Summary
Dit protocol biedt een rendabele aanpak om te isoleren en karakteriseren van muis primaire renale tubulaire cellen die vervolgens sub kunnen worden gekweekt om te beoordelen renale biologische functies- ex vivo, met inbegrip van de mitochondriale Bioenergetica.
Abstract
Mitochondriale dysfunctie in de renale tubulaire epitheliale cellen (TECs) kan leiden tot nierinsufficiëntie fibrose, een belangrijke oorzaak van chronische nierziekte (CKD). Beoordeling van mitochondriale functie in primaire TECs kunnen daarom waardevol inzicht in de bio-energetische status van de cellen, inzicht bijbrengen in de pathofysiologie van Cementovenstof. Terwijl er een aantal complexe protocollen beschikbaar voor de isolatie en zuivering van proximale tubuli in verschillende soorten zijn, ontbreekt het veld een kosteneffectieve methode die is geoptimaliseerd voor de tubulaire cel isolatie zonder de noodzaak voor de zuivering. Wij bieden hier een isolatie-protocol waarmee voor studies gericht op zowel primaire muis proximale en distale renale TECs. Naast voordelige reagentia en minimale dierlijke dit protocol voorgeschreven procedures, de geïsoleerde cellen hoge energie serviceniveaus te behouden na isolatie en kunnen sub gekweekte tot vier gangen, zodat voor continue studies. Bovendien, met behulp van een hoge doorvoersnelheid extracellulaire flux analyzer, beoordelen we de mitochondriale ademhaling direct in de geïsoleerde TECs in een 96-wells-plaat waarin we aanbevelingen voor de optimalisatie van de celdichtheid en samengestelde concentratie voorziet. Deze opmerkingen suggereren dat dit protocol kan worden gebruikt voor renale tubulaire ex vivo studies met een consistente, goed gestandaardiseerde productie van renale TECs. Dit protocol wellicht bredere toekomstige toepassingen te bestuderen van mitochondriale dysfunctie renale stoornissen voor drugontdekking of drug karakterisering doeleinden is gekoppeld.
Introduction
Renale tubulaire epitheliale cellen (VEG) functie is sterk geassocieerd met de algehele gezondheidstoestand van de nier. Pathologische signalering in de nieren zorgt ervoor dat de dedifferentiation van TECs, die een belangrijke rol in de nier fibrose en chronische nier ziekte (CKD)1,2 speelt. De nier is een zeer energieke orgel, tweede alleen naar het hart in zuurstofverbruik, voornamelijk door middel van Mitochondriale oxidatieve fosforylatie3. Elektronenmicroscopie studies is gebleken een positieve correlatie van mitochondriale morfologische veranderingen op pathologische gebeurtenissen in de renale tubuli4. Mitochondriale dysfunctie in TECs veroorzaakt renale fibrose via epitheliale aan mesenchymale overgang5 en defecte vetzuur oxidatie6. Fibrose is een progressieve Renale pathologie die in Cementovenstof resulteert. Inzicht in de energetische status van renale TECs is daarom een noodzaak om te ontdekken de pathofysiologie van Cementovenstof.
Er zijn 20 > celtypes in de volwassen nier7. De functie van TECs studeren, is een primaire cultuur van de renale epitheliale cellen nodig als een platform voor moleculaire biologie toepassingen zoals chemische behandelingen en genetische manipulaties. Belangrijk is dat kunnen genetische manipulaties worden gedaan in vivo in muizen via Transgenese of met behulp van AAV gene levering technieken8 zodat de geïsoleerde primaire cellen zou al genetisch worden gemanipuleerd. Het isolement van primaire renale tubulaire cellen uit muizen9,10, ratten11,12,13, hoektanden14, konijnen15,16en mens17 ,18 is gemeld met zuivering stappen voor zuivere proximale tubulaire cellen opleveren. In deze eerder gepubliceerde protocollen die zich op de isolatie van proximale tubulaire cellen richten, werden kleurovergang centrifugeren en sorteren van experimenten uitgevoerd voor zuivering doeleinden19. Terwijl deze protocollen waardevol zijn voor het bestuderen van de proximale tubuli, zijn ze niet voldoende wanneer zowel de distale als de proximale tubuli nodig zijn om te worden bestudeerd. Onze studie over het syndroom van Alport is bijvoorbeeld gebleken dat zowel de distale als de proximale renale tubuli spelen een belangrijke rol in de ziekte progressie20, en daarom beide soorten de renale tubuli in cultuur moeten worden onderzocht. Een recente studie over fluoride renale toxiciteit toonde ook aan dat de pathologische veranderingen in zowel de proximale en distale tubuli21 plaatsvonden. Daarom is dit protocol van de isolatie is ontworpen en geoptimaliseerd voor zowel de distale als de proximale tubulaire cellen van muis nieren met een minimale kostprijs van reagentia en eenvoudige procedures. Anderzijds kunnen onderzoekers nog volgen van het protocol tot stap 3.1 en zuivering stappen9 vanaf dit punt naar voren voor de isolatie van pure proximale tubulaire cellen toevoegen.
De geïsoleerde cellen hoog energetische risiconiveaus en renale epitheliale kenmerken behouden na de subculturen aan 4 passages. Met behulp van een hoge doorvoersnelheid extracellulaire flux analyzer, beoordelen wij de mitochondriale ademhaling direct in de geïsoleerde TECs in een 96-wells-plaat, die tot verdere inzichten in cel dichtheid optimalisatie leidt. Deze opmerkingen suggereren dat dit protocol kan worden toegepast op de renale tubulaire ex vivo studies met een consistente, goed gestandaardiseerde productie van renale TECs. Een extra betekenis van dit protocol is het mogelijk gebruik ervan als een instrument van de hoge doorvoer voor de ex vivo -karakterisering van de mitochondriale Bioenergetica in renale tubulaire cellen proximale en distale. Dus kan het dienen als een platform voor drugontdekking of drug karakterisering doeleinden van renale aandoeningen.
Protocol
Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en het Comité van de gebruik bij de Universiteit van Miami, aan de richtsnoeren van de NIH.
1. plaat Coating en de bereiding van reagentia
- Collageen coating voor te bereiden:
- Voeg 35 l collageen I tot en met 2 mL van een vooraf gefilterde 20 mM azijnzuur-oplossing op een enkele petrischaal van 60mm. Na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, het drogen en worden blootgesteld aan UV.
- Wassen van de coating 3 x met PBS verwijdert alle zure residuen en bewaar het in een 37 ° C CO2-vrije cel cultuur incubator totdat de cellen klaar voor het zaaien zijn. De uiteindelijke concentratie van de collageen-coating is 5 μg/cm2.
- Perfusie buffer bereiden: Meng 300 μL van penicilline-streptomycine (P/S) 30 mL PBS en het mengsel opwarmen in een waterbad 37 ° C totdat het isolement begint.
- Spijsvertering buffer bereiden: Los 3.9 mg van collagenase type 2 in 30 mL PBS, filtreer de oplossing door een filter van de fles-top 0.2-μm en warmen het in een waterbad bij 37 ° C totdat het isolement begint.
- Cel voedingsbodems bereiden:
- Breng de supplementen tot kamertemperatuur. Het supplement (0,05 mL van foetaal kalfsserum, 10 ng/mL van de epidermale groeifactor, 5 μg/mL van insuline, 0.5 μg/mL van epinefrine, 36 ng/mL van hydrocortison, 5 μg/mL transferrine en 4 pg/mL triiodo-L-thyronine) aan de 500 mL van renale zonder filtratie, toevoegen epitheliale cel basale groeimedium 2.
- Opwarmen van de media in een waterbad 37 ° C totdat het klaar is voor gebruik.
- Verbindingen voor te bereiden: bereiden van 50 mM FCCP en 10 mM rotenon, oligomycin van 10 mM, 10 mM, antimycin A, 50 mM L-carnitine en 50 mM etomoxir voorraad oplossingen all-in DMSO, aliquoot hen slaan de verbindingen bij-20 ° C.
- 2.5 mM natrium palmitaat in 220 mL van een 150-mM NaCl-oplossing te bereiden en de oplossing opwarmen in een waterbad 75 ° C tot de palmitaat is volledig opgelost.
- Bovien serumalbumine (BSA) bereiden: bereiden van 0,34 mM vetvrij BSA in 250 mL 150 mM NaCl. Het besturingselement BSA fungeert als een negatieve controle voor de palm-BSA-oplossing die kan worden voorbereid door stap 1.8.
- Conjugaat de palmitaat aan BSA (Palm-BSA):
- Voeg de palmitaat oplossing geleidelijk in de BSA oplossing terwijl het nog heet. Dan, breng de pH op 7.4 en meng ze bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur te voltooien de vervoeging.
- Wanneer de vervoeging is voltooid, een andere 150 mL 150 mM NaCl aan de oplossing toevoegen, meng het goed en opslaan van de aliquots bij-20 ° C. De uiteindelijke oplossing bevat 1 mM natrium palmitaat en 0,17 mM BSA en zal worden gebruikt als een vetzuur substraat voor cellen in een vetzuur gebaseerde extracellulaire flux assay.
- Bereiden van extracellulaire flux assay basale media:
- 1 zak van DMEM poeder en 20 mL 200 mM L-glutamine (4 mM definitieve) toevoegen aan 1 L voor gesteriliseerde met autoclaaf dH2O en meng ze zachtjes.
- Op de dag van de Bioenergetica experiment, toevoegen 100 µM natrium pyruvaat tot de bereid basale media voor latere preparaten van extracellulaire flux assay media in een glucose- of vetzuur - gebaseerde ademhaling bepaling moeten worden gebruikt.
- Glucose-gebaseerde media voor te bereiden:
- Voor het meten van cellulaire ademhaling capaciteit via glycolyse, 17,5 mM glucose poeder, 100 µM controle BSA (zoals beschreven in stap 1.7) en 20 µM etomoxir (voor de remming van de oxidatie van de vetzuren) toevoegen aan de basale media hierboven beschreven in stap 1.9.
- Opwarmen van de media bij 37 ° C, breng de pH op 7.4 en bewaar deze in het waterbad 37 ° C, totdat het wordt gebruikt in een test van extracellulaire flux.
- Bereiden vetzuur gebaseerde media:
- Voor het meten van cellulaire ademhaling capaciteit door oxidatie van vetzuren, voeg 10 mM 2D-glucose poeder (glucose analoge voor de remming van de glycolyse), 100 µM Palm-BSA (zoals beschreven in stap 1.8) en 100 µM L-carnitine aan de basale media hierboven beschreven in stap 1.9.
- Opwarmen van de media bij 37 ° C en breng de pH op 7.4 in het waterbad 37 ° C houden totdat het wordt gebruikt in de extracellulaire flux assay.
2. perfusie, de spijsvertering en de nieren oogsten van muizen
- Anesthetize van de muis met een stroom van Isofluraan en repareren in een liggende positie. Zorg ervoor dat de isolatie wordt alleen gestart nadat het dier haar restarmen reflexen verliest en de verdoving diepte wordt gecontroleerd door snuifje evaluaties atraumatische pincet gebruiken vóór en tijdens de procedure22.
- Verwijderen van bont, met behulp van een ontharende room, uit de borst van de muis naar de buikstreek, gedesinfecteerd met jodium, en veeg het residu van jodium.
- Maken van een sneetje in de borst, de huid om te openen de hele buikstreek knippen en bloot van het hart en de nieren.
- Instellen van een perfusie pomp op 32 mL/min en verwijder alle bubbels in de slang voordat de perfusie.
- Invoegen van een 27-G naald in het linkerventrikel via het hart apex zodra de buffer volloopt met het hart, en steken de juiste atrium om een afrit te maken zodat de perfusie buffer als de hart-pompen circuleert en uiteindelijk wordt verwijderd uit de juiste atrium afslag.
- Na de perfusie, het toerental van de pomp naar schakelen dan 30 mL/min voor de spijsvertering
- Na 20 mL van de spijsvertering is de buffer geperfundeerd via de apex, Verwijder beide nieren voor de tubulaire cel isolatie.
3. de weefsels verwerking en primaire tubulaire cellen isolatie
- Verwijder de renale capsules en de medulla, beide nieren in kleine stukjes gehakt, en broeden ze in 10 mL voor een buffer van de spijsvertering in een oven van 37 ° C met zachte rotatie voor 5 min.
- Verwijder onverteerd nier weefsels door de buffer door een 70-μm-filter. Voeg 10 mL van voedingsbodems om te stoppen met de spijsvertering.
- Centrifugeer het verzamelen van tubulaire cellen, de gefilterde celsuspensie bij 50 x g gedurende 5 min voor het verzamelen van de eerste pellet. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en voeg 5 mL van voedingsbodems, centrifuge het bij 50 x g gedurende 5 min om alle tubulaire cellen worden verzameld in de tweede pellet.
Het centrifugeren is met een lagere snelheid om voornamelijk pellet zware tubuli. Later, nadat de cellen van de isolatie herstellen, de buisvormige reincultuur gecentrifugeerd met een hogere snelheid tijdens de subculturen. - Resuspendeer de pellet van de eerste 20 ml van cultuurmedia en Centrifugeer het bij 50 x g gedurende 5 min voor het verzamelen van de derde pellet.
- Resuspendeer de tweede en derde pellets in 1 mL voedingsbodems. Mix 10 µL van de celsuspensie met 10 µL van Trypan blauw, laad het mengsel in zaal A van een tellen dia en record de levensvatbaarheid van de cellen van de automatische cell counter (Zie Tabel van materialen).
- Zaad tot 107 cellen (een heterogene populatie) op een enkele schotel van 60 mm vooraf bedekt met collageen en laat de tubulaire cellen koppelen overnachting.
4. primaire tubulaire cellen subcultuur en karakterisering
- Op dag 1 na het isolement, verzamelen van cultuurmedia en Centrifugeer het bij 50 x g gedurende 5 minuten aan een zwevende tubuli pellet. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 4 mL verse cultuurmedia en plaat het terug naar de dezelfde cultuur schotel.
- Op dag 4 na het isolement, verwijderen van de oude cultuur-media en nieuwe media toevoegen.
- Loskoppelen op dag 7 na de isolatie, de cellen door hen incuberen bij 37 ° C in 2 mL zuiver 0,25% trypsine-EDTA voor 5 min. Voeg 3 mL voedingsbodems zet de reactie stop te verzamelen van de cellen door centrifugeren bij 250 x g gedurende 5 min.
- Sub cultuur en karakteriseren van de cellen van P0 naar P1, bedekt zaad 5.000 cellen per putje op een 24-well bord met collageen ik zoals hierboven beschreven.
- 24 h na stap 4.4, bevestigen de cellen bij P1 met 4% PFA voor 10 min, permeabilize hen met 0,2% Triton X-100 gedurende 3 minuten, en hen te blokkeren met 10% ezel serum (DS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Vul, tot 1:100 in 10% DS, elk van de volgende eiwitten: de proximale buisvormige markeringen angiotensinogen (AGT) en aquaporin-1 (AQP1); de distale buisvormige markering E-cadherine; de mesangial marker CD90/Thy1; en de macrofaag markeringen EGF-achtige module-bevattende mucin-achtige hormoon-receptor-zoals 1 (F4/80) en cluster van differentiatie 68 (CD68) en incubeer hen met cellen 's nachts bij 4 ° C.
- De volgende dag, detecteren elke kleuring met behulp van 1:200 anti-konijn, anti-muis of anti-Rat fluorescerende secundaire antilichamen voor 45 min. Neem beelden onder confocale microscopie te bevestigen de expressie van de markers, zoals weergegeven in figuur 2A.
- Op dag 3 na de subcultuur van P1, loskoppelen de cellen voor een subcultuur en karakterisering op P2 door een kleuring van de markers van het tubulaire, mesangial en macrofaag beschreven in stap 4.5. Het imago van de kleuring onder confocale microscopie te bevestigen de expressie van de markers, zoals weergegeven in figuur 2A.
- Op dag 3 na de subcultuur van P2, loskoppelen de cellen voor een subcultuur en karakterisering in P3 door een kleuring van de markers van het tubulaire, mesangial en macrofaag beschreven in stap 4.5. Het imago van de kleuring onder confocale microscopie te bevestigen de expressie van de markers, zoals weergegeven in figuur 2A.
- Bereiden de weefsel kleuring:
- Bevroren wild-type en Col4a3- / - nier-dia's gedurende 1 uur bij kamertemperatuur drogen en corrigeren met 4% PFA voor 10 min. Permeabilize hen met 0,2% Triton X-100 voor 10 min en blokkeren ze met 10% ezel serum (DS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Toevoegen van antilichamen tegen de proteïnen van de marker beschreven in stap 4.5 op 1:200 en hen bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
- De volgende dag, detecteren elke kleuring met 1:200 anti-konijn, anti-muis of anti-Rat fluorescerende secundaire antilichamen voor 45 min. Neem beelden onder een confocal microscoop te bevestigen de expressie van de markers, zoals in figuren 2B en 2 C.
5. de mitochondriën Bioenergetica Assay
- Zaad P1 tubulaire cellen op 20.000, 30.000 en 40.000 cellen per putje in 100 μl van voedingsbodems op een 96-Wells-microplate bedekt vooraf met 5 μg/cm2 collageen ik eergisteren de extracellulaire flux testen.
- Voor de hydratatie van de sensor-patroon, heffen de sensor cartridge en vul elk goed van de plaat met 200 μl van een kalibratie-oplossing. Zorgvuldig laden de cartridge terug naar het onderdompelen van de sensoren in de kalibratie-oplossing. Plaats de cartridge in een oven van de 37 ° C zonder CO2 voor ten minste 7 h voorafgaand aan gebruik.
Voor de beste resultaten, wordt overnachting cartridge hydratatie aanbevolen. - De stoffen voor te bereiden: bereiden van 8 µM oligomycin 9 µM FCCP en 20 µM rotenon/antimycin A mengsel in zowel glucose (beschreven in stap 1.10) en vetzuren (beschreven in stap 1.11) extracellulaire flux assay media.
- Wijzigen van de media: de cel voedingsbodems gecombineerd, 175 µL van glucose of vetzuur assay media toe te voegen (afhankelijk van de verbinding die is gewerkt, zie stap 5.3), en hen Incubeer gedurende 1 uur in een 37 ° C CO2-gratis incubator.
- Laden van de poorten van de cartridge met 25 µL van de volgende stoffen: 8 μM oligomycin voor poort A om een eindconcentratie van 1 µM (Opmerking: zoals elk goed 175 µL van media bevatten zal, de compound krijgt verdunde 8 x), 9 μM FCCP in haven B om een eindconcentratie van 1 µM (Opmerking: zoals elk goed bevatten zal 175 µL van media plus 25 µL van de oplossing van poort A geïnjecteerd, de compound krijgt verwaterde 9 x), en 20 µM rotenon/antimycin A in haven C om een eindconcentratie van 2 µM voor elke samengestelde (Opmerking : zoals elk goed bevatten zal 175 µL van media plus 50 µL van de oplossing die geïnjecteerd uit havens A en B, de compound krijgt verwaterde 10 x).
- Voeg water toe aan alle putjes in de haven D en alle andere poorten van de achtergrond putten (geen cellen). Incubeer de cartridge in een 37 ° C CO2-gratis incubator voor 10 min.
- Zet de extracellulaire flux analyzer en de controller.
- Open de Analyzer Software en ingang van het volgende protocol:
- Kies standaard Assay. Druk op Assay Wizard. Met behulp van het tabblad verbindingen , wijs de samengestelde lay-out en gebruik van het tabblad groepen en Labels op het label van de experimentele groepen. Vergeet niet om de lege putten (zonder cellen) toewijzen als achtergrond.
- Stel onder het tabblad Protocol het volgende mix en maatregel cycli met gebruik van de beschikbare opdrachten, zoals aangegeven in tabel 1: kalibreren, mix voor 2 min, wachten op 2 min, en maatregel gedurende 3 minuten (Herhaal deze cyclus 2-3 x); injecteren van poort A, mix voor 2 min, wachten op 2 min, maatregel gedurende 3 minuten (Herhaal deze cyclus 2-3 x); injecteren van poort B, meng gedurende 2 min, wachten op 2 min, maatregel gedurende 3 minuten (Herhaal deze cyclus 2-3 x); injecteren van poort C, meng gedurende 2min, wachten op 2 min, maatregel gedurende 3 minuten (2-3 x herhalen deze cyclus). Druk op einde Wizard. Het is ook mogelijk om op te slaan van de huidige sjabloon voor toekomstig gebruik.
- Druk op Start om te beginnen de kalibratie. De analyzer vervolgens automatisch werpt de plaat houder en vraagt om de cartridge plaat moet worden ingevoegd.
- Wanneer de kalibratie stap is gedaan (meestal in 20-25 min), drukt u op de opdracht prompt de cartridge plaat aan de plaat van de cel wijzigen en blijven de run.
- Wanneer de run is voltooid, overdracht van de gegevens en verwijder de 96-wells-plaat. Voeg Hoechst (1:1, 000) toe aan elk van de assay putten en broeden ze gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Normaliseren de OCR-gegevens aan cellen door een meting van de fluorescentie van de Hoechst lezen op een excitatie 355-nm en een uitstoot van 460 nm.
Representative Results
Nier perfusie en spijsvertering opbrengst zeer levensvatbare buisvormige epitheliale cellen:
Muis renale tubulaire epitheliale cellen werden geïsoleerd na de stappen in de secties 1-3 van het protocol zoals hierboven beschreven.
Na de spijsvertering, waren een heterogene populatie van nier cellen, onvolledig verteerd tubuli en ander weefsel puin die kleiner is dan 70 µm vergulde op de cultuur schotel op isolatie dag. Verandert van dag 0 dag 1 na het isolement meestal zullen naar verwachting worden gezien alleen in de bijlage van de cel in plaats van in de celgroei. Kijkend naar de drijvende heterogene populatie, waren slechts een paar tubulaire cellen verbonden op dag 1 (figuur 1A). Een nieuwe collectie van de cellen op dag 1 een centrifugeren en een opnieuw plating geholpen te verwijderen van lichte puin en regelen de kleine zaadvormende stukken voor de tubulaire cel release. Van dag 1 tot dag 3, werden veranderingen verwacht, niet alleen bij een betere hechting van de cel, maar ook in een opmerkelijk verbeterde cel groei die werd waargenomen met een verdrievoudiging celdichtheid in vergelijking met dag 1 (figuur 1A). In de eerste groeifase, de cellen gevormd van verschillende kolonies en rond de kolonies bevolkt. Vanaf dit punt naar voren, de geïsoleerde cellen werden volledig hersteld en een gezonde proliferatie weergegeven. Dag 5 waren de cellen op een 80-90% confluentie in een petrischaal 60 mm met sommige ruimten tussen cel naar cel en kolonie tot kolonie (figuur 1A).
Subcultuur en karakterisering van de geïsoleerde tubulaire cellen:
De geïsoleerde renale tubulaire epitheliale cellen werden sub gekweekt voor een karakterisering na de stappen die worden beschreven in sectie 4 van het protocol dat is hierboven beschreven.
Vanaf dag 5, de cellen volledig hersteld van de isolatie en begon krachtig te vermenigvuldigen. Een week na de isolatie, groeide de cellen uit tot confluentie in een petrischaal 60 mm. Na 1 week in een cultuur bij passage 0 waren de cellen klaar om te worden sub gekweekt tot passage 1 en vervolgens voor 2 meer passages. Vergelijkbare groeipatronen werden waargenomen in de passage 1 en passage 2. Het duurt meestal minder dan een week voor cellen bij passage 1 en 2 te groeien naar confluentie voor verdere subculturen (figuur 1B). De continue cultuur van confluente cellen van passage 0 passage 2 toonde een uitgebreide koepel vorming23,24 (figuur 1B), wat suggereert dat de geïsoleerde cellen een gezonde behouden status waar ze soortgelijke vloeistoffen uitgescheiden een in vivo status. Dit veroorzaakt de enkelgelaagde van de cellen te heffen uit de plaat, maar blijf verbonden via strakke kruispunten.
Het karakteriseren van de cellen in de cultuur, we uitgevoerd immunefluorescentie vlekken in de gekweekte cellen van passage 1 doorgang 4, alsook in een cel lijn-menselijke proximale renale epitheliale HK-2 cellen. Proximale buisvormige markeringen, aquaporin-1 (AQP1)25 en angiotensinogen (AGT)9, de distale buisvormige marker E-cadherine25, de epitheliale marker glad spierweefsel actine (SMA)26,27,28, macrophage markeringen F4/8029 en CD6830, en de mesangial marker thymocyte differentiatie antigeen 1 (Thy1/CD90)9 werden gebruikt voor de karakterisering studies. Beide proximale buisvormige eiwitten AQP1 en AGT werden consequent sterk uitgedrukt in de geïsoleerde tubulaire cellen van passage 1 tot passage 4 zo goed als in de positieve controle HK-2 proximale epitheliale cellen (figuur 2A). De distale buisvormige eiwitten E-cadherine kwam tot uitdrukking in de geïsoleerde tubulaire cellen doorgang 4 en werd ook waargenomen in de HK-2 cellen (figuur 2A). SMA was overvloedig uitgedrukt in de geïsoleerde tubulaire cellen en in de HK-2 cellen, consistent met de gepubliceerde rapporten26,27. Aan de andere kant, de mesangial proteïne Thy1 en macrofaag proteïne F4/80 afwezig waren in zowel de geïsoleerde tubulaire cellen en de HK-2 cellen (figuur 2A). CD68 toonde een minimale expressie in de HK-2 cellen en in de geïsoleerde tubulaire cellen bij passage 1 en passage 2, en vervolgens de expressie werd niet aantoonbaar van passage 3 doorgang 4 (figuur 2A). De resultaten suggereren dat de cellen geïsoleerd volgens dit protocol een mix van proximale en distale tubulaire cellen zijn. Als u wilt vergelijken met de uitingen van deze markering eiwitten in vivo, we uitgevoerd kleuring in bevroren nier weefsels. Buisvormige markers, met inbegrip van AQP1, AGT, en E-cadherine en mesangial eiwit Thy1 bleken sterk uitgedrukt in nieren geoogst van een wild-type gezonde muis (figuur 2B). Lage uitingen van F4/80 en CD68 werden waargenomen in wild-type nieren maar uitgebreid uitgedrukt in nieren geoogst van een Col4a3- / - muis die ontwikkeld nierfalen met een macrofaag infiltratie20,31 ( Figuur 2C).
Mitochondriale Bioenergetica Assay op geïsoleerde primaire tubulaire cellen:
De mitochondriale ademhaling assay stappen worden beschreven in sectie 5 van het protocol zoals hierboven beschreven.
De mitochondriale ademhaling van geïsoleerde primaire tubulaire cellen wordt gemeten door een extracellulaire flux-analyse van het zuurstof verbruik tempo (OCR) verschillende plating dichtheden. Om Titreer de dichtheid van de beplating, 20.000, 30.000 en 40.000 primaire TECs per putje werden zaadjes op een 96-Wells XF96 microplate eergisteren (ongeveer 20 h vóór) de extracellulaire flux assay (figuur 3A). Na de analyse van de extracellulaire flux, de OCR-metingen werden vervolgens genormaliseerd naar de graven van de cel door een kwantificering van Hoechst kleuring. De TECs op 20.000 plating, 30.000 en 40.000 cellen per putje resulteerde in een gemiddelde basale OCR van 25, 45 of 50 pmol/min, respectievelijk (figuur 3A). Bovendien bleek de microscopische beelden van de vergulde cellen dat 40.000 cellen per putje het gehele oppervlak van de onderzijde van de microplate putten beter dan de andere plating dichtheden (figuur 3B bedekt). Hoewel de maximale OCR niet met behulp van 40.000 cellen ten opzichte van de dichtheid van 30.000 cellen verhogen, wordt aangeraden een celdichtheid van ongeveer 40.000 cellen per putje voor optimale interacties tussen cellen en stoffen.
Bovendien, in onze experimenten, de optimale concentratie van de stoffen van remmende/uncoupler bleek te worden 1 µM oligomycin, 1 µM FCCP en 2 µM rotenon/antimycin-A (de protocollen van de extracellulaire flux-test en de poort injecties staan in tabel 1 ; de optimalisatie experimenten worden niet weergegeven). Echter, het is aanbevolen voor alle gebruikers een oriënterende proef uitgevoerd met verschillende concentraties van deze stoffen, idealiter lagere en hogere dan de gepubliceerde waarden, te rechtvaardigen van de beste resultaten.
Een bepaling van de extracellulaire flux levert een aantal belangrijke parameters voor de beoordeling van de Bioenergetica van renale TECs. Bijvoorbeeld, zoals oxidatie van vetzuren is specifiek defect in TECs, kan het gebruik van media met vetzuur substraat (palmitaat) samen met de Inhibitor van de omwenteling van de glycolyse (2 DG) dienen als een nuttig instrument om oxidatie van de vetzuren in TECs rechtstreeks bij passages 1 en 2 (Figuur 3 c). In het geval van renale fibrose, wordt de totale capaciteit van de ademhaling van de cellen verwacht zijn lager dan die van een gezonde nier, alhoewel de glucose gebaseerde media niet verschillen onthullen kan.
Samen genomen, de extracellulaire flux assay, vooral voor het beoordelen van de capaciteit van de oxidatie vetzuren, kan worden gebruikt als een informatieve maatregel te evalueren van de energetische status van renale TECs in welke pathologische veranderingen op het gebied van de Bioenergetica profiel spelen een belangrijke rol bij de renale fibrose en de progressie naar nierfalen.
| Stappen | Tijd (min) |
| Kalibreren | |
| Equilibreer: | 00:12:00 |
| Meting 1 | 3 lussen |
| Mix | 00:02:00 |
| Wachten | 00:02:00 |
| Maatregel | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Wachten | 00:02:00 |
| Maatregel | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Wachten | 00:02:00 |
| Maatregel | 00:03:00 |
| Injecteren poort een (Oligomycin 1 μM) | 2 lussen |
| Mix | 00:02:00 |
| Wachten | 00:02:00 |
| Maatregel | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Wachten | 00:02:00 |
| Maatregel | 00:03:00 |
| Injecteren van poort B (1 μM FCCP) | 2 lussen |
| Mix | 00:02:00 |
| Wachten | 00:02:00 |
| Maatregel | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Wachten | 00:02:00 |
| Maatregel | 00:03:00 |
| Injecteren van poort C (2 μM Rotenon/Antimycin) | 2 lussen |
| Mix | 00:02:00 |
| Wachten | 00:02:00 |
| Maatregel | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Wachten | 00:02:00 |
| Maatregel | 00:03:00 |
Tabel 1. Gestandaardiseerd extracellulaire flux-analyse uitgevoerd van protocol voor optimale OCR-metingen in de primaire tubulaire cellen.
Figuur 1. Cel cultuur van geïsoleerde primaire tubulaire cellen. (A) de geïsoleerde primaire tubulaire cellen koppelen vroeg op dag 1 en krachtig groeien vanaf dag 3 tot dag 5. De beelden zijn genomen onder 10 X en 20 X doelstellingen. (B) dit paneel toont een subcultuur van geïsoleerde primaire tubulaire cellen van passage 0 tot passage 3. De beelden zijn genomen onder 10 X en 20 X doelstellingen voor visioenen van de cel koepels en onder een 40 X doelstelling voor een visie op de morfologische veranderingen door de passages. De scalebar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Karakterisering van geïsoleerde primaire tubulaire cellen. (A) immunokleuring met antilichamen tegen proximale buisvormige eiwitten (AQP1, AGT), een distale buisvormige eiwit (E-cadherine), een epitheliale eiwit (SMA), een mesangial eiwit (Thy1) en macrofaag eiwitten (F4/80, CD68) tonen aan dat de geïsoleerde primaire tubulaire cellen en latere subculturen zijn pure proximale en distale tubulaire cellen. (B) dit paneel toont een kleuring van de zaadvormende proximale, distale zaadvormende en mesangial eiwitten in nieren weefsels van een gezond wild-type muis als een positieve controle en een niet-primaire negatieve controle. (C) dit paneel toont een kleuring van de macrofaag eiwitten F4/80 en CD68 in nierweefsel verzameld van een Col4a3- / - muis als positieve controle. Scalebar = 20 µm. De DAPI wordt in blauw weergegeven. De marker eiwitten zijn getoond in groen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Extracellulaire flux assay in geïsoleerde primaire tubulaire cellen op verschillende plating dichtheden. (A) vergroting cellulaire plating dichtheid verbetert de basale ademhaling niveaus in primaire tubulaire cellen, getest bij passage 3. (B) dit paneel toont microscopische beelden van primaire tubulaire cellen gekweekt op een XF96-microplate ontpit op 20.000, 30.000 en 40.000 cellen per putje dichtheden. Scalebar = 100 µm. (C) dit paneel toont een extracellulaire flux vetzuren of glucose-gebaseerde bepaling in primaire tubulaire cellen op passages 2 en 1. De gegevens zijn gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
We een protocol waarmee voor de efficiënte isolatie van muis renale tubulaire epitheliale cellen (TECs) geoptimaliseerd en bleek dat de cellen een extracellulaire flux-analyse te evalueren van de mitochondriale ademhaling in aanwezigheid van vetzuur - sub gekweekt kunnen worden en/of glucose gebaseerde substraten. Dit protocol is ontworpen voor studies gericht op zowel de distale als de proximale tubulaire cellen en fungeert als een kader om te bouwen van complexere experimenten opstelt voor het begrijpen van TEC pathologie-geassocieerde nierziekten. Vergeleken met eerder gepubliceerde protocollen9,10,19, deze methode vereist geen kleurovergang scheidingen met lange centrifugeren maal of een ruime antilichaam-gebruik voor het sorteren en daarom biedt een meer efficiënte en geoptimaliseerde gids voor onderzoekers die werken op het renale tubulaire metabole gebied. Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol, met inbegrip van de spijsvertering, de re-collectie, en de beplating dichtheid en de samengestelde optimalisatie voor de extracellulaire flux assay.
Het kiezen van het juiste type van collagenase en optimale concentratie is de sleutel tot een succesvolle spijsvertering en dissociatie van de tubulaire cellen van renale weefsels. Vergeleken met andere soorten collagenases, bevat type 2 collagenase relatief hogere niveaus van protease-activiteit, staat distantiëren van compacte renale structuren. Om de kans op besmetting als gevolg van een langdurige perfusie en spijsvertering tijd minimaliseren, was 0,013% type 2 collagenase geperfundeerd op 30 mL/min. De renale capsule is alleen verwijderd nadat beide nieren waren van het dier geoogst en in een gesteriliseerde cel cultuur kap overgebracht. De nieren waren gehakt in kleine stukjes en bleef hun incubatie met 10 mL van een spijsvertering buffer voor een andere 5 min. voor een volledige spijsvertering en de maximale vrijlating van de tubulaire cellen.
Hoewel, na de spijsvertering, de schorsing van het weefsel wordt doorgegeven via een 70-µm filter verwijderen van zeer grote weefsel stukken, zal er wel onverteerd tubuli die het filter passeren en blijven binnen de celsuspensie en vergulde krijgen op de cultuur schotel. Het duurt het langer dan normaal voor deze tubuli vrij te geven van de tubulaire cellen en stevig aan de cultuur-schotel. Het is daarom nogal belangrijk te verzamelen van de celsuspensie samen en centrifugeer om pellet de niet-vastgemaakte buisjes en cellen op de tweede dag na de cel beplating. Deze lage snelheid centrifugeren stap verder verwijdert van andere celtypes die lichter dan de tubulaire cellen zijn en zorgt voor een niet-vastgemaakte buisjes en tubulaire cellen te regelen.
De identificatie van goede celdichtheid is de eerste en belangrijkste stap voor een succesvolle extracellulaire flux assay. De resultaten toonden aan dat 40.000 cellen per putje op een XF96-microplate is ideaal voor primaire tubulaire cellen in zowel een vetzuur en een glucose gebaseerde ademhaling assay (Figuur 3 c). In dit protocol, werden geïsoleerde tubulaire cellen gebruikt voor de bepaling van de extracellulaire flux op passages 1 en 2. De cellen sub gekweekt om de passage van 3, hoewel ze een uitdrukking van de tubulaire markers (Figuur 2) en een nette prestatie in de Bioenergetica assays (figuur 3A onderhouden), en verminderde basale ademhaling niveaus ten opzichte van passage 2 toonde (zie afbeelding door het vergelijken van OCR in de meest rechtse panelen van figuur 3A van Figuur 3 c). Deze daling kan niet van invloed op de aanzienlijk gezonde tubulaire cellen (bijvoorbeeld degenen geïsoleerd van jonge wild-type muizen). Echter voor studies over cellen geïsoleerd van Cementovenstof Muismodellen die al een verminderde mitochondriale ademhaling, kan hogere passages van de cellen een verdere daling van de basale ademhaling waardoor de resultaten van de bepaling van de extracellulaire flux. In de studies hier gevoerd, de cellen van zowel passage 1 en passage 2 toonde hoge basale ademhaling niveaus. Daarom, naar aanleiding van dit protocol raden we deze twee vroege passages voor mitochondriale ademhaling studies met cellen van zowel de gezonde als de zieke dieren geïsoleerd. Cellen van passage 2 moeten nog steeds in aanmerking worden genomen indien de subcultuur van passage 1 geen voldoende cellen voor de flux assay oplevert. Naast Bioenergetica studies toont onze vorige onderzoek aan dat primaire TECs bij passage 3 zeer nuttig zijn voor behandelingen, met verbindingen gevolgd door eiwitten en RNA studies (gegevens niet worden weergegeven kunnen). Dat gezegd zijnde, stellen we voor dat onderzoekers met behulp van dit protocol te isoleren van de tubulaire cellen zorgvuldig de optimale doorgang voor diverse toepassingen kiest.
Het werkingsprincipe van de extracellulaire flux-analyse is gebaseerd op de interacties tussen de ingespoten verbindingen en de ademhaling ketencomplexen en het effect van de uncoupler. Oligomycin is een inhibitor van de omwenteling van complexe V (ATP-synthase) en wordt gebruikt om ATP-linked zuurstofverbruik en het zuurstofverbruik die vereist is voor het overwinnen van het reguliere proton-lek in een mitochondriale binnenste membraan32te onderscheiden. FCCP reddingsprocedure zuurstofverbruik van de ATP productie door het verstoren van de Mitochondriale membraanpotentiaal. Het biedt dus een meting van de maximale ademhaling capaciteit zoals het omzeilt de beperkte capaciteit van een proton ion efflux van ATP-synthase doordat een proton transport via het membraan. Antimycin-A, een complexe III-inhibitor, en rotenon, een complex ik blocker, af de gehele mitochondriale ademhaling waardoor een differentiatie tussen de mitochondriale vs. de niet-mitochondriale zuurstofverbruik in te sluiten in combinatie worden gebruikt de cellen. Deze verbindingen moeten altijd voor een bepaalde celtype voordat de extracellulaire flux-test om te bepalen van de optimale concentraties dat de opbrengst van de optimale OCR-curven worden getitreerd. Hier, raden we 1 µM van oligomycin, 1 µM van FCCP en 2 µM van rotenon/antimycin A voor de extracellulaire flux assay op primaire TECs.
Ter afronding: dit protocol voorziet een eenvoudige en kosteneffectieve manier te isoleren van de renale primaire proximale en distale buisvormige epitheliale cellen die kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van mitochondriale Bioenergetica ex vivo. Terwijl dit protocol kan bruikbaar zijn in een breed scala van studies van de moleculaire biologie het verkennen van de biologische functie van renale tubulaire epitheliale cellen, erkennen wij zijn beperkingen wanneer u het toepast op studies nodig puur proximaal of DISTAAL tubuli. Bijvoorbeeld, studies over de Lowe syndroom, een selectieve proximale buisvormige dysfunctie33of studies over distale renale tubulaire acidose, een distale buisvormige dysfunctie34, zou vereisen een meer verfijnde protocol voor cel isolatie en zuivering. Echter biedt voor de meerderheid van de studies die vergelijk tubuli vs. de glomeruli, en voor studies op het scherm van potentiële mitochondriale ademhaling regelgevers in de tubulaire cellen in het algemeen, het protocol een haalbaar hoge doorvoer-aanpak. Daarom kan dit protocol hebben brede toepassingen te bestuderen van mitochondriale dysfunctie renale stoornissen voor drug discovery of doel validatie doeleinden is gekoppeld.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies voor Lina A. Shehadeh: het National Institute of Health (R56HL132209 en 1R01HL140468) en het onderzoeksinstituut voor hart van Miami.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
| Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
| 2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
| Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
| DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
| Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
| TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
| MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
| Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |
References
- Bielesz, B., et al. Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 4040-4054 (2010).
- Fabian, S. L., et al. Hedgehog-Gli pathway activation during kidney fibrosis. American Journal of Pathology. 180 (4), 1441-1453 (2012).
- Forbes, J. M. Mitochondria-power players in kidney function. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (7), 441-442 (2016).
- Suzuki, T., Furusato, M., Takasaki, S., Ishikawa, E. Giant mitochondria in the epithelial cells of the proximal convoluted tubules of diseased human kidneys. Laboratory Investigation. 33 (6), 578-590 (1975).
- Yuan, Y., et al. Mitochondrial dysfunction accounts for aldosterone-induced epithelial-to-mesenchymal transition of renal proximal tubular epithelial cells. Free Radical Biology & Medicine. 53 (1), 30-43 (2012).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nature Medicine. 21 (1), 37-46 (2015).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney International. 61 (2), 387-395 (2002).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Kamiyama, M., Garner, M. K., Farragut, K. M., Kobori, H. The establishment of a primary culture system of proximal tubule segments using specific markers from normal mouse kidneys. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 5098-5111 (2012).
- Terryn, S., et al. A primary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), F476-F485 (2007).
- Tang, M. J., Suresh, K. R., Tannen, R. L. Carbohydrate metabolism by primary cultures of rabbit proximal tubules. American Journal of Physiology. 256, C532-C539 (1989).
- Gesek, F. A., Wolff, D. W., Strandhoy, J. W. Improved separation method for rat proximal and distal renal tubules. American Journal of Physiology. 253, F358-F365 (1987).
- Vinay, P., Gougoux, A., Lemieux, G. Isolation of a pure suspension of rat proximal tubules. American Journal of Physiology. 241 (4), F403-F411 (1981).
- Taub, M., Chuman, L., Saier, M. H., Sato, G. Growth of Madin-Darby canine kidney epithelial cell (MDCK) line in hormone-supplemented, serum-free medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3338-3342 (1979).
- Chung, S. D., Alavi, N., Livingston, D., Hiller, S., Taub, M. Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium. Journal of Cell Biology. 95 (1), 118-126 (1982).
- Rubera, I., et al. Chloride currents in primary cultures of rabbit proximal and distal convoluted tubules. American Journal of Physiology. 275, F651-F663 (1998).
- Inoue, C. N., et al. Use of cultured tubular cells isolated from human urine for investigation of renal transporter. Clinical Nephrology. 53 (2), 90-98 (2000).
- Van der Hauwaert, C., et al. Isolation and characterization of a primary proximal tubular epithelial cell model from human kidney by CD10/CD13 double labeling. PLoS One. 8 (6), e66750 (2013).
- Helbert, M. J., Dauwe, S. E., Van der Biest, I., Nouwen, E. J., De Broe, M. E. Immunodissection of the human proximal nephron: flow sorting of S1S2S3, S1S2 and S3 proximal tubular cells. Kidney International. 52 (2), 414-428 (1997).
- Wen Ding, K. Y., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Quadri, J. A., et al. Fluoride-associated ultrastructural changes and apoptosis in human renal tubule: a pilot study. Human & Experimental Toxicology. , (2018).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Condorelli, L., et al. Effect of fluid shear stress on tubular kidney epithelial cell structure. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. 25 (10), 50-52 (2009).
- Aschauer, L., et al. Delineation of the key aspects in the regulation of epithelial monolayer formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (13), 2535-2550 (2013).
- George, S. K., et al. Potential use of autologous renal cells from diseased kidneys for the treatment of renal failure. PLoS One. 11 (10), e0164997 (2016).
- Elberg, G., et al. MKL1 mediates TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression in human renal epithelial cells. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 294 (5), F1116-F1128 (2008).
- Elberg, G., Guruswamy, S., Logan, C. J., Chen, L., Turman, M. A. Plasticity of epithelial cells derived from human normal and ADPKD kidneys in primary cultures. Cell and Tissue Research. 331 (2), 495-508 (2008).
- Cai, Q., et al. Toxicity of acetaminophen, salicylic acid, and caffeine for first-passage rat renal inner medullary collecting duct cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 306 (1), 35-42 (2003).
- Zhao, Y., et al. Isolation and epithelial co-culture of mouse renal peritubular endothelial cells. BMC Cell Biology. 15, 40 (2014).
- Barros, M. H., Hauck, F., Dreyer, J. H., Kempkes, B., Niedobitek, G. Macrophage polarisation: An immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages. PLoS One. 8 (11), e80908 (2013).
- Kim, M., et al. Progression of Alport kidney disease in Col4a3 knock out mice is independent of sex or macrophage depletion by clodronate treatment. PLoS One. 10 (11), e0141231 (2015).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthethase system. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Bockenhauer, D., et al. Renal phenotype in Lowe Syndrome: a selective proximal tubular dysfunction. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 3 (5), 1430-1436 (2008).
- Ranawaka, R., Dayasiri, K., Gamage, M. A child with distal (type 1) renal tubular acidosis presenting with progressive gross motor developmental regression and acute paralysis. BMC Research Notes. 10 (1), 618 (2017).
