Summary
Questo protocollo fornisce un approccio conveniente per isolare e caratterizzare del mouse primario cellule tubolari renali che possono successivamente essere sub-coltivate per valutare funzioni biologiche renale ex vivo, tra cui bioenergetiche mitocondriali.
Abstract
La disfunzione mitocondriale nelle cellule epiteliali tubolari renali (TECs) può condurre a fibrosi renale, delle principali cause di malattia renale cronica (CKD). Pertanto, la valutazione della funzione mitocondriale in TECs primaria possono fornire informazioni preziose sullo stato bioenergetico delle cellule, fornendo la comprensione nella patofisiologia di CKD. Mentre ci sono una serie di complessi protocolli disponibili per l'isolamento e la purificazione dei tubuli prossimali in specie diverse, il campo manca un metodo conveniente ottimizzato per isolamento delle cellule tubolari senza bisogno di purificazione. Qui, forniamo un protocollo di isolamento che consente per studi focalizzati su entrambi primaria del mouse TECs renale prossimale e distale. Oltre alla convenienti reagenti e minimale animale procedure necessarie in questo protocollo, le cellule isolate mantengono alti livelli di energia dopo l'isolamento e possono essere sub-coltivate fino a quattro passaggi, consentendo continui studi. Inoltre, utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare elevato throughput, valutiamo la respirazione mitocondriale direttamente nel TECs isolato in una piastra a 96 pozzetti per i quali forniamo consigli per l'ottimizzazione della densità delle cellule e la concentrazione di composti. Queste osservazioni suggeriscono che questo protocollo può essere usato per gli studi di tubolare renale ex vivo con una produzione coerenza, ben standardizzato di renale TECs. Questo protocollo può avere più ampie applicazioni future di studiare la disfunzione mitocondriale associata a disturbi renali per scoperta della droga o droga caratterizzazione scopi.
Introduction
Funzione delle cellule epiteliali tubolari renali (TEC) è fortemente associata con la condizione generale di salute del rene. Segnalazione patologiche nel rene causa il dedifferentiation di TECs, che svolge un ruolo importante nella fibrosi del rene e renale cronica (CKD) la malattia1,2. Come un organo altamente energetico, il rene è secondo solo al cuore nel consumo di ossigeno, principalmente attraverso la fosforilazione ossidativa mitocondriale3. Studi di microscopia elettronica hanno rivelato una correlazione positiva dei cambiamenti morfologici mitocondriali di eventi patologici in tubuli renali4. La disfunzione mitocondriale in TECs provoca fibrosi renale attraverso transizione epiteliale di mesenchymal5 e difettoso dell'acido grasso ossidazione6. La fibrosi è una patologia renale progressiva che si traduce in CKD. Quindi, comprendere lo stato energetico di TECs renale è una necessità di scoprire la patofisiologia di CKD.
Ci sono tipi cellulari > 20 nel rene adulto7. Per studiare la funzione di TECs, una coltura primaria di cellule epiteliali renali è necessaria come una piattaforma per applicazioni di biologia molecolare come trattamenti chimici e manipolazioni genetiche. D'importanza, manipolazioni genetiche possono essere fatto in vivo in topi tramite transgenesi o utilizzando AAV gene consegna tecniche8 in modo che le cellule primarie isolate sarebbe già essere manipolate geneticamente. L'isolamento delle cellule tubolari renali primari da topi9,10, ratti11,12,13, canini14, conigli15,16e gli esseri umani17 ,18 è stato segnalato con fasi di purificazione per produrre cellule tubolari prossimali pure. In questi protocolli precedentemente pubblicati che si concentrano sull'isolamento delle cellule tubolari prossimali, centrifugazione su gradiente e l'ordinamento di esperimenti sono stati effettuati per fini di purificazione19. Mentre questi protocolli sono preziosi per lo studio di tubuli prossimali, essi non sono sufficienti quando tubuli sia prossimali e distali sono necessari per essere studiato. Ad esempio, il nostro studio sulla sindrome di Alport ha rivelato che sia prossimali che distali tubuli renali svolgono un ruolo importante nella progressione malattia20, e di conseguenza entrambi i tipi di tubuli renali dovrebbero essere studiati nella cultura. Un recente studio sulla tossicità del fluoruro renale inoltre ha mostrato che le mutazioni patologiche ha avuto luogo in entrambi i tubuli prossimali e distali21. Di conseguenza, questo protocollo di isolamento è progettato e ottimizzato per cellule tubulari distale e prossimale da reni del mouse con un costo minimo di reagenti e semplici procedure. In alternativa, gli investigatori possono ancora seguire il protocollo fino al punto 3.1 e aggiungere purificazione passaggi9 da questo punto in avanti per l'isolamento delle cellule tubolari prossimali pure.
Le cellule isolate presentano alti livelli energetici e mantengono caratteristiche epiteliali renali dopo le sub-culture a 4 passaggi. Utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare elevato throughput, valutiamo la respirazione mitocondriale direttamente nel TECs isolato in una piastra a 96 pozzetti, che porta a ulteriori approfondimenti in ottimizzazione di densità cellulare. Queste osservazioni suggeriscono che questo protocollo può essere applicato agli studi di tubolare renale ex vivo con una produzione coerenza, ben standardizzato di renale TECs. Un ulteriore significato del presente protocollo è suo uso fattibile come uno strumento di alto rendimento per la caratterizzazione di ex vivo della bioenergetica mitocondriale in cellule tubolari renali prossimali e distali. Di conseguenza, può servire come una piattaforma per la scoperta della droga o droga tra gli scopi di caratterizzazione dei disordini renali.
Protocol
Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati approvati dal Comitato uso, presso l'Università di Miami, conforme alle linee guida NIH e istituzionali Animal Care.
1. piastra di rivestimento e preparazione dei reagenti
- Preparare il rivestimento di collagene:
- Aggiungere 35 μL di collagene I a 2 mL di una soluzione di acido acetico prefiltrata 20 mM su un singolo piatto di Petri di 60mm. Incubare a temperatura ambiente per 1 h, e asciugare all'aria ed esporlo ai raggi UV.
- Lavare il rivestimento 3 volte con PBS per rimuovere eventuali residui di acido e salvarlo in una di 37 ° C CO2-incubatrice di coltura cellulare gratuito fino a quando le cellule sono pronte per il seeding. La concentrazione finale del rivestimento del collagene è 5 μg/cm2.
- Preparare il tampone di perfusione: aggiungere 300 μL di penicillina-streptomicina (P/S) a 30 mL di PBS e scaldare il composto a bagnomaria a 37 ° C fino a quando inizia l'isolamento.
- Preparare il tampone di digestione: sciogliere 3,9 mg di collagenasi tipo 2 in 30 mL di PBS, filtrare la soluzione attraverso un filtro di parte superiore della bottiglia di 0,2 μm e riscaldarlo a bagnomaria a 37 ° C fino a quando inizia l'isolamento.
- Preparare terreni di coltura delle cellule:
- Portare i supplementi a temperatura ambiente. Senza filtrazione, aggiungere il supplemento (0,05 mL di siero fetale di vitello, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico, 5 μg/mL di insulina, 0,5 μg/mL di epinefrina, 36 ng/mL di idrocortisone, 5 μg/mL di transferrina e 4 pg/mL di triiodo-L-tironina) a 500 mL di renale 2 medio basale delle cellule epiteliali crescita..
- Scaldare i media in un bagnomaria a 37 ° C fino a quando è pronto per l'uso.
- Preparare composti: preparare 50 mM FCCP, rotenone di 10 mM, 10 mM oligomycin, 10mm antimycin A, 50mm L-carnitina e 50mm etomoxir soluzioni tutto in DMSO, aliquota di riserva loro e memorizzare i composti a-20 ° C.
- Preparare il palmitato di sodio 2,5 mM in 220 mL di una soluzione di NaCl 150 mM e riscaldare la soluzione in un bagno di acqua di 75 ° C finchè il palmitato è completamente dissolto.
- Preparare l'albumina di siero bovino (BSA): preparare 0,34 mM senza grassi BSA in 250 mL di NaCl 150 mM. Il controllo BSA serve come controllo negativo per la soluzione di palm-BSA che può essere preparato dal passaggio 1.8.
- Coniugare il palmitato di BSA (Palm-BSA):
- Aggiungere la soluzione di palmitato gradualmente nella soluzione di BSA mentre è ancora caldo. Quindi, regolare il pH a 7,4 e mescolarli a 37 ° C per almeno 1 h completare la coniugazione.
- Una volta ultimata la coniugazione, aggiungere alla soluzione un altro 150 mL di NaCl 150 mM, mescolare bene e salvare le aliquote a-20 ° C. La soluzione finale contiene 1 mM sodio palmitato e 0,17 mM BSA e verrà utilizzata come un substrato acido grasso per le celle in un'analisi di flusso extracellulare basati su acidi grassi.
- Preparare il supporto basale di flusso extracellulare dosaggio:
- Aggiungere 1 bustina di polvere DMEM e 20 mL di 200 mM L-Glutammina (4mm finale) a 1 L di autoclavato dH2O e mescolare delicatamente.
- Il giorno dell'esperimento bioenergetica, aggiungere 100 µM sodio piruvato ai media basale preparati per le preparazioni successive dei media di flusso extracellulare dosaggio da utilizzare in un'analisi di base respirazione glucosio - o acido grasso.
- Preparare il supporto di base di glucosio:
- Per misurare la capacità di respirazione cellulare attraverso la glicolisi, aggiungere polvere di glucosio di 17,5 mM, 100 µM controllo BSA (come descritto al punto 1.7) e 20 µM etomoxir (per inibire l'ossidazione dell'acido grasso) ai media basali descritti sopra al punto 1.9.
- Scaldare i media a 37 ° C, regolare il pH a 7,4 e tenerlo a bagno d'acqua di 37 ° C fino a quando non viene utilizzato in un'analisi di flusso extracellulare.
- Preparare supporti basati su acidi grassi:
- Per misurare la capacità di respirazione cellulare tramite ossidazione dell'acido grasso, aggiungere polvere di 10 mM 2D-glucosio (glucosio analogico per inibire la glicolisi), 100 µM Palm-BSA (come descritto nel passo 1,8) e 100 µM L-carnitina ai media basale descritto sopra al punto 1.9.
- Scaldare i media a 37 ° C, regolare il pH a 7,4 e tenerlo a bagno d'acqua di 37 ° C fino a quando non viene utilizzato nell'analisi di flusso extracellulare.
2. aspersione, digestione e raccolta dei reni dai topi
- Anestetizzare il mouse con un flusso di isoflurano e fissarlo in posizione supina. Assicurarsi che l'isolamento inizia solo dopo che l'animale perde i suoi riflessi di raddrizzamento e la profondità anestetica è monitorata da valutazioni di pizzico utilizzando Pinze atraumatiche prima e durante la procedura22.
- Rimuovere la pelliccia, usare una crema depilatoria, dal petto del mouse alla relativa zona addominale, disinfettarlo con iodio e pulire il residuo di iodio.
- Fare un'incisione nel torace, tagliare la pelle per aprire l'area intera addominale ed esporre il cuore ed i reni.
- Impostare una pompa di perfusione a 32 mL/min e rimuovere tutte le bolle nel tubo prima di iniziare la perfusione.
- Inserire un ago 27 G nel ventricolo di sinistra attraverso l'apice del cuore, non appena il buffer si riempie il cuore e colpire l'atrio di destra per creare un'uscita in modo che il buffer di aspersione circola come il cuore pompa e alla fine ottiene rimosso dall'uscita dell'atrio di destra.
- Dopo la perfusione, cambiare la velocità della pompa a 30 mL/min per la digestione.
- Dopo 20 mL di tampone di digestione è irrorato attraverso l'apice, rimuovere entrambi i reni per l'isolamento delle cellule tubulari.
3. tessuto lavorazione e primaria tubolare cellule isolamento
- Rimuovere le capsule renale e midollo, tritare entrambi i reni in piccoli pezzi e li Incubare in 10 mL di un tampone di digestione in un forno di 37 ° C con una delicata rotazione per 5 min.
- Rimuovere eventuali tessuti renali non digerito passando il buffer attraverso un filtro di 70 μm. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura per interrompere la digestione.
- Per raccogliere delle cellule tubulari, centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 50 x g per 5 min raccogliere il primo pellet. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e aggiungere 5 mL di terreno di coltura, centrifuga e a 50 x g per 5 min garantire tutte le cellule tubulari sono raccolti nella seconda pallina.
La centrifugazione è a una velocità inferiore a pellet principalmente pesante tubuli. Più tardi, dopo che le cellule recupero dall'isolamento, la coltura pura tubolare viene centrifugata a una velocità superiore durante le sub-culture. - Risospendere il pellet primo in 20 mL di terreno di coltura e centrifugare esso a 50 x g per 5 min raccogliere la terza pallina.
- Risospendere il pellet di secondo e terzo in 1 mL di terreno di coltura. Mix 10 µ l della sospensione delle cellule con 10 µ l di blu di Trypan, caricare la miscela nella camera di un conteggio diapositiva e registrare l'attuabilità delle cellule dall'automatico cell counter (Vedi Tabella materiali).
- Seme fino a 107 celle (una popolazione eterogenea) su un singolo piatto 60mm prerivestiti con collagene e lasciare che le cellule tubulari allegare durante la notte.
4. primaria tubolare cellule sub-cultura e caratterizzazione
- Il giorno 1 dopo l'isolamento, raccogliere mezzi di coltura e centrifugare esso a 50 x g per 5 min a pellet qualsiasi tubuli galleggiante. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 4 mL di terreno di coltura fresco e piastra indietro per lo stesso piatto di cultura.
- Il giorno 4 dopo l'isolamento, rimuovere i vecchi media cultura e aggiungere contenuti multimediali fresco.
- Il giorno 7 dopo l'isolamento, staccare le cellule dal loro incubazione a 37 ° C in 2 mL di tripsina-EDTA 0.25% per 5 min. aggiungere 3 mL di terreno di coltura per arrestare la reazione e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 250 x g per 5 min.
- Per sub-cultura e caratterizzare le cellule da P0 a P1, 5.000 cellule seme per pozzetto su una piastra a 24 pozzetti rivestiti con collagene io come descritto sopra.
- 24 h dopo passo 4.4, fissare le cellule P1 con 4% PFA per 10 min, li permeabilize con 0,2% Triton X-100 per 3 min e bloccarli con 10% siero di asino (DS) per 1 h a temperatura ambiente.
- Diluire, a 1: 100 in 10% DS, ognuna delle seguenti proteine: i marcatori tubolare prossimale angiotensinogeno (AGT) e l'Acquaporina 1 (AQP1); il marker distale tubolare E-caderina; il marcatore mesangial CD90/Thy1; e il macrofago marcatori EGF-like modulo-contenenti mucina-come ormone recettore-come 1 (F4/80) e cluster di differenziazione 68 (CD68) e li incubare con cellule durante la notte a 4 ° C.
- Il giorno successivo, rilevare qualsiasi colorazione utilizzando 1: 200 anti-coniglio, anti-topo o anti-ratto anticorpi fluorescenti secondario per 45 min. Prendere immagini in microscopia confocale per confermare l'espressione dei marcatori, come mostrato nella Figura 2A.
- Il giorno 3 dopo la sub-cultura di P1, staccare le cellule per una sub-cultura e caratterizzazione a P2 da una colorazione dei marcatori tubolari, mesangiali e macrofago descritti al punto 4.5. Immagine la macchiatura sotto microscopia confocale per confermare l'espressione dei marcatori, come mostrato nella Figura 2A.
- Il giorno 3 dopo la sub-cultura di P2, staccare le cellule per una sub-cultura e la caratterizzazione P3 da una colorazione dei marcatori tubolari, mesangiali e macrofago descritti al punto 4.5. Immagine la macchiatura sotto microscopia confocale per confermare l'espressione dei marcatori, come mostrato nella Figura 2A.
- Preparare la macchiatura del tessuto:
- Asciugare all'aria congelata wild-type e Col4a3- / - diapositive di rene per 1 h a temperatura ambiente e fissarle con 4% PFA per 10 min li Permeabilize con 0,2% Triton X-100 per 10 min e bloccarli con 10% siero di asino (DS) per 1 h a temperatura ambiente. Aggiungere gli anticorpi contro le proteine marker descritte nel passaggio 4.5 a 1: 200 e li Incubare a 4 ° C durante la notte.
- Il giorno successivo, rilevare qualsiasi colorazione con 1: 200 anti-coniglio, anti-topo o anti-ratto anticorpi fluorescenti secondario per 45 min. Prendere le immagini al microscopio confocale per confermare l'espressione dei marcatori, come mostrato nelle figure 2B e 2C.
5. i mitocondri bioenergetica Assay
- A 20.000, 30.000 o 40.000 cellule per pozzetto in 100 μL di terreni di coltura su una micropiastra a 96 pozzetti delle cellule tubulari seme P1 prerivestiti con collagene di2 μg/cm 5 io il giorno prima le analisi di flusso extracellulare.
- Per l'idratazione della cartuccia sensore, sollevare la cartuccia sensore e riempire ogni bene della piastra con 200 μL di soluzione di calibrazione. Accuratamente caricare la cartuccia torna a sommergere i sensori della soluzione di taratura. Posizionare la cartuccia in un forno di 37 ° C senza CO2 per almeno 7 ore prima dell'uso.
Per ottenere risultati ottimali, è consigliabile idratazione cartuccia durante la notte. - Preparare i composti: preparare 8 µM oligomycin, 9 µM FCCP e miscela di rotenone/antimycin A 20 µM in sia glucosio (descritto al punto 1.10) e dell'acido grasso (descritto nel passo 1.11) flusso extracellulare analisi media.
- Cambiare il supporto: aspirare i terreni di coltura cellulare, 175 µ l di media di dosaggio del glucosio o acidi grassi (dipende il composto che è in lavorazione, vedi punto 5.3) e li Incubare per 1h a 37 ° C CO2-incubatore gratis.
- Caricare i porti di cartuccia con 25 µ l dei seguenti composti: 8 μM oligomycin per porta A raggiungere una concentrazione finale di 1 µM (Nota: come ognuno conterrà ben 175 µ l di media, il composto sarà possibile ottenere diluito 8 x), 9 μM FCCP in porta B per ottenere una concentrazione finale di 1 µM (Nota: come ognuno conterrà ben 175 µ l di media plus 25 µ l di soluzione iniettata da porta A, il composto sarà possibile ottenere diluito 9 x) e 20 µM a rotenone/di antimycin a porta C per ottenere una concentrazione finale di 2 µM per ogni composto (Nota : come ognuno conterrà ben 175 µ l di media plus 50 µ l della soluzione iniettata da porte A e B, il composto sarà possibile ottenere diluito 10 x).
- Aggiungere acqua a tutti i pozzetti a port D e tutte le altre porte dei pozzi sfondo (senza cellule). Incubare la cartuccia in una di 37 ° C CO2-incubatore gratuito per 10 min.
- Accendere l'analizzatore di flusso extracellulare e il controller.
- Aprire il Software Analyzer e immettere il seguente protocollo:
- Scegliere analisi Standard. Premere test guidata. Utilizzando la scheda di composti , assegnare il layout composto e utilizzare la scheda gruppi ed etichette per etichettare i gruppi sperimentali. Ricordarsi di assegnare i pozzetti vuoti (senza cellule) come sfondo.
- Nella scheda protocollo , impostare i seguenti cicli di mix e misura utilizzando i comandi disponibili come indicato nella tabella 1: calibrare, mix per 2 min, attendere 2 min e misura per 3 min (ripetere questo ciclo x 2-3); iniettare porta A, mix per 2 min, attendere 2 min, misura per 3 min (ripetere questo ciclo x 2-3); iniettare porta B, mescolare per 2 min, attendere 2 min, misura per 3 min (ripetere questo ciclo x 2-3); iniettare porta C, mescolare per 2min, attendere 2 min, misura per 3 min (ripetere questo ciclo 2-3x). Premere fine guidata. È anche possibile salvare il modello corrente per un utilizzo futuro.
- Premere Start per iniziare la calibrazione. L'analizzatore quindi automaticamente espelle il portatarga e chiede per il piatto della cartuccia deve essere inserito.
- Una volta ultimata la fase di calibrazione (di solito in 20-25 min), premere il comando prompt per cambiare il piatto della cartuccia alla piastra e continuare l'esecuzione.
- Quando completata l'esecuzione, trasferire i dati e rimuovere la piastra a 96 pozzetti. Aggiungere Hoechst (1:1, 000) a ciascuno dei pozzetti di saggio e li Incubare per 5 min a 37 ° C. Normalizzare i dati OCR per conteggio delle cellule di una misurazione della fluorescenza della Hoechst lettura in un'eccitazione di 355 nm e un'emissione di 460 nm.
Representative Results
Digestione e perfusione reni producono cellule epiteliali tubolari altamente vitali:
Cellule epiteliali tubolari renali del mouse sono state isolate seguendo le istruzioni riportate nelle sezioni 1-3 del protocollo descritto in precedenza.
Dopo le digestioni, una popolazione eterogenea di cellule del rene, tubuli in modo incompleto digerite e altri residui di tessuto che sono più piccolo di 70 µm sono state piastrate su piastra di coltura il giorno di isolamento. Modifiche dal giorno 0 al giorno 1 dopo l'isolamento di solito dovrebbero essere visti solo in allegato delle cellule piuttosto che nella crescita delle cellule. Guardando attraverso la popolazione eterogenea galleggiante, solo poche cellule tubolari sono state fissate al giorno 1 (Figura 1A). Una ri-raccolta di cellule al giorno 1, una centrifugazione e un ri-placcatura ha contribuito a rimuovere detriti leggeri e saldare i pezzi di piccolo tubulo per il rilascio delle cellule tubulari. Dal giorno 1 al giorno 3, sono state previste modifiche non solo in un migliore collegamento delle cellule, ma anche un tasso di crescita notevolmente migliore delle cellule che è stato osservato con una densità di cella triplicato rispetto al 1 ° giorno (Figura 1A). Nella fase iniziale di crescita, le cellule formano colonie diverse e popolate intorno alle colonie. Da questo punto in avanti, le cellule isolate sono stati completamente recuperate e visualizzati una proliferazione sana. Dal giorno 5, le cellule erano a un confluency di 80-90% in una capsula di Petri 60mm con alcuni spazi tra le celle e la Colonia a Colonia (Figura 1A).
Sub-cultura e caratterizzazione delle cellule tubulari isolate:
Cellule epiteliali tubolari renali isolate sub-sono state coltivate per un seguito di caratterizzazione la procedura descritta nella sezione 4 del protocollo descritto in precedenza.
Dal giorno 5, le cellule completamente recupero dall'isolamento e iniziato a proliferare vigorosamente. Una settimana dopo l'isolamento, le cellule è cresciuto a confluenza in una capsula di Petri 60mm. Dopo 1 settimana in una cultura al passaggio 0, le cellule erano pronte per essere sub-colta al passaggio 1 e, successivamente, per 2 ulteriori passaggi. Modelli di crescita simili sono stati osservati nel passaggio 1 e passaggio 2. Di solito, ci vuole meno di una settimana per celle al passaggio 1 e 2 di crescere di confluenza per ulteriore sub-culture (Figura 1B). La cultura continua di cellule confluenti da passaggio 0 allo stato di passaggio 2 ha mostrato un'ampia cupola formazione23,24 (Figura 1B), suggerendo che le cellule isolate mantenuto un sano dove essi escreto liquidi simili a uno stato di in vivo . Ciò ha causato il monostrato di cellule per sollevare la piastra ma rimanere in contatto tramite giunzioni strette.
Per caratterizzare le cellule nella cultura, abbiamo effettuato la macchiatura immunofluorescente in cellule coltivate dal passaggio 1 tramite il passaggio 4, nonché in un controllo cella linea-umani prossimale renale HK-2 cellule epiteliali. Marcatori di tubolari prossimali, Acquaporina 1 (AQP1)25 e angiotensinogeno (AGT)9, il marker distale tubolare caderina-25, il marcatore epiteliali muscolo liscio actina (SMA)26,27,28, macrofago marcatori F4/8029 e CD6830e l'antigene di differenziazione timociti di mesangial marcatore 1 (Thy1/CD90)9 sono stati utilizzati per gli studi di caratterizzazione. Entrambe le proteine tubolare prossimale AQP1 e AGT sono stati costantemente altamente espressi nelle cellule tubolari isolate dal passaggio 1 al passaggio 4 anche come controllo positivo HK-2 prossimale cellule epiteliali (Figura 2A). La proteina tubulare distale E-caderina è stato espresso nelle cellule tubolari isolate attraverso passaggio 4 e inoltre è stata osservata nelle cellule HK-2 (Figura 2A). SMA è stata espressa abbondantemente nelle cellule tubolari isolate e nelle cellule controllo HK-2, coerente con i rapporti pubblicati26,27. D'altra parte, la proteina mesangial Thy1 e proteina del macrofago F4/80 erano assenti in sia cellule tubulari isolate e le cellule di controllo HK-2 (Figura 2A). CD68 ha mostrato una minima espressione nelle cellule HK-2 e nelle cellule tubulari isolate al passaggio 1 e passaggio 2 e quindi la sua espressione è diventato inosservabile da passaggio 3 passaggio 4 (Figura 2A). I risultati indicano che le cellule isolate seguendo questo protocollo sono un mix di cellule tubulari prossimali e distali. Per confrontare le espressioni di queste proteine marker in vivo, abbiamo effettuato la colorazione nei tessuti renali congelate. Marcatori di tubolari, compreso proteina AQP1, AGT e -caderina e mesangiali Thy1 trovate altamente espresso nei reni raccolti da un mouse sano di selvaggio-tipo (Figura 2B). Basse espressioni di F4/80 e CD68 sono state osservate nel selvaggio-tipo reni ma ampiamente espressa nei reni raccolti da un mouse Col4a3- / - che ha sviluppato l'indebolimento renale con un macrofago infiltrazione20,31 ( Figura 2).
Analisi bioenergetica mitocondriale su cellule tubulari primarie isolate:
La procedura di analisi di respirazione mitocondriale è descritte nella sezione 5 del protocollo descritto in precedenza.
La respirazione mitocondriale delle cellule tubulari primarie isolate è misurata da un'analisi di flusso extracellulare del tasso di consumo di ossigeno (OCR) a densità differente di placcatura. Per titolo la densità di placcatura, 20.000, 30.000 e 40.000 TECs primario per pozzetto sono state seminate su una micropiastra a 96 pozzetti XF96 il giorno prima (circa 20 ore prima) l'analisi di flusso extracellulare (Figura 3A). In seguito all'analisi di flusso extracellulare, le misurazioni di OCR poi sono state normalizzate ai conteggi delle cellule da una quantificazione di Hoechst macchiatura. Placcatura TECs alle 20.000, 30.000 o 40.000 cellule/pozzetto ha provocato un OCR basale medio di 25, 45 o 50 pmol/min, rispettivamente (Figura 3A). Inoltre, immagini microscopiche delle cellule placcate ha rivelato che 40.000 cellule/pozzetto coperto l'intera superficie del fondo dei pozzetti di micropiastra meglio le altre densità di placcatura (Figura 3B). Anche se la massima OCR non è aumentato usando 40.000 cellule rispetto alla densità di 30.000 cellule, si consiglia una densità di cella di circa 40.000 cellule/pozzetto per ottimale interazioni tra cellule e composti.
Inoltre, nei nostri esperimenti, la concentrazione ottimale dei composti inibitori/disaccoppiatore è stata indicata per essere 1 µM oligomycin, 1 µM FCCP e µM rotenone/antimycin-A 2 (i protocolli dei test flusso extracellulare e le iniezioni di Porto sono elencati in tabella 1 ; gli esperimenti di ottimizzazione non sono visualizzati). Tuttavia, è consigliabile per tutti gli utenti di eseguire un test preliminare con le varie concentrazioni di questi composti, idealmente inferiore e superiore ai valori pubblicati, garantisce i migliori risultati.
Un'analisi di flusso extracellulare produce un numero di parametri importanti per valutare la bioenergetica di TECs renale. Per esempio, come l'ossidazione dell'acido grasso è indicato per essere specificamente difettoso in TECs, l'uso di supporti contenenti substrato acido grasso (palmitato) insieme con l'inibitore della glicolisi (2DG) può servire come uno strumento utile per valutare direttamente l'ossidazione dell'acido grasso in TECs ai passaggi 1 e 2 (Figura 3). Nel caso di fibrosi renale, la capacità complessiva di respirazione delle cellule dovrebbe essere inferiore a quella di un rene sano, anche se il supporto basato su glucosio non può rivelare eventuali differenze.
Presi insieme, il dosaggio di flusso extracellulare, soprattutto per valutare la capacità di ossidazione dell'acido grasso, può essere utilizzato come una misura informativa per valutare lo stato energetico di TECs renale in cui cambiamenti patologici che interessano il gioco di profilo di bioenergetica un ruolo importante nella fibrosi renale e la progressione ad insufficienza renale.
| Passaggi | Tempo (min) |
| Calibrare | |
| Equilibrare: | 00:12:00 |
| Misura 1 | 3 anelli |
| Mix | 00:02:00 |
| Attendere | 00:02:00 |
| Misura | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Attendere | 00:02:00 |
| Misura | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Attendere | 00:02:00 |
| Misura | 00:03:00 |
| Iniettare un (1 μM Oligomycin) di porta | 2 asole |
| Mix | 00:02:00 |
| Attendere | 00:02:00 |
| Misura | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Attendere | 00:02:00 |
| Misura | 00:03:00 |
| Iniettare porta B (FCCP 1 μM) | 2 asole |
| Mix | 00:02:00 |
| Attendere | 00:02:00 |
| Misura | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Attendere | 00:02:00 |
| Misura | 00:03:00 |
| Iniettare la porta C (Rotenon/Antimycin 2 μM) | 2 asole |
| Mix | 00:02:00 |
| Attendere | 00:02:00 |
| Misura | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Attendere | 00:02:00 |
| Misura | 00:03:00 |
Tabella 1. Standardizzati di analisi di flusso extracellulare in esecuzione il protocollo per le misurazioni di OCR ottimale in primario delle cellule tubulari.
Figura 1. Colture cellulari di cellule tubulari primarie isolate. (A) le cellule tubulari primarie isolate allegare presto al giorno 1 e crescere robustamente dal giorno 3 al giorno 5. Le immagini sono prese sotto 10 X e 20 X obiettivi. (B), questo pannello mostra una sub-cultura di cellule tubulari primarie isolate dal passaggio 0 al passaggio 3. Le immagini sono prese sotto 10 X e 20 X obiettivi per visioni delle cupole delle cellule e sotto un obiettivo 40x per una visione dei cambiamenti morfologici attraverso i passaggi. La barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Caratterizzazione delle cellule tubulari primarie isolate. (A) Immunostaining con gli anticorpi contro proteine tubolare prossimale (AQP1, AGT), una proteina tubulare distale (E-caderina), una proteina epiteliale (SMA), una proteina di mesangial (Thy1) e proteine del macrofago (F4/80, CD68) mostrano che il primario isolato cellule tubulari e sub-culture successive sono pure cellule tubolari prossimali e distali. (B) questo pannello mostra una colorazione del tubulo prossimale, tubulo distale e mesangiali proteine nei tessuti del rene da un mouse di tipo selvatico sano come controllo positivo e un controllo negativo no primario. (C) questo pannello mostra una colorazione delle proteine del macrofago F4/80 e CD68 nel tessuto del rene raccolti da un mouse Col4a3- / - come controllo positivo. Barra della scala = 20 µm. Il DAPI è indicata in blu. Le proteine marker sono mostrate in verde. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Analisi di flusso extracellulare in cellule tubolari primarie isolate a densità differente di placcatura. (A) aumento cellulare placcatura densità aumenta i livelli di respirazione basale in primario delle cellule tubulari, testato al passaggio 3. (B) questo pannello Mostra immagini microscopiche delle cellule tubulari primarie coltivate su una micropiastra XF96 seminato a 20.000, 30.000 e 40.000 cellule/pozzetto densità. Barra della scala = 100 µm. (C), questo pannello mostra un'analisi di flusso extracellulare basati su acido grasso o glucosio in cellule primarie tubolare ai passaggi 2 e 1. I dati sono la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Abbiamo ottimizzato un protocollo che consente per l'efficiente isolamento delle cellule epiteliali tubolari renali del mouse (TECs) e ha mostrato che le cellule possono essere sub-coltivate per un'analisi di flusso extracellulare valutare la respirazione mitocondriale in presenza di acido grasso- e/o substrati a base di glucosio. Questo protocollo è progettato per studi focalizzati su cellule tubulari distale e prossimale e funge da quadro con cui costruire esperimenti più complessi per la comprensione delle malattie renali associati a patologia TEC. Rispetto ai protocolli precedentemente pubblicati9,10,19, questo metodo non richiede gradiente separazioni con lunghi tempi di centrifugazione o l'utilizzo di un anticorpo ampio per l'ordinamento e, pertanto, offre una più Guida efficiente e ottimizzato per i ricercatori che lavorano nel campo metabolico tubolare renale. Ci sono diversi passaggi critici nel presente protocollo, tra cui la digestione, nuova collezione e densità di placcatura e ottimizzazione composto per il dosaggio di flusso extracellulare.
Scelta del tipo corretto di collagenasi e concentrazione ottimale è la chiave per un successo digestione e dissociazione delle cellule tubulari da tessuti renali. Rispetto ad altri tipi di collagenasi, collagenasi tipo 2 contiene i livelli relativamente elevati di attività della proteasi, in grado di dissociare strutture compatte renale. Per ridurre al minimo le possibilità di contaminazione a causa di una prolungata di aspersione e tempi di digestione, 0,013% collagenasi di tipo 2 è stato irrorato a 30 mL/min. La capsula renale è stato rimosso solo dopo che entrambi i reni sono state raccolte dall'animale e trasferiti in una cappa di cultura cellulare sterilizzato. I reni sono stati macinati in piccoli pezzi e hanno continuato la loro incubazione con 10 mL di un tampone di digestione per un altro 5 min per una digestione completa e il massimo rilascio delle cellule tubulari.
Anche se, dopo la digestione, la sospensione di tessuto viene passata attraverso un filtro da 70 µm per rimuovere i pezzi di tessuto molto grande, ci sarà ancora non digeriti tubuli che passano attraverso il filtro e soggiorno all'interno della sospensione cellulare e ottenere piastrate su piastra di coltura. Ci vuole un tempo più lungo rispetto al normale per questi tubuli rilasciare cellule tubulari e fissare saldamente la piastra di coltura. Di conseguenza, è piuttosto importante raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare per pellet i tubuli non collegati e cellule il secondo giorno dopo la placcatura di cella. Questo passaggio di centrifugazione a bassa velocità ulteriormente rimuove altri tipi di cellule che sono più leggeri di cellule tubulari e consente unattached tubuli e cellule tubulari a stabilirsi.
L'identificazione di densità adeguata delle cellule è il primo e fondamentale passo per un'analisi di flusso extracellulare successo. I risultati hanno mostrato che 40.000 cellule per pozzetto su una micropiastra XF96 è ideale per cellule primarie tubolare in un acido grasso e un test di respirazione a base di glucosio (Figura 3). In questo protocollo, isolate cellule tubolari sono state utilizzate per l'analisi di flusso extracellulare ai passaggi 1 e 2. Le cellule Sub-coltivate di per passaggio 3, anche se hanno mantenuto un'espressione di marcatori tubolari (Figura 2) e un rendimento decente nelle analisi bioenergetica (Figura 3A) e hanno mostrato livelli di respirazione basale in diminuzione rispetto al passaggio 2 (mostrato confrontando OCR nei pannelli a destra della Figura 3A di Figura 3). Questa diminuzione non può influire sostanzialmente sano delle cellule tubulari (ad esempio, quelli isolati dai giovani topi wild-type). Tuttavia, per gli studi su cellule isolate da modelli murini CKD che già hanno una diminuita la respirazione mitocondriale, passaggi superiore delle cellule possono causare una diminuzione ulteriore nella respirazione basale che comprometterebbe i risultati del dosaggio flusso extracellulare. Negli studi condotti qui, le cellule dal passaggio 1 e passaggio 2 hanno mostrato alto livelli di respirazione basale. Pertanto, a seguito di questo protocollo, si consiglia di utilizzare questi due primi passi per gli studi di respirazione mitocondriale con cellule isolate da animali sani e malati. Cellule dal passaggio 2 dovrebbero ancora tener conto se la sub-cultura passaggio 1 non produce cellule sufficienti per il dosaggio di flusso. Oltre agli studi di bioenergetica, la nostra ricerca precedente dimostra che TECs primario al passaggio 3 può essere estremamente utile per i trattamenti con composti seguite da proteine e RNA studi (dati non mostrati). Detto questo, suggeriamo che gli investigatori usando questo protocollo per isolare cellule tubulari dovrebbero scegliere con attenzione il passaggio ottimo per applicazioni di ricerca diversi.
Il principio di funzionamento dell'analisi flusso extracellulare è basato sulle interazioni tra i composti iniettati e i complessi di catena di respirazione e l'effetto del disaccoppiatore. Oligomycin è un inibitore del complesso V (ATP sintasi) ed è usato per distinguere il consumo di ossigeno legata all'ATP e il consumo di ossigeno che è necessaria per superare la perdita regolare protoni attraverso una membrana interna mitocondriale32. FCCP disgiunge il consumo di ossigeno dalla produzione di ATP interrompendo il potenziale di membrana mitocondriale. Così, esso fornisce una misura della capacità massima respirazione come aggira la limitata capacità di un efflusso di ioni del protone di trifosfato di adenosina synthase permettendo un trasporto di protoni attraverso la membrana. Antimycin-A, un inibitore del complesso III e rotenone, un complesso mi blocco, vengono utilizzati in combinazione per arrestare la respirazione mitocondriale intera permettendo una differenziazione tra il mitocondriale contro il consumo di ossigeno non mitocondriale in le cellule. Questi composti dovrebbero sempre essere titolati per uno specifico tipo cellulare prima del dosaggio di flusso extracellulare determinare le concentrazioni ottimale che producono le curve di OCR ottimale. Qui, si consiglia di 1 µM di oligomycin, 1 µM di FCCP e 2 µM di rotenone/antimycin A per il dosaggio di flusso extracellulare il primario TECs.
In conclusione, questo protocollo fornisce un modo semplice e conveniente per isolare primarie prossimali e distali cellule epiteliali tubolari renali che possono essere utilizzate per la valutazione bioenergetica mitocondriale ex vivo. Mentre questo protocollo può essere utile in una vasta gamma di studi di biologia molecolare ad esplorare la funzione biologica delle cellule epiteliali tubolari renali, riconosciamo i limiti quando applicarlo agli studi che necessitano di Puri tubuli prossimale o distale. Ad esempio, studi sulla sindrome di Lowe, una disfunzione tubolare prossimale selettiva33o studi sull'acidosi tubolare renale distale, una disfunzione tubolare distale34, richiederebbe un protocollo più sofisticato per isolamento delle cellule e purificazione. Tuttavia, per la maggior parte degli studi che confrontano tubuli vs glomeruli e per gli studi allo schermo potenziali regolatori di respirazione mitocondriale nelle cellule tubolari in generale, il protocollo prevede un approccio fattibile elevato throughput. Pertanto, il presente protocollo può avere vaste applicazioni per studiare la disfunzione mitocondriale associata a disturbi renali per scopi di convalida di scoperta o destinazione di droga.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni per Lina A. Shehadeh: il National Institute of Health (R56HL132209 e 1R01HL140468) e l'Istituto di ricerca del cuore di Miami.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
| Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
| 2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
| Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
| DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
| Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
| TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
| MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
| Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |
References
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