Summary
이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.
Abstract
신장 관 상피 세포 (TECs)에서 미토 콘 드 리아 기능 장애는 신장 섬유 증, 만성 신장 병 (CKD)의 주요 원인으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 기본 TECs 미토 콘 드 리아 기능 평가 CKD의 이상에 대 한 통찰력을 제공 하는 셀의 bioenergetic 상태에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 분리와 다른 종에 인접 tubules의 정화 하는 데 사용할 수 있는 복잡 한 프로토콜 수 있지만, 필드 정화에 대 한 필요 없이 관 세포 격리에 대 한 최적화 된 비용 효율적인 방법을 결여 된다. 여기, 우리는 두 주에 초점을 맞추고 연구 인접 하 고 원심 신장 TECs 마우스에 대 한 수 있는 격리 프로토콜을 제공 합니다. 비용 효과적인 시 약 및이 프로토콜에 필요한 최소한의 동물 절차, 고립 된 세포 격리 후 높은 에너지 레벨을 유지 하 고 하위 4 구절, 지속적인 연구에 대 한 허용 최대 경작 될 수 있다. 또한, 우리는 우리 세포 밀도 및 화합물 농도의 최적화에 대 한 권장 사항을 제공 96 잘 접시에 격리 TECs에서 직접 미토 콘 드리 아 호흡을 평가 높은 처리량 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여. 이러한 관측 신장 TECs의 일관 된, 잘 표준화 된 생산 신장 관 ex vivo 연구이 프로토콜을 사용할 수 있는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 광범위 한 미래의 응용 프로그램에서 약물 발견 또는 마약 특성화 목적에 대 한 신장 장애와 관련 된 미토 콘 드 리아 기능 장애 연구 할 수 있습니다.
Introduction
신장 관 상피 세포 (TEC) 기능 신장의 전반적인 건강 상태와 강하게 연결 됩니다. 신장에 병 적인 신호 신장 섬유 증 및 만성 신장 병 (CKD)1,2에서 중요 한 역할을, TECs dedifferentiation을 발생 합니다. 높게 정력적 인 기관으로 신장은 주로 미토 콘 드 리아 산화 인 산화3통해 산소 소비량, 심장에만 두 번째. 전자 현미경 연구는 미토 콘 드 리아 형태학 변화 신장 tubules4병 적인 이벤트의 긍정적인 상관 관계를 밝혀 있다. TECs 미토 콘 드 리아 장애 신장 섬유 증에 엽 상피 전환5 와 불완전 지방산 산화6통해 발생합니다. 섬유 증은 CKD 귀착되는 진보적인 신장 병 리 이다. 따라서, 신장 TECs의 에너지 상태를 이해 CKD의 이상 발견 하는 필요 이다.
성인 신장7> 20 종류 있다. TECs의 기능을 공부, 신장 상피 세포의 기본 문화 화학 치료 및 유전자 조작 등 분자 생물학 응용 프로그램을 위한 플랫폼으로 필요 하다. 중요 한 것은, 유전자 조작은 vivo에서 쥐 transgenesis 또는 고립 된 주 세포 유전자 조작 이미 것 있도록 AAV 유전자 전달 기법8 을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 마우스9,10, 쥐11,,1213,14개, 토끼15,16및 인간17에서 기본 신장 관 세포의 고립 ,18 순수 근 관 세포를 정화 단계와 보고 되었습니다. 이 이전에 게시 프로토콜 인접 관 세포의 고립에 초점을, 그라데이션 원심 분리 및 실험 정렬 정화 목적으로19수행 했다. 이러한 프로토콜 인접 tubules 공부에 대 한 귀중 한 동안, 그들은 충분 하지 않습니다 인접 및 원심 tubules 공부 하는 데 필요한 때. 예를 들어 Alport 증후군에 대 한 우리의 연구는 인접 및 원심 신장 tubules20질병 진행 중요 한 역할을 따라서 신장 tubules의 두 종류 문화 조사 한다 밝혔다. 신장 불 화물 독성에 대 한 최근 연구는 또한 병리학 변화 모두는 근 위 및 원심 tubules21에서 개최 했다 다는 것을 보여주었다. 따라서,이 격리 프로토콜 설계 및 시 약 및 간단한 절차의 최소한의 비용으로 마우스 신장에서 인접 하 고 원심 관 세포에 대 한 최적화. 또는 수 사관 수 여전히 프로토콜 단계 3.1까지 따라 하 고 순수한 근 관 세포의 고립에 대 한이 시점에서 정화 단계9 를 추가.
고립 된 세포 높은 에너지 레벨을 제시 하 고 4 구절에 하위 문화 후 신장 상피 특성을 유지. 높은 처리량 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여, 우리 셀 밀도 최적화로 더 통찰력에 이르게는 96 잘 접시에서 격리 TECs에서 직접 미토 콘 드리 아 호흡을 평가 합니다. 이러한 관찰이이 프로토콜 신장 TECs의 일관 된, 잘 표준화 된 생산 신장 관 ex vivo 연구에 적용할 수 있는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 추가 의미 신장 근 위 및 원심 관 세포에서 미토 콘 드리 아 생체 ex vivo 특성에 대 한 높은 처리량 도구로 그것의 가능한 사용 이다. 따라서, 그것은 약물 발견 또는 신장 질환의 약물 특성화 목적을 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
Protocol
모든 실험 동물 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회 마이애미 대학에서 NIH 지침 준수에 의해 승인 되었다.
1. 플레이트 코팅 및 시 약의 준비
- 콜라겐 코팅을 준비:
- 콜라겐의 35 μ 추가 나 단일 60 mm 페 트리 접시에 미리 필터링 된 20 m m 초 산 솔루션의 2 mL. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어, 건조 하 고 자외선에 노출.
- 워시 코팅 어떤 산 성 잔류물을 제거 하 고 37 ° C CO2저장에 PBS 가진 3 배-무료 셀 문화 인큐베이터 셀 시드를 위한 준비가 될 때까지. 콜라겐 코팅의 최종 농도 5 μ g/c m2입니다.
- 관류 버퍼 준비: 30 ml PBS의 페니실린-스 (P/S)의 300 μ를 추가 하 고는 격리 시작 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 혼합 따뜻한.
- 소화 버퍼 준비: 3.9 mg PBS의 30 mL에 콜라 타입 2의 분해, 0.2 μ m 병 상위 필터를 통해 솔루션을 필터링 및 격리 시작 될 때까지 37 ° C에서 물 욕조에 따뜻한 그것.
- 세포 배양 준비:
- 실내 온도에 보충 교재를가지고. 여과 없이 추가 보충 (0.05 mL 태아 송아지 혈 청, 표 피 성장 인자, 인슐린, 피 네 프 린, 날린, 올려진다의 5 μ g/mL 및 triiodo-L-thyronine의 4 pg/mL의 36 ng/mL의 0.5 μ g/mL의 5 μ g/mL의 10 ng/mL)의 신장 500 mL를 상피 세포 성장 기저 미디어 2입니다.
- 37 ° C 물 목욕 사용 준비가 될 때까지 미디어를 따뜻한.
- 혼합물 준비: 50mm FCCP 준비, 10 m m로 테 논, 10mm oligomycin, 10 m m antimycin A, 50 m L-carnitine, m 및 50 mM etomoxir, DMSO, aliquot에서 모든 솔루션을 재고 하 고-20 ° c.에 화합물을 저장
- 2.5 m m 나트륨 물 150 m m NaCl 솔루션의 220 mL에서 준비 하 고는 물 완전히 해산 때까지 75 ° C 물 욕조에 솔루션을 따뜻하게.
- 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 준비: 0.34 m m 지방 없는 BSA 150 mM NaCl의 250 mL에서 준비. 제어 BSA 다음 단계 1.8에 의해 준비 될 수 있는 팜 BSA 솔루션에 대 한 부정적인 컨트롤 역할을 합니다.
- 켤레 BSA (팜-BSA)에 물:
- 추가 물 솔루션 점차적으로 BSA 솔루션에는 여전히는 뜨겁다 동안. 그런 다음 pH 7.4 조정 하 고 완료를 활용 하려면 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 그들을 믹스.
- 활용이 완료 되 면 솔루션에 150 mM NaCl의 또 다른 150 mL을 추가, 잘, 그것을 혼합 및-20 ° c.에 aliquots 저장 최종 솔루션 BSA는 물 및 0.17 m m 1 m m 나트륨을 포함 하 고 셀 세포 외 유출 지방산 기반 분석 결과에 대 한 지방산 기판으로 사용 됩니다.
- 세포 외 유출 분석 결과 기저 미디어 준비:
- 압력가 dH2O의 1 l DMEM 분말 1 봉지와 200 mm L-글루타민 (마지막 4 m m) 20 mL를 추가 하 고 부드럽게 그들을 믹스.
- 생체 실험의 날, 포도 당 또는 지방산 기반된 호흡 분석 결과에서 사용 될 세포 외 유출 분석 결과 미디어의 후속 준비를 위한 준비 기저 미디어를 100 µ M 나트륨 pyruvate를 추가 합니다.
- 포도 당 기반 미디어 준비:
- 분해를 통해 세포 호흡 능력을 측정 하기 위해 기저 미디어 단계 1.9에서에서 위에서 설명한 17.5 m m 포도 당 분말, 100 µ M 제어 BSA (에 설명 된 대로 단계 1.7), 및 (지방산 산화를 억제)를 20 µ M etomoxir을 추가 합니다.
- 37 ° C에서 미디어를 warm, pH 7.4 조정 하 고 그것은 세포 외 유출 분석 결과에서 사용 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 그것을 유지.
- 지방산에 기초를 둔 미디어 준비:
- 지방산 산화를 통해 세포 호흡 능력을 측정, 추가 10 mM 2D 포도 당 분말 (포도 당 분해를 억제 하기 위해 아날로그), 100 µ M L-carnitine 기저 미디어 단계 1.9에서에서 위에서 설명한 팜-BSA (에서 설명한 단계와 1.8), 및 100 µ M.
- 37 ° C에서 미디어를 warm, pH 7.4를 조정 하 고 그것은 세포 외 유출 분석 결과에서 사용 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 그것을 유지.
2. 관류, 소화와 쥐에서 신장 수확
- Anesthetize isoflurane 흐름 마우스 및 부정사 위치에 수정. 고립만 동물의 righting 반사 손실 후에 마 취 깊이 핀치 평가 전과 절차22중 atraumatic 집게를 사용 하 여 모니터링 시작 다는 것을 확인 하십시오.
- 모피, 그것의 복 부 영역에 마우스의 가슴에서 depilatory 크림을 사용 하 여 제거, 요오드, 소독 하 고 요오드 잔여물을 닦아.
- 절 개 가슴에, 전체 복 부 영역을 열고 하는 피부를 잘라 만들고 심장 및 신장 노출.
- 32 mL/min에서 관류 펌프 고에 튜브는 관류를 시작 하기 전에 모든 거품을 제거 합니다.
- 버퍼는 마음을 채우고 자 마자 심장 꼭대기를 통해 좌 심 실에 27 G 바늘을 삽입 하 고 찌를 관류 버퍼 심장 펌프도 순환 하 고 결국 오른쪽 아 트리 움 출구에서 제거 되 면 출구를 만들려고 오른쪽 아 트리 움.
- 재 관류 후 30 mL/min 소화 펌프 속도 전환.
- 소화의 20 mL 후 버퍼 꼭대기 통해 끼얹는다는, 둘 다 신장 관 세포 격리에 대 한 제거.
3. 조직 처리 및 기본 관 세포 격리
- 신장 캡슐과 수 질을 제거 하 고 작은 조각으로 모두 신장 말하다 부드러운 회전 5 분 동안 37 ° C 오븐에서 소화 버퍼의 10 ml에서 그들을 품 어.
- 70 μ m 필터를 통해 버퍼를 전달 하 여 어떤 소화 되지 않은 신장 조직을 제거 합니다. 소화를 막으려고 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.
- 관 세포를 수집, 필터링 된 셀 서 스 펜 션 5 분 첫 번째 펠 릿 수집 50 x g에서 원심. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 배양 기, 원심 분리기 관의 모든 셀을 보장 하기 위해 5 분 동안 50 x g에서 두 번째 펠 릿으로 수집의 5 mL을 추가.
원심 분리는 주로 작은 무거운 tubules를 낮은 속도로. 나중에, 세포는 고립에서 복구, 후 순수 관 문화는 높은 속도에서 하위 문화 중 centrifuged. - 문화 미디어의 20 ml에서 첫 펠 릿을 resuspend 하 고 수집 3 펠 릿을 5 분 동안 50 x g에서 원심.
- 문화 미디어의 1 mL에 두 번째 및 세 번째 펠 릿을 resuspend. Trypan 파랑의 10 µ L로 세포 현 탁 액의 혼합 10 µ L A 세 슬라이드와 기록 자동에서 세포 생존 세포 카운터 ( 재료의 표참조)의 챔버로 혼합물을 로드 합니다.
- 씨앗 107 셀 (이종 인구) 한 60 mm 접시에까지 미리 콜라겐으로 코팅 하 고 하룻밤 연결 관 세포.
4. 주 관 세포 하위 문화 및 특성화
- 분리 후 1 일 문화 미디어를 수집 하 고 어떤 부동 tubules를 펠 렛을 5 분 동안 50 x g에서 원심. 상쾌한을 제거 하 고 신선한 문화 미디어와 같은 문화 접시에 다시 접시의 4 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
- 하루에 4 분리 하 여 후, 오래 된 문화 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어 추가.
- 격리 후 7 일에 0.25 %trypsin-EDTA 반응을 중지 하 고 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 문화 미디어의 5 분 추가 3 ml 2 mL에 37 ° C에서 배양 하 여 세포를 분리 합니다.
- 하위 문화 및 p1 P0에서 셀 특성, 24-잘 접시에 잘 당 씨 5000 셀 코팅 콜라겐과 내가 위에서 설명한 대로.
- 단계 4.4 후 24 h 4% p 1에서 셀을 수정 10 분, PFA 0.2% 그들을 permeabilize Triton X-100 3 분, 실 온에서 1 h에 대 한 10% 당나귀 혈 청 (DS)와 그들을 차단.
- 희석, 1: 100에 10%를 각각 다음 단백질의 DS: 인접 관 마커 angiotensinogen (AGT)와 aquaporin 1 (AQP1); 원심 관 마커 E-cadherin; mesangial 마커 CD90/Thy1; 그리고 대 식 세포 마커 EGF 같은 모듈 포함 하 mucin 같이 호르몬 수용 체-1 (f 4/80) 및 차별화 68의 클러스터 (CD68), 그리고 같은 4 ° c.에 하룻밤 세포와 그들을 품 어
- 다음날, 검출 어떤 얼룩을 사용 하 여 1: 200-토끼, 반대로 마우스, 또는 반대로 쥐 형광 이차 항 체 45 분. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 이미지를 걸릴.
- 3 일, p 1의 하위 문화 후에 단계 4.5에서에서 설명한 관, mesangial, 및 macrophage 마커 얼룩 하위 문화 및 p 2에서 특성화에 대 한 셀 분리 합니다. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 얼룩 이미지.
- 다음날 3 p 2의 하위 문화에 4.5 단계에서 설명한 관, mesangial, 및 macrophage 마커 얼룩 하위 문화와 특성화 P3에 대 한 셀 분리 합니다. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 얼룩 이미지.
- 조직 얼룩 준비:
- 냉동된 야생-타입 및 실 온에서 1 h에 대 한 Col4a3-/- 신장 슬라이드 건조 하 고 그들을 수정 4%와 10 분 대 한 PFA Permeabilize 그들 0.2% 트라이 톤 X-100 10 분 동안 실 온에서 1 h에 대 한 10% 당나귀 혈 청 (DS)와 그들을 차단 하 고. 1: 200에서 4.5 단계에서 설명한 마커 단백질에 대 한 항 체를 추가 하 고 4 ° C에서 밤새 그들을 품 어.
- 다음 날, 1: 200-토끼, 반대로 마우스, 또는 반대로 쥐 형광 이차 항 체 45 분으로 어떤 얼룩을 감지 합니다. 그림 2B 와 2c마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 이미지를 가져가 라.
5. 미토 콘 드리 아 생체 분석 결과
- 20000, 30000, 또는 96-잘 microplate에 문화 미디어의 100 μ에 잘 당 40, 000 셀 씨 P1 관 세포 중 코팅 5 μ g/c m2 콜라겐과 난 세포 외 유출 분석 실험 전날.
- 센서 카트리지 수 화에 대 한 센서 카트리지 들어올린 각 채우기 교정 솔루션의 200 μ와 접시의 잘. 신중 하 게 카트리지를 로드 다시 교정 솔루션에 센서를 잠수함. 적어도 사용 전에 h 7에 대 한 CO2 없이 37 ° C 오븐에 카트리지를 넣습니다.
최상의 결과 얻으려면 하룻밤 카트리지 수 화 것이 좋습니다. - 화합물을 준비: 8 µ M oligomycin, 9 µ M FCCP, 그리고 포도 당 (1.10 단계에서 설명)과 지방산 (에서 설명한 단계 1.11) 세포 외 유출 분석 결과 미디어에서 20 µ M로 테 논/antimycin A 혼합 준비.
- 미디어 변경: 셀 문화 미디어 발음, 포도 당 또는 지방산 분석 결과 미디어의 175 µ L 추가 (은 화합물에 따라, 근무 중인 단계 참조 5.3), 고 37 ° C 공동2에서 1 시간에 대 한 그들을 품 어-무료 보육.
- 다음 화합물의 25 µ L 카트리지 포트 로드: 8 μ M oligomycin 포트 A 1 µ M의 최종 농도 달성 하기 위한 (참고: 각 잘 미디어의 175 µ L 포함 됩니다, 화합물 희석된 8 얻을 것 이다 x), 9 μ M 1의 최종 농도 달성 하기 위해 포트 B FCCP µ M (참고: 화합물 희석된 9를 얻을 것 이다으로 각각 잘 포함 미디어의 175 µ L 플러스 포트 A에서 주입 솔루션의 25 µ L, x), 그리고 20 µ M로 테 논/antimycin A 포트 C (참고 각 화합물에 대 한 2 µ M의 최종 농도 달성 하기에 : 화합물 희석된 10를 얻을 것 이다 미디어의 175 µ L 플러스 50 µ L A와 B 포트에서 주입 하는 솔루션의 각 잘 포함 됩니다, x).
- 포트 D에 있는 모든 우물과 배경 웰 스 (셀)의 다른 모든 포트에 물을 추가 합니다. 37 ° C 공동2카트리지를 품 어-10 분 동안 무료 보육.
- 세포 외 유출 분석기와 컨트롤러를 켭니다.
- 분석기 소프트웨어를 열고 다음 프로토콜을 입력:
- 표준 분석 결과선택 합니다. 분석 결과 마법사를 누릅니다. 화합물 탭을 사용 하 여 복합 레이아웃을 할당 하 고 실험적인 그룹을 그룹 및 레이블 탭을 사용 하 여. 배경으로 (셀) 없이 빈 우물을 할당 하도록 하십시오.
- 프로토콜 탭에서 표 1에 표시 된 대로 사용할 수 있는 명령을 사용 하 여 다음 믹스 및 측정 주기 설정: 보정, 믹스 2 분, 2 분, 대기 3 분을 위한 측정 (이 사이클을 반복이 2-3 배); 포트 A, 2 분 대 혼합을 주사, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 주기 반복 2-3 배); 포트 B를 주입, 2 분 동안 혼합, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 주기 반복 2-3 배); 포트 C를 주입, 2 분 동안 혼합, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 사이클을 반복 2-3 배). 결국 마법사를 누릅니다. 그것은 또한 나중에 사용할 현재 서식 파일을 저장할 수입니다.
- 보정을 시작 하려면 시작 을 누릅니다. 분석기 자동으로 배출 플레이트 홀더 그리고 카트리지 플레이트를 삽입에 대 한 요청.
- 교정 단계 이루어집니다 (일반적으로 20-25 분), 셀 접시에 카트리지 플레이트를 변경 하 고 실행을 계속 하려면 프롬프트 명령을 누릅니다.
- 실행이 완료 되 면 데이터를 전송 하 고 96 잘 접시를 제거 합니다. 분석 결과 우물의 각 Hoechst (1:1, 000)를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 그들을 품 어 355 nm 여기와 460 nm 방출에서 읽고 Hoechst 형광의 측정에 의해 세포 수를 OCR 데이터를 정상화.
Representative Results
신장 관류 및 소화 얻을 매우 가능한 관 상피 세포:
마우스 신장 관 상피 세포 격리 프로토콜 위에서 설명한 섹션 1-3에에서 설명 된 단계를 따라 했다.
소화, 후 신장 세포, 불완전 하 게 소화 tubules 및 70 µ m 보다 작은 다른 조직 파편의 이종 인구 격리 당일 문화 접시에 도금 했다. 변경 0 1 일 후 격리 보통 셀 첨부 파일에만 아니라 세포 성장에 볼 것으로 예상 됩니다. 부동 이기종 인구 통해 찾고 몇 관 셀만 하루 1 (그림 1A)에 붙어 있었다. 하루 1 셀, 원심 분리, 그리고 다시 도금의 다시 컬렉션 가벼운 파편을 제거 하 고 관 셀 릴리스에 대 한 작은 관 조각 정착을 도움. 3 일에 1 일에서 더 나은 셀 첨부 파일 뿐만 아니라 (그림 1A) 1 일에 비해 3 배 세포 밀도와 관찰 되었다 눈에 띄게 향상 된 세포 성장 율에 변화가 예상 했다. 초기 성장 단계에서 셀 여러 식민지를 형성 하 고 식민지 주위 채워집니다. 이 시점에서 앞으로, 격리 된 세포 완 치 했다 고 건강 한 확산을 표시. 일별 5 셀 셀 셀 및 식민지 식민지 사이의 일부 공백을 60 mm 페 트리 접시에 80-90 %confluency (그림 1A) 했다.
하위 문화와 격리 된 관 세포의 특성:
격리 된 신장 관 상피 세포 하위 특성 다음 단계는 위에서 설명한 프로토콜의 섹션 4에에서 명시 된에 대 한 교양 했다.
5 일에서 셀 완전히 고립에서 발견 하 고 적극적으로 확산 하기 시작 했다. 1 주일 후 격리, 셀 60 mm 페 트리 접시에 confluency 되었다. 1 주일 후 통로 0에 문화에서 셀 통로 1 하 고, 그 후, 2 더 많은 구절을 하위 경작 될 준비 했다. 비슷한 성장 패턴 1 통로 및 통로 2에서 관찰 되었다. 일반적으로, 그것은 1과 2 추가 하위 문화 (그림 1B)에 대 한 confluency 성장에 통로에 셀에 대 한 1 주일 미만 걸립니다. Confluent 셀 통로 0에서 통로 2는 광범위 한 돔 형성23,24 (그림 1B), 고립 된 세포를 건강 한 유지 하는 것을 건의 했다 상태로 어디 그들은 비슷한 액체를 배설의 지속적인 문화 하는 비보에 상태. 이 접시에서 리프트 하지만 꽉 연결을 통해 연결 상태를 유지 하는 세포의 단층을 발생 합니다.
문화에 있는 세포의 특성, 우리는 immunofluorescent 얼룩이 지는 제어 셀 라인-인간 근 신장 상피 홍콩-2 셀에 뿐만 아니라 통로 4를 통해 통행 1에서에서 경작된 한 세포에 수행 합니다. 근 관 마커, aquaporin 1 (AQP1)25 및 angiotensinogen (AGT)9, 원심 관 마커 E cadherin25, 상피 마커 부드러운 근육 걸 (SMA)26,27,28, 대 식 세포 마커 F4/8029 와 CD6830, 그리고 mesangial 마커 thymocyte 차별화 항 1 (Thy1/CD90)9 특성 연구를 위해 사용 되었다. 두 근 관 단백질 AQP1 및 AGT 일관 되 게 높은 긍정적인 제어 홍콩 2 근 상피 세포 (그림 2A)에서 통로 4도 1 통로에서 격리 된 관 세포에 표현 되었다. 원심 관 단백질 E cadherin 통로 4 통해 격리 된 관 세포에 표현 하 고 또한 홍콩-2 셀 (그림 2A)에서 관찰 되었다. SMA는 제어 홍콩-2 셀, 게시 된 보고서26,27일치에 격리 된 관 세포에 풍부 하 게 표현 했다. 다른 한편으로, mesangial 단백질 Thy1 및 대 식 세포 단백질 F4/80 결 석 했다 고립 된 관 세포에 제어 홍콩-2 셀 (그림 2A). CD68 홍콩-2 셀에는 최소한의 식 그리고 통로 1 및 통로 2, 그리고 그 표현에서 고립 된 관 세포에서 3 통과 통로 4 (그림 2A)에서 탐지 되었다. 결과이 프로토콜에 따라 고립 된 세포는 인접 하 고 원심 관 세포의 혼합 것이 좋습니다. 이러한 마커 단백질에서 생체 내에의 식을 비교 하려면 우리 냉동된 신장 조직에 얼룩 수행. 관 마커, 높은 표현 야생-타입 건강 한 마우스 (그림 2B)에서 수확 하는 신장에 발견 되었다 AQP1, AGT, 및 E-cadherin mesangial 단백질 Thy1를 포함 하 여. F4/80 및 CD68의 낮은 표현 야생-타입 신장에서 관찰 하지만 신장 신장 실패는 대 식 세포 침투20,31 ( 를 개발 Col4a3-/- 마우스에서 수확에 광범위 하 게 표현 그림 2C).
고립 된 주 관 세포에서 미토 콘 드리 아 생체 분석 결과:
미토 콘 드리 아 호흡 시험 단계는 위에서 설명한 프로토콜의 섹션 5에에서 설명 되어 있습니다.
고립 된 주 관 세포의 미토 콘 드리 아 호흡 산소 소비 속도 (OCR) 다른 도금 밀도에 한 세포 외 유출 분석에 의해 측정 됩니다. 도금 밀도 적정에 20000, 30000, 40000 기본 TECs 잘 당 했다 시드 96 잘 XF96 microplate에 하루 전에 (약 20 전에 h) 세포 외 유출 분석 결과 (그림 3A). 세포 외 유출 분석에 따라 OCR 측정 했다 다음 셀 카운트에 Hoechst 얼룩의 정량화에 의해 정규화 됩니다. 도금 TECs에 20000, 30000, 또는 40, 000 셀/잘 결과 25, 45, 또는 50 pmol/min의 평균 기저 OCR에 각각 (그림 3A). 또한, 도금된 세포의 현미경 이미지 공개 40, 000 셀/잘 적용 (그림 3B) 다른 도금 밀도 보다 더 미 판 우물의 바닥의 전체 표면. 최대한 OCR 30000 세포의 밀도에 비해 40, 000 셀을 사용 하 여 증가 하지 않았다, 비록 셀/잘 셀과 화합물 사이의 최적의 상호 작용을 위해 약 40, 000의 세포 밀도 권장 합니다.
또한, 우리의 실험에서 억제/uncoupler 화합물의 최적 농도 1 µ M oligomycin, 1 µ M FCCP와 2 µ M로 테 논/antimycin-A (세포 외 유출 분석 결과 및 포트 주사의 프로토콜 표 1에에서 나열 된 것으로 표시 했다 ; 최적화 실험 표시 되지 않습니다). 그러나,이 좋습니다 이상적으로 낮은 하 고 게시 된 값 보다 더 높은이 화합물의 다양 한 농도와 예비 테스트를 실행 하는 모든 사용자에 대 한 최상의 결과 보증 하기 위하여.
세포 외 유출 분석 결과 신장 TECs의 생체를 평가 하기 위한 중요 한 매개 변수를 생성 합니다. 예를 들어, 지방산 산화 특히 TECs에 결함이 있는 것 같이 지방산 기판 (물)의 분해 (2 DG) 억제제와 함께 포함 된 미디어의 사용으로 사용할 수 있습니다 직접 TECs에서 지방산 산화를 평가 하는 유용한 도구 구절 들 1, 2 (그림 3C)에서 신장 섬유 증의 경우 셀의 전반적인 호흡 용량 포도 당 기반 미디어 수 있습니다 어떤 차이 공개 하지도 건강 한 신장 보다 낮은 될 것으로 예상 된다.
함께 찍은, 세포 외 유출 분석 결과, 특히 지방산 산화 용량을 평가 하기 위해 이용 될 수 있다 신장 TECs 생체 프로 파일 재생에 영향을 미치는 어떤 병 적인 변화에의 에너지 상태를 평가 하는 유익한 수단으로는 주요 역할 신장 섬유 증과 신부전을 진행.
| 단계 | 시간 (분) |
| 보정 | |
| Equilibrate: | 00시 12분: 00 |
| 측정 1 | 3 루프 |
| 믹스 | 00시 02분: 00 |
| 대기 | 00시 02분: 00 |
| 측정 | 00시 03분: 00 |
| 믹스 | 00시 02분: 00 |
| 대기 | 00시 02분: 00 |
| 측정 | 00시 03분: 00 |
| 믹스 | 00시 02분: 00 |
| 대기 | 00시 02분: 00 |
| 측정 | 00시 03분: 00 |
| 주사 (1 μ M Oligomycin) 포트 | 2 루프 |
| 믹스 | 00시 02분: 00 |
| 대기 | 00시 02분: 00 |
| 측정 | 00시 03분: 00 |
| 믹스 | 00시 02분: 00 |
| 대기 | 00시 02분: 00 |
| 측정 | 00시 03분: 00 |
| 포트 B (1 μ M FCCP) 주사 | 2 루프 |
| 믹스 | 00시 02분: 00 |
| 대기 | 00시 02분: 00 |
| 측정 | 00시 03분: 00 |
| 믹스 | 00시 02분: 00 |
| 대기 | 00시 02분: 00 |
| 측정 | 00시 03분: 00 |
| 포트 C (2 μ M Rotenon/Antimycin)을 주사 | 2 루프 |
| 믹스 | 00시 02분: 00 |
| 대기 | 00시 02분: 00 |
| 측정 | 00시 03분: 00 |
| 믹스 | 00시 02분: 00 |
| 대기 | 00시 02분: 00 |
| 측정 | 00시 03분: 00 |
표 1입니다. 기본 관 세포에 최적의 OCR 측정에 대 한 프로토콜을 실행 하는 세포 외 유출 분석 표준화.
그림 1입니다. 세포 격리 된 기본 관 세포의 배양. (A) 격리 기본 관 셀 일찍 하루 1에서 연결 및 견고 하 게 3 일에서 5 일 성장. 10 X 20 X 목적과 이미지에서 가져옵니다. (B)이이 패널 통로 3에 통로 0에서 격리 된 기본 관 세포의 하위 문화를 보여줍니다. 10 배, 20 X 목표 셀 돔 및 형태학 상 변화는 구절을 통해의 비전에 대 한 40 X 목표 아래 비전에 대 한 이미지에서 가져옵니다. scalebar = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 고립 된 주 관 세포의 특성. (A) Immunostaining (AQP1, AGT) 근 관 단백질, 원심 관 단백질 (E-cadherin), 상피 단백질 (SMA), mesangial 단백질 (Thy1), 및 대 식 세포 단백질 (F4/80, CD68)에 대 한 항 체와 격리 된 주 쇼 관 세포 및 이후의 하위 문화는 순수 인접 하 고 원심 관 세포 이다. (B)이이 패널 긍정적인 제어 및 아니 기본 부정적인 제어로 근 관, 원심 관, 및 건강 한 야생-타입 마우스에서 신장 조직에서 mesangial 단백질의 얼룩을 보여줍니다. (C)이이 패널 긍정적인 컨트롤로 Col4a3-/- 마우스에서 수집 하는 신장 조직에서 대 식 세포 단백질 F4/80 및 CD68의 얼룩을 보여줍니다. Scalebar = 20 µ m. DAPI에서 파란색으로 표시 됩니다. 마커 단백질은 녹색으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 다른 도금 밀도에 고립 된 주 관 세포 분석 결과 세포 외 유출. (A) 증가 세포 밀도 도금 향상 기본 관 세포에서 기저 호흡 레벨 통로 3에서 테스트. (B)이이 패널이 보여줍니다 현미경 기본 관 세포의 경작 20000, 30000, 40000 셀/잘 밀도에서 시드 XF96 microplate에. Scalebar = 100 µ m. (C)이이 패널 구절 2와 1에서 기본 관 세포에서 지방산 또는 포도 당-기반 세포 외 유출 분석 결과 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
우리 마우스 신장 관 상피 세포 (TECs)의 효율적인 절연을 허용 하는 프로토콜을 최적화 하 고 그 셀 하위 존재 지방산-미토 콘 드리 아 호흡을 평가 하는 세포 외 유출 분석에 대 한 교양 있을 수 있습니다 보였다 또는 포도 당-기반 기판입니다. 이 프로토콜 인접 및 원심 관 세포에 초점을 맞추고 연구 설계 및 TEC 병리학 관련 신장 질병의 이해에 대 한 더 복잡 한 실험을 구축 하는 프레임 워크 역할. 이전에 게시 프로토콜9,,1019에 비해,이 필요 하지 않습니다 긴 원심 분리 시간 또는 충분 한 항 체 사용 그라데이션 분판을 정렬 방법과, 따라서, 더 많은 제공 합니다. 신장 관 대사 분야에서 일 하는 연구원에 대 한 효율적이 고 최적화 된 가이드. 소화, 다시 컬렉션 및 도금 밀도 세포 외 유출 분석 결과 대 한 복합 최적화를 포함 하 여이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다.
콜라와 최적 농도의 올바른 유형을 선택 신장 조직에서 성공적인 소화 관 세포의 분리에 열쇠 이다. Collagenases의 다른 종류에 비해, 2 형 콜라 효소 활동, 소형 신장 구조를 해리의 능력의 상대적으로 높은 수준을 포함 합니다. 장기 관류와 소화 시간 오염 가능성을 최소화 하려면 0.013 %2 형 콜라는 30 mL/min에 끼얹는다. 신장 캡슐 두 신장 동물에서 수확 하 고 멸 균된 셀 문화 후드로 전송 했다 후에 제거 되었다. 신장 작은 조각으로 다진 했다 고 소화 버퍼를 완전 한 소화 관 세포의 최대한 출시에 대 한 또 다른 5 분의 10 mL와 함께 그들의 부 화를 계속 했다.
하지만, 소화, 후 조직 정지는 매우 큰 조직 조각을 제거를 70 µ m 필터를 통해 전달 됩니다, 아직 소화 되지 않은 tubules 필터를 통과 하 고 세포 현 탁 액 내 문화 접시에 도금을 얻이 있을 것입니다. 그것은 이러한 tubules를 관 세포를 문화 접시를 단단히 연결에 대 한 정상 보다 더 긴 시간이 걸립니다. 따라서, 세포 현 탁 액을 수집 하 여 작은 첨부 되지 않은 tubules 및 셀 셀 도금 후 두 번째 날을 원심 오히려 중요 하다. 이 저속 원심 분리 단계는 더 관 세포 보다는 다른 세포 유형 제거 하 고 첨부 되지 않은 tubules 및 관 세포 정착.
적절 한 셀 밀도의 식별 성공적인 세포 외 유출 분석 결과 대 한 첫 번째 주요 단계입니다. 결과 XF96 microplate에 잘 당 40, 000 셀 기본 관 셀 지방산과 포도 당 기반 호흡 분석 결과 (그림 3C)에 대 한 이상적입니다 나타났다. 이 프로토콜에서 격리 된 관 세포 구절 1과 2에서 세포 외 유출 분석 결과 대 한 사용 되었다. 하위 3, 비록 그들이 유지 관 표식 (그림 2)와 (그림 3A), 생체 분석 실험에서 괜찮은 성능을 표현의 통로 2에 비해 감소 기저 호흡 수준을 보여주었다 통로를 경작 하는 세포 ( 그림 3C를 그림 3A 의 오른쪽 패널에서 OCR을 비교 하 여 표시). 이 감소는 (예를 들어 젊은 야생-타입 마우스에서 고립 된 사람) 실질적으로 건강 한 관 세포에 영향을 미치지 않을 수 있습니다. 그러나, 이미 저하 미토 콘 드리 아 호흡 CKD 마우스 모델에서 격리 하는 셀에 대 한 연구, 대 한 세포의 높은 구절 기저 호흡 세포 외 유출 분석 결과의 결과 영향을 미칠 것 이라고 더 감소를 발생할 수 있습니다. 연구에서 통로 1 및 보여준 높은 통로 2 기저 호흡 수준에서 세포, 실시. 따라서,이 프로토콜에 따라 모두 건강 하 고 병에 걸린 동물에서 분리 된 세포와 미토 콘 드리 아 호흡 연구에 대 한 이러한 두 초기 구절을 사용 하 여 것이 좋습니다. 통로 2에서 셀 통로 1 하위 문화 플럭스 분석 결과 대 한 충분 한 세포를 생성 하지 않습니다 경우 고려 사항으로가지고 아직도 한다. 생체 연구 뿐만 아니라 우리의 이전 연구 통로 3에 기본 TECs 단백질 및 RNA 연구 (데이터 표시 되지 않음) 화합물과 치료에 대 한 매우 유용한 수 있습니다 보여줍니다. 그 말했다 하 고, 좋습니다 조사 관 세포를 분리 하는이 프로토콜을 사용 하 여 다른 연구 응용 프로그램에 대 한 최적의 통로 선택 신중 하 게 해야 한다.
세포 외 유출 분석의 작동 원리 삽입 된 화합물과 호흡 사슬 복합물 및는 uncoupler의 효과 사이의 상호 작용을 기반으로 합니다. Oligomycin 복잡 한 V (ATP synthase)의 억제제 이며 ATP 연결 산소 소비와 미토 콘 드리 아 내 막32에 걸쳐 일반 양성자 누출을 극복 하는 데 필요한 산소 소비를 구별 하는 데 사용 합니다. FCCP 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 방해 하 여 ATP 생산에서 산소 소비를 uncouples. 따라서, 그것은 그것은 멤브레인을 통해 양성자 전송 함으로써 ATP synthase에 의해 양성자 이온 경과의 제한 된 용량 circumvents로 최대한 호흡 능력의 측정을 제공 한다. Antimycin-A, 복잡 한 III 억제제, 그리고로 테 논, 복잡 한 내가 차단, 허용은 미토 콘 드리 아 대 사이 감 별 법에 비-미토 콘 드 리아 산소 소비 전체 미토 콘 드리 아 호흡을 조합에서 이용 된다 셀입니다. 이 화합물은 최적의 OCR 곡선을 생성 하는 최적의 농도 결정 하는 세포 외 유출 분석 결과 전에 특정 셀 형식에 대 한 항상 적정 한다. 여기, oligomycin, FCCP의 1 개의 µ M 그리고로 테 논/antimycin A 기본 TECs에 세포 외 유출 분석 결과 대 한의 2 µ M의 1 µ M이 좋습니다.
결론적으로,이 프로토콜에는 신장 주 근 및 원심 관 상피 세포 미토 콘 드리 아 생체 비보 전평가에 사용할 수 있는 격리 하는 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜은 신장 관 상피 세포의 생물학 기능을 탐구 하는 분자 생물학 연구의 넓은 범위에서 유용할 수 있습니다, 우리 순수 인접 또는 원심 tubules를 필요로 하는 연구에 적용의 한계 인정 합니다. 예를 들어 로우 증후군, 선택적인 근 관 부전33또는 원심 신장 관 산 성 증, 원심 관 부전34에 대 한 연구에 대 한 연구 필요 더 정교한 프로토콜 셀 격리 및 정화입니다. 그러나, tubules 대 glomeruli, 비교 연구의 대다수 및 연구 관 세포에 잠재적인 미토 콘 드리 아 호흡 레 귤 레이 터를 일반적으로 화면에 가능한 높은 처리량 접근을 프로토콜에 제공 합니다. 따라서,이 프로토콜 광범위 한 응용 프로그램에서 미토 콘 드리 아 역 기능 약물 발견 또는 대상 유효성 검사 목적으로 신장 장애와 관련 된 공부를 할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 선언할 수 없다.
Acknowledgments
이 작품을 리 나 A. Shehadeh 다음 교부 금에 의해 지원 되었다:는 건강의 국립 연구소 (R56HL132209 및 1R01HL140468)와 마이애미 심장 연구소.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
| Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
| 2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
| Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
| DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
| Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
| TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
| MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
| Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |
References
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