomycin för port A uppnå en slutlig koncentration på 1 µM (Obs: som var väl kommer att innehålla 175 µL av media, föreningen får utspädda 8 x), 9 μM FCCP i port B att uppnå en slutlig koncentration på 1 µM (Obs: som vardera innehåller väl 175 µL av media plus 25 µL av lösningen injiceras från port A, föreningen får utspädda 9 x), och 20 µM Rotenon/antimycin A i hamn C att uppnå en slutlig koncentration på 2 µM för varje förening (Obs : som vardera innehåller väl 175 µL av media plus 50 µL av lösningen injiceras från hamnar A och B, föreningen får utspädda 10 x).
- Tillsätt vatten till alla brunnar i port D och alla andra hamnar i bakgrunden brunnarna (inga celler). Inkubera patronen i en 37 ° C CO2-gratis inkubator för 10 min.
- Slå på den extracellulära flux analyzer och handkontrollen.
- Öppna programvaran Analyzer och mata in följande protokoll:
- Välj Standard Assay. Tryck på test guiden. Föreningar på fliken tilldela layouten sammansatta och Använd fliken grupper och etiketter för att märka de experimentella grupperna. Kom ihåg att tilldela de tomma brunnarna (utan celler) som bakgrund.
- Under fliken protokoll , ange följande mix och mäta cykler med tillgängliga kommandon som anges i tabell 1: kalibrera, blanda i 2 min, vänta 2 min, och mäta för 3 min (Upprepa denna cykel 2-3 x); Injicera port A, blanda i 2 min, vänta 2 min, åtgärd för 3 min (Upprepa denna cykel 2-3 x); Injicera port B, blanda i 2 min, vänta 2 min, åtgärd för 3 min (Upprepa denna cykel 2-3 x); Injicera port C, blanda i 2min, vänta 2 min, åtgärd för 3 min (Upprepa denna cykel 2-3 x). Tryck på avsluta guiden. Det är också möjligt att spara den aktuella mallen för framtida bruk.
- Tryck på Starta för att börja kalibreringen. Analysatorn sedan automatiskt matar ut plattan innehavaren och frågar efter patron plattan ska infogas.
- När steget kalibrering görs (vanligen i 20-25 min), trycker du på kommandot prompt att byta patron plattan till cell plattan och fortsätta körningen.
- När körningen är klar, överföra data och ta bort plattan med 96 brunnar. Lägga till Hoechst (1:1, 000) i alla brunnarna och inkubera dem i 5 minuter vid 37 ° C. Normalisera OCR data till celltal genom mätning av Hoechst fluorescensen läsning på en 355-nm excitation och en 460-nm utsläpp.
Representative Results
Njure Perfusion och matsmältningen avkastning mycket livskraftig tubulära epitelceller:
Mus renala tubulära epitelceller isolerades följa stegen i avsnitten 1-3 i det protokoll som beskrivs ovan.
Efter tumörheterogenitet, var en heterogen befolkning av njurceller, ofullständigt smält tubuli och annan vävnad skräp som är mindre än 70 µm guldpläterade på kultur skålen isolering dag. Förändringar från dag 0 till dag 1 efter isolering förväntas oftast ses endast i cell fastsättning snarare i celltillväxten. Titta igenom den flytande heterogen befolkningen, fästes endast ett fåtal tubulär celler vid dag 1 (figur 1A). En ny samling av celler på dag 1, en centrifugering och ett nytt plätering hjälpte till att ta bort lätt skräp och lösa små tubuli bitar för tubulär cell utgåva. Från dag 1 till dag 3 förväntades förändringar inte bara i en bättre cell fastsättning, men också i en anmärkningsvärt förbättrad tillväxt cellhastighet som observerades med tredubbla celldensitet jämfört med dag 1 (figur 1A). I första tillväxtfasen, cellerna bildas flera kolonier och befolkade runt kolonierna. Från denna punkt framåt, isolerade celler var helt återställd och visas en hälsosam spridning. Dag 5 var cellerna på en 80-90% konfluens i en 60 mm petriskål med några blanksteg mellan celler och kolonin till kolonin (figur 1A).
Subkultur och karakterisering av isolerade tubulära cellerna:
Isolerade renala tubulära epitelceller odlades sub för en karakterisering följande stegen som beskrivs i avsnitt 4 i protokollet som beskrivs ovan.
Från dag 5, cellerna helt återhämtat sig från isolering och börjat föröka sig kraftigt. En vecka efter isoleringen, växte cellerna till konfluens i en 60 mm petriskål. Efter 1 vecka i en kultur på passage 0 var cellerna redo att vara sub odlade till passage 1 och därefter för 2 fler passager. Liknande tillväxtmönster observerades i avsnitt 1 och avsnitt 2. Vanligtvis tar det mindre än en vecka för celler på passage 1 och 2 att växa till konfluens för ytterligare subkulturer (figur 1B). Konfluenta celler från passage 0 till passage 2 visade en omfattande dome bildandet23,24 (figur 1B), vilket tyder på att de isolera cellerna upprätthålls en hälsosam status där de utsöndras vätskor liknande kontinuerlig kultur till i vivo status. Detta orsakade enskiktslager av cellerna för att lyfta plattan men hålla kontakten via åtsittande föreningspunkter.
För att karakterisera cellerna i kulturen, utfört vi Immunofluorescerande färgning i de odlade cellerna från passage 1 genom passage 4 samt i en kontroll cell linje-mänskliga proximal renal HK-2 epitelceller. Proximala tubulära markörer, akvaporin 1 (AQP1)25 och angiotensinogen (AGT)9, de distala tubulära markör E-cadherin25, epitelial markör smooth muscle aktin (SMA)26,27,28, makrofag markörer F4/8029 och CD6830, och det systemet markör thymocyte differentiering antigenen 1 (Thy1/CD90)9 användes för karakterisering studierna. Båda proximala tubulära proteiner AQP1 och AGT uttrycktes genomgående högt i isolerade tubulära cellerna från passage 1 till passage 4 såväl som i de positiva kontrollen HK-2 proximala epitelcellerna (figur 2A). Det distala tubulära proteinet E-cadherin uttrycktes i isolerade tubulära cellerna genom passage 4 och observerades också i HK-2 celler (figur 2A). SMA uttrycktes rikligt i de isolera tubulära cellerna och i kontroll HK-2 celler, konsekvent med publicerade rapporter26,27. Däremot, systemet protein Thy1 och makrofag protein F4/80 var frånvarande i både isolerade tubulära cellerna och kontroll HK-2 celler (figur 2A). CD68 visade en minimal uttryck i HK-2 celler och isolerade tubulära cellerna vid passage 1 passage 2 och sedan dess uttryck blev omätbara från passage 3 genom passage 4 (figur 2A). Resultaten tyder på att de celler som isolerats efter detta protokoll är en blandning av proximala och distala tubulära cellerna. För att jämföra uttrycken för dessa markör proteiner i vivo, utfört vi färgning i frysta njurarna vävnader. Tubulär markörer, inklusive AQP1 och E-cadherin, AGT, och systemet protein Thy1 hittades mycket uttryckt i njurarna som skördas från en vildtyp friska mus (figur 2B). Lågt uttryck av F4/80 och CD68 var observerades i vildtyp njurarna men i stor utsträckning uttryckt i njurarna som skördas från en Col4a3- / - mus som utvecklat njursvikt med en makrofag infiltration20,31 ( Figur 2 c).
Mitokondriell bioenergetik test på isolerade primära tubulära cellerna:
De mitokondriella respiration analysstegen beskrivs i avsnitt 5 i det protokollet som beskrivs ovan.
Mitokondriell respirationen av isolerade primära tubulära cellerna mäts av en extracellulär flux analys av syre materialåtgången (OCR) vid olika plätering tätheter. För att titrera plätering tätheten, 20 000, 30 000 och 40 000 primära TECs per brunn var seedad på en 96-väl XF96 mikroplattan dagen innan (ca 20 h innan) extracellulära flux analysen (figur 3A). Efter den extracellulära flux analysen var OCR mätningarna sedan normaliserade till cell räkningarna av en kvantifiering av Hoechst färgning. Plätering i TECs 20 000, 30 000 eller 40 000 celler per brunn resulterade i en genomsnittlig basala OCR 25, 45 eller 50 pmol/min, respektive (figur 3A). Dessutom avslöjade mikroskopiska bilder av pläterad cellerna att 40 000 celler per brunn omfattas hela ytan av botten av mikroplattan brunnarna bättre än den andra plätering täthet (figur 3B). Även om maximal OCR inte ökade använder 40.000 celler jämfört med tätheten av 30.000 celler, rekommenderar vi en cell densiteten på runt 40 000 celler per brunn för optimal interaktioner mellan celler och föreningar.
Dessutom i våra experiment visade den optimala koncentrationen av de hämmande/uncoupler föreningarna sig vara 1 µM oligomycin, 1 µM FCCP och 2 µM Rotenon/antimycin-A (protokoll av extracellulära flux analysen och port injektionerna listas i tabell 1 ; de optimering experiment visas inte). Emellertid, det rekommenderas för alla användare att köra ett preliminärt test med olika koncentrationer av dessa föreningar, helst lägre och högre än den publicera värden, att garanterar bästa resultat.
Ett extracellulära flux test ger ett antal viktiga parametrar för att bedöma blockeringar av nedsatt TECs. Exempelvis som fettsyra oxidation är visat sig vara särskilt defekt i TECs, kan användning av media som innehåller fettsyran substrat (palmitat) tillsammans med hämmaren av glykolys (2 GD) tjäna som ett användbart verktyg för att utvärdera direkt fettsyra oxidation i TECs på passager 1 och 2 (figur 3 c). När det gäller nedsatt fibros förväntas totala andning kapacitet celler vara lägre än för en frisk njure även om glukos-baserad media inte kan avslöja några skillnader.
Sammantaget extracellulära flux analysen, särskilt för att bedöma fettsyra oxidation kapacitet, kan utnyttjas som en informativ åtgärd att utvärdera energisk status för nedsatt TECs till vilka patologiska förändringar som påverkar den bioenergetik profil spelet en viktig roll i nedsatt fibros och progression till njursvikt.
| Steg | Tid (min) |
| Kalibrera | |
| Jämvikt: | 12: 00:00 |
| Mätning 1 | 3 slingor |
| Mix | 02: 00:00 |
| Vänta | 02: 00:00 |
| Åtgärd | 03: 00:00 |
| Mix | 02: 00:00 |
| Vänta | 02: 00:00 |
| Åtgärd | 03: 00:00 |
| Mix | 02: 00:00 |
| Vänta | 02: 00:00 |
| Åtgärd | 03: 00:00 |
| Injicera Port en (1 μM Oligomycin) | 2 slingor |
| Mix | 02: 00:00 |
| Vänta | 02: 00:00 |
| Åtgärd | 03: 00:00 |
| Mix | 02: 00:00 |
| Vänta | 02: 00:00 |
| Åtgärd | 03: 00:00 |
| Injicera Port B (1 μM FCCP) | 2 slingor |
| Mix | 02: 00:00 |
| Vänta | 02: 00:00 |
| Åtgärd | 03: 00:00 |
| Mix | 02: 00:00 |
| Vänta | 02: 00:00 |
| Åtgärd | 03: 00:00 |
| Injicera Port C (2 μM Rotenon/Antimycin) | 2 slingor |
| Mix | 02: 00:00 |
| Vänta | 02: 00:00 |
| Åtgärd | 03: 00:00 |
| Mix | 02: 00:00 |
| Vänta | 02: 00:00 |
| Åtgärd | 03: 00:00 |
Tabell 1. Standardiserade extracellulära flux analys använder protokollet för optimal OCR mätningar i primära tubulära cellerna.
Figur 1. Cellodling av isolerade primära tubulära cellerna. (A) isolerade primära tubulära cellerna fäster tidigt på dag 1 och växa kraftfullt från dag 3 till dag 5. Bilderna tas under 10 X och 20 X mål. (B) denna panel visar en subkultur av isolerade primära tubulär celler från passage 0 till passage 3. Bilderna tas under 10 X och 20 X mål för visioner av cell kupoler, och under ett 40 X-objektiv för en vision av de morfologiska förändringarna genom passager. Scalebar = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Karakterisering av isolerade primära tubulära cellerna. (A) immunfärgning med antikroppar mot proximala tubulära proteiner (AQP1, AGT), en distala tubulära protein (E-cadherin), en epitelial protein (SMA), ett protein som systemet (Thy1) och makrofag proteiner (F4/80, CD68) visar att den isolera primärt tubulära cellerna och efterföljande subkulturer är ren proximala och distala tubulära cellerna. (B) i denna panel visas en färgning av den proximala tubuli, distala tubuli och systemet proteiner i njure vävnad från en hälsosam vildtyp mus som positiv kontroll och en no-primära negativ kontroll. (C) i denna panel visas en färgning av makrofag proteinerna F4/80 och CD68 i njure vävnad som samlats in från en Col4a3- / - mus som positiv kontroll. Scalebar = 20 µm. DAPI visas i blått. Proteinerna som markör visas i grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Extracellulära flux assay i isolerade primära tubulär celler vid olika plätering tätheter. (A) öka cellulär plätering densitet ökar basal respiration nivåerna i primära tubulär celler, testade på passage 3. (B) i denna panel visas mikroskopiska bilder av primära tubulära cellerna odlade på en XF96 mikroplattan seedade på 20 000, 30 000 och 40 000 celler per brunn tätheter. Scalebar = 100 µm. (C), denna panel visar en fettsyra - eller glukos-baserade extracellulära flux-analysen i primära tubulära cellerna på passager 2 och 1. Data är medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Vi optimerad ett protokoll som möjliggör effektiv isolering av mus renala tubulära epitelceller (TECs) och visade att cellerna kan vara sub odlade för en extracellulär flux analys att utvärdera mitokondriella respirationen i närvaro av fettsyra- och/eller glukos-baserade substrat. Detta protokoll är utformad för studier med fokus på både proximala och distala tubulära cellerna och fungerar som en ram som man kan bygga mer komplexa experiment för förståelsen av TEC patologi-associerade njursjukdomar. Jämfört med tidigare publicerade protokoll9,10,19, denna metod kräver inte övertoning separationer med lång centrifugering gånger eller ett gott om antikropp användning för sortering och, därför, erbjuder en mer effektiv och optimerad guide för forskare i fältet för renal tubulär metabola. Det finns flera kritiska steg i detta protokoll, inklusive matsmältning, ny samling, och plätering densitet och sammansatta optimering för extracellulära flux analysen.
Att välja rätt typ av kollagenas och optimala koncentrationen är nyckeln till en framgångsrik matsmältningen och dissociation av tubulära cellerna från nedsatt vävnader. Jämfört med andra typer av kollagenaser, innehåller typ 2 kollagenas relativt högre nivåer av proteas aktivitet, kan separera kompakt nedsatt strukturer. För att minimera risken för förorening till följd av en långvarig perfusion och koktiden, var 0,013% typ 2 kollagenas perfusion vid 30 mL/min. Nedsatt kapseln togs bort först efter båda njurarna hade skördats från djuret och övergår i en steriliserad cell kultur huva. Njurarna var hackad i små bitar och fortsatte sin inkubation med 10 mL av matsmältningen buffert för en annan 5 min för en komplett matsmältning och maximal frisättning av tubulära cellerna.
Även om, efter matsmältningen, vävnad suspensionen leds genom ett 70 µm filter för att ta bort mycket stor vävnad bitar, kommer det fortfarande finnas osmält tubuli som passerar genom filtret och bo inom cellsuspensionen och få klädd på kultur skålen. Det tar längre tid än normalt för dessa tubuli att frigöra tubulära cellerna och fäst ordentligt till kultur skålen. Därför är det ganska viktigt att samla cellsuspensionen och centrifugera det att pellets det okopplade tubuli och celler den andra dagen efter cell plätering. Här låg hastighet centrifugeringssteget ytterligare tar bort andra celltyper som är ljusare än tubulära cellerna och möjliggör okopplade tubuli och tubulära cellerna sedimentera.
Identifiering av rätt cell densiteten är det första och viktigaste steget för en framgångsrik extracellulära flux analys. Resultaten visade att 40 000 celler per brunn på en XF96 mikroplattan är idealisk för primära tubulära cellerna i både en fettsyra och en glukos-baserad respiration assay (figur 3 c). I detta protokoll användes isolerade tubulära cellerna för extracellulära flux analysen på passager 1 och 2. De celler som sub odlas för att passage 3, även om de underhålls ett uttryck för de tubulära markörerna (figur 2) och en anständig prestanda i bioenergetik analyserna (figur 3A), och visade minskad basal respiration nivåer jämfört med passage 2 (visas genom att jämföra OCR i panelerna längst till höger i figur 3A till figur 3 c). Denna minskning kan inte påverka väsentligen friska tubulär celler (till exempel sådana som isolerats från unga vildtyp möss). Dock för studier på celler isolerade från CKD musmodeller som redan har en nedsatt mitokondriell andning, kan högre passager av cellerna orsaka en ytterligare minskning av den basala respirationen som skulle påverka resultaten av extracellulära flux analysen. I studierna bedrivs här, cellerna från både passage 1 och passage 2 visade hög basal respiration nivåer. Vi rekommenderar därför efter detta protokoll, med dessa två tidiga passager för mitokondriell respiration studier med celler isolerade från både friska och sjuka djur. Celler från passage 2 bör fortfarande beaktas om passagen 1 sub kulturen inte ger tillräckligt med celler för flux-analysen. Utöver bioenergetik studier visar vår tidigare forskning att primära TECs på passage 3 kan vara mycket användbart för behandlingar med föreningar följt av proteiner och RNA studier (inga data anges). Som sagt, föreslår vi att utredarna använder detta protokoll för att isolera tubulära cellerna noggrant bör välja optimala passagen för olika forskningsansökningar.
Den arbetande principen av den extracellulära flux analysen bygger på samspelet mellan de injicerade föreningarna och de respiration kedja komplex och effekten av uncoupler. Oligomycin är en hämmare av komplex V (ATP synthase) och används för att skilja ATP-länkade syreförbrukning och syreförbrukningen som krävs för att övervinna den regelbundna proton läckan över en mitokondriell inre membranet32. FCCP uncouples syreförbrukning från ATP produktionen genom att störa den mitokondriella membranpotentialen. Det ger således en mätning av maximal andning kapacitet eftersom det kringgår den begränsade kapaciteten på en proton ion efflux av ATP synthase genom att låta en proton transport genom membranet. Antimycin A, en komplex III-hämmare, och rotenon, ett komplex jag blocker, används i kombination för att stänga ner hela mitokondriell respirationen möjliggör en differentiering mellan den mitokondriella vs. icke-mitokondriell syreförbrukningen i cellerna. Dessa föreningar bör alltid titreras för en viss celltyp innan extracellulära flux analysen att fastställa de optimala koncentrationer som ger den optimala OCR-kurvor. Här, rekommenderar vi 1 µM oligomycin, 1 µM av FCCP och 2 µM av Rotenon/antimycin A för extracellulära flux analysen på primära TECs.
Avslutningsvis ger detta protokoll ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att isolera nedsatt primära proximala och distala tubulära epitelceller som kan användas för att utvärdera mitokondriella bioenergetik ex vivo. Detta protokoll kan vara användbar i en mängd olika molekylärbiologiska studier för att undersöka den biologiska funktionen av renala tubulära epitelceller, erkänner vi sina begränsningar när du tillämpar det på studier behöver ren proximala eller distala tubuli. Exempelvis studier på Lowe syndromet, en selektiv proximala tubulära dysfunktion33eller studier på distal renal tubulär acidos, en distala tubulära dysfunktion34, skulle kräva en mer sofistikerade protokollet för cell isolering och rening. Men ger för majoriteten av de studier som jämför tubuli vs. glomeruli, och för studier till skärmen potentiella mitokondriell respiration tillsynsmyndigheter i tubulära cellerna i allmänhet, protokollet en genomförbar hög genomströmning strategi. Detta protokoll kan därför ha breda program att studera mitokondriell dysfunktion är associerad med njursjukdomar för drug discovery eller målet validering.
Disclosures
Författarna har inget att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av följande bidragen till Lina A. Shehadeh: National Institute of Health (R56HL132209 och 1R01HL140468) och Miami hjärtat Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
| Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
| 2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
| Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
| DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
| Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
| TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
| MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
| Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |
References
- Bielesz, B., et al. Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 4040-4054 (2010).
- Fabian, S. L., et al. Hedgehog-Gli pathway activation during kidney fibrosis. American Journal of Pathology. 180 (4), 1441-1453 (2012).
- Forbes, J. M. Mitochondria-power players in kidney function. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (7), 441-442 (2016).
- Suzuki, T., Furusato, M., Takasaki, S., Ishikawa, E. Giant mitochondria in the epithelial cells of the proximal convoluted tubules of diseased human kidneys. Laboratory Investigation. 33 (6), 578-590 (1975).
- Yuan, Y., et al. Mitochondrial dysfunction accounts for aldosterone-induced epithelial-to-mesenchymal transition of renal proximal tubular epithelial cells. Free Radical Biology & Medicine. 53 (1), 30-43 (2012).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nature Medicine. 21 (1), 37-46 (2015).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney International. 61 (2), 387-395 (2002).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Kamiyama, M., Garner, M. K., Farragut, K. M., Kobori, H. The establishment of a primary culture system of proximal tubule segments using specific markers from normal mouse kidneys. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 5098-5111 (2012).
- Terryn, S., et al. A primary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), F476-F485 (2007).
- Tang, M. J., Suresh, K. R., Tannen, R. L. Carbohydrate metabolism by primary cultures of rabbit proximal tubules. American Journal of Physiology. 256, C532-C539 (1989).
- Gesek, F. A., Wolff, D. W., Strandhoy, J. W. Improved separation method for rat proximal and distal renal tubules. American Journal of Physiology. 253, F358-F365 (1987).
- Vinay, P., Gougoux, A., Lemieux, G. Isolation of a pure suspension of rat proximal tubules. American Journal of Physiology. 241 (4), F403-F411 (1981).
- Taub, M., Chuman, L., Saier, M. H., Sato, G. Growth of Madin-Darby canine kidney epithelial cell (MDCK) line in hormone-supplemented, serum-free medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3338-3342 (1979).
- Chung, S. D., Alavi, N., Livingston, D., Hiller, S., Taub, M. Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium. Journal of Cell Biology. 95 (1), 118-126 (1982).
- Rubera, I., et al. Chloride currents in primary cultures of rabbit proximal and distal convoluted tubules. American Journal of Physiology. 275, F651-F663 (1998).
- Inoue, C. N., et al. Use of cultured tubular cells isolated from human urine for investigation of renal transporter. Clinical Nephrology. 53 (2), 90-98 (2000).
- Van der Hauwaert, C., et al. Isolation and characterization of a primary proximal tubular epithelial cell model from human kidney by CD10/CD13 double labeling. PLoS One. 8 (6), e66750 (2013).
- Helbert, M. J., Dauwe, S. E., Van der Biest, I., Nouwen, E. J., De Broe, M. E. Immunodissection of the human proximal nephron: flow sorting of S1S2S3, S1S2 and S3 proximal tubular cells. Kidney International. 52 (2), 414-428 (1997).
- Wen Ding, K. Y., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Quadri, J. A., et al. Fluoride-associated ultrastructural changes and apoptosis in human renal tubule: a pilot study. Human & Experimental Toxicology. , (2018).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Condorelli, L., et al. Effect of fluid shear stress on tubular kidney epithelial cell structure. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. 25 (10), 50-52 (2009).
- Aschauer, L., et al. Delineation of the key aspects in the regulation of epithelial monolayer formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (13), 2535-2550 (2013).
- George, S. K., et al. Potential use of autologous renal cells from diseased kidneys for the treatment of renal failure. PLoS One. 11 (10), e0164997 (2016).
- Elberg, G., et al. MKL1 mediates TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression in human renal epithelial cells. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 294 (5), F1116-F1128 (2008).
- Elberg, G., Guruswamy, S., Logan, C. J., Chen, L., Turman, M. A. Plasticity of epithelial cells derived from human normal and ADPKD kidneys in primary cultures. Cell and Tissue Research. 331 (2), 495-508 (2008).
- Cai, Q., et al. Toxicity of acetaminophen, salicylic acid, and caffeine for first-passage rat renal inner medullary collecting duct cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 306 (1), 35-42 (2003).
- Zhao, Y., et al. Isolation and epithelial co-culture of mouse renal peritubular endothelial cells. BMC Cell Biology. 15, 40 (2014).
- Barros, M. H., Hauck, F., Dreyer, J. H., Kempkes, B., Niedobitek, G. Macrophage polarisation: An immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages. PLoS One. 8 (11), e80908 (2013).
- Kim, M., et al. Progression of Alport kidney disease in Col4a3 knock out mice is independent of sex or macrophage depletion by clodronate treatment. PLoS One. 10 (11), e0141231 (2015).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthethase system. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Bockenhauer, D., et al. Renal phenotype in Lowe Syndrome: a selective proximal tubular dysfunction. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 3 (5), 1430-1436 (2008).
- Ranawaka, R., Dayasiri, K., Gamage, M. A child with distal (type 1) renal tubular acidosis presenting with progressive gross motor developmental regression and acute paralysis. BMC Research Notes. 10 (1), 618 (2017).
