Summary
Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.
Abstract
Zelluläre Prozesse werden durch Wechselwirkungen zwischen biologischen Molekülen wie Proteinen, Metaboliten und Nukleinsäuren geregelt. Während die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) keine Neuheit ist, bilden experimentelle Ansätze mit dem Ziel, endogene Protein-Metabolit Interaktionen (PMI) charakterisieren eine relativ neue Entwicklung. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das gleichzeitige Charakterisierung der PPI und PMI eines Proteins Wahl, bezeichnet als Köder erlaubt. Unser Protokoll wurde optimiert für Arabidopsis Zelle Kulturen und Affinitätsreinigung (AP) kombiniert mit der Massenspektrometrie (MS)-basierte Erkennung von Protein und Metaboliten. Kurz gesagt, sind transgene Arabidopsis-Linien, mit dem Ausdruck Köder Protein verschmolzen zu einem Affinität-Tag zunächst lysiert, um eine native zellulären Extrakt zu erhalten. Anti-Tag Antikörper werden verwendet, um die pull-down-Protein und Metabolit Partner des Proteins Köder. Die Affinität gereinigt-komplexe werden extrahiert, mit einer One-Step-Methyl- Tert-Butyl-Äther (MTBE) / Methanol/Wasser-Methode. Während Metaboliten in der polaren oder hydrophoben Phase zu trennen, können Proteine in das Pellet enthalten. Metaboliten und Proteine werden dann von Ultra-Performance liquid Chromatography-Massenspektrometrie (UPLC-MS oder UPLC-MS/MS) analysiert. Leer-Vektor (EV) Steuerleitungen werden verwendet, um Fehlalarme auszuschließen. Der große Vorteil unserer Protokoll ist, dass es ermöglicht die Identifizierung von Proteinen und Metaboliten Partnern ein Zielprotein parallel in der Nähe von physiologischen Bedingungen (Mobilfunk lysate). Die vorgestellte Methode ist einfach, schnell und leicht an biologische Systeme als Pflanze Zellkulturen angepasst werden kann.
Introduction
Hier beschriebenen Methode zielt auf die Identifizierung von Metaboliten und Protein Partnern eines Proteins der Wahl in den zellulären lysate Bedingungen in der Nähe vonin-Vivo . Es wurde spekuliert, dass viele weitere Metaboliten als heute charakterisiert eine wichtige regulatorische Funktion1. Metaboliten fungieren als biologische Schalter, verändern die Aktivität, die Funktionalität sowie die Lokalisierung ihrer Rezeptor Proteine2,3,4. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere bahnbrechende Methoden, die Identifizierung des PMI in Vivo oder in nahe -in-Vivo -Bedingungen ermöglichen entwickelten5. Verfügbaren Ansätze können in zwei Gruppen aufgeteilt werden. Die erste Gruppe umfasst Techniken, die mit einem bekannten-Metabolit Köder zu starten, um neues Protein Partner zu fangen. Methoden umfassen Affinität Chromatographie6, Medikament Affinität reagiert Ziel-Stabilität Assay7, Chemo-Proteomics8und thermische Proteom Profilerstellung9. Die zweite Gruppe besteht aus einer einzigen Methode, die mit einem bekannten Protein beginnt um kleine Molekül Liganden10,11zu identifizieren.
AP in Verbindung mit MS-basierte Lipidomics wurde zum Analysieren der Protein-Lipid-komplexe in Saccharomyces Cerevisiae12. Als Ausgangspunkt die Autoren verwendeten Hefestämme mit dem Ausdruck 21 Enzyme Ergosterin-Biosynthese beteiligt und 103 Kinasen verschmolzen zu einem Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) Tag. 70 % der Enzyme und 20 % von der Kinasen fanden sich verschiedene hydrophobe Liganden, Licht in das komplizierte Protein-Lipid-Interaktion-Netz zu binden.
Bisher konnten wir nachweisen, dass ähnlich wie Lipide, polar und semi-polare Verbindungen auch Proteinkomplexe isoliert von der zellulären Lysates13verpflichtet bleiben. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, wir beschlossen, die AP optimieren Methode vorher10,11 für Pflanzenzellen und hydrophilen Verbindungen14veröffentlicht. Zu diesem Zweck haben wir TAP Vektoren von Van Leene Et Al. 2010, erfolgreich im Einsatz im Werk PPI Studien15beschrieben. Um den Zeitaufwand zu transgenen Linien zu verkürzen, haben wir uns entschieden auf Arabidopsis Zellkulturen. Wir Beschäftigten eine einstufige Methyl- Tert-Butyl-Ether, (MTBE) / Methanol/Wasser Extraktions-Verfahren, so dass die Charakterisierung von Proteinen (Pellet), Lipide (organische Phase) und hydrophilen Metaboliten (wässrige Phase)16 in einem einzigen Affinitätsreinigung Experiment. EV-Steuerleitungen wurden eingeführt, um Fehlalarme, z.B. Proteine binden an dem Tag allein auszuschließen. Als Proof of Concept wir markiert drei (von fünf) Nukleosid Diphosphat Kinasen präsentieren in Arabidopsis Genom (NDPK1-NDPK3). Unter anderem Erkenntnisse konnten wir nachweisen, dass NDPK1 mit Glutathion S interagiert-Transferase und Glutathion. Folglich konnten wir beweisen, dass Glutathionylation14NDPK1 ausgesetzt ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, die vorgestellte Protokoll ist ein wichtiges Werkzeug zur Charakterisierung von Protein-Protein und Protein-Small-Molecule Interaktion Netze und stellt einen großen Fortschritt gegenüber bestehenden Methoden.
Protocol
Vorbereitung von transgenen Arabidopsis Kultur Zelllinien, einschließlich Klonen, Transformation, Auswahl und Wachstum Bedingungen finden Sie im17. Beachten Sie, dass EV Steuerleitungen empfohlen werden, um Fehlalarme zu korrigieren. Bestätigen Sie vor dem Experiment die Überexpression des Proteins Köder durch western-Blot Analyse, z.B. mit IgG-Antikörpern gegen den G-Protein-Teil des Tandem-Affinität-Tags. Es ist wichtig, dass die Wachstumsmedien aus Pflanzenmaterial Zelle Kultur getrennt.
1. Vorbereitung Zelle Pflanzenmaterial vor dem Experiment
- Wachsen einer PSB-L A. Thaliana Kultur Zelllinie das Protein des Interesses18überexprimiert.
- Bereiten Sie MSMO Medium, welches 4,43 g/L MSMO gemischt mit 30 g/L Saccharose enthält. Passen Sie den pH-Wert des Puffers bis 5,7 mit 1 M KOH und Autoklaven die Lösung. Vor dem Experiment das Medium mit 0,5 mg/L α-Naphthaleneacetic Säure, 0,05 mg/L Kinetin und 50 μg/mL Kanamycin zu ergänzen.
- Kultivieren Sie transformierten Pflanze Zellkulturen in 50 mL MSMO Medium in ein 100 mL Fläschchen auf eine orbitale Plattform Shaker mit sanften Agitation (130 u/min). Wachsen Sie Zellen in einem Kultur-Raum bei 20 ° C und Lichtintensität gleich 80 μmol m-2 s-1.
- Subkultur Zellen in frische Medien alle 7 Tage, verdünnen sie 01:10.
- Sammeln Sie Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase mit einem Glastrichter in Kombination mit einer Vakuumpumpe mit einer Nylon-Mesh als Filter. Das Infiltrat in Alufolie wickeln und Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
Achtung: Beachten Sie, dass Flüssigstickstoff extrem kalt ist. Unsachgemäße Handhabung kann zu Verbrennungen führen. Geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung zu tragen, einschließlich der thermisch isolierte Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel.
2. Tippen Sie auf Protokoll
Hinweis: Der folgende Schritt ist Maeda Et Al. 201411 und Van Leene Et Al. 201117angepasst.
- Homogenisieren Sie geerntet und gefrorenen Zelle Kultur Pflanzenmaterial mit einem Mixer Mühle (2 min bei 20 Hz) oder Mörser und Stößel, um feines Pulver zu erhalten. Aliquoten 3 g des Mahlgutes (entspricht rund 90 mg Gesamt-Protein) pro Probe. Vermeiden Sie Auftauen der Probe während dieses Schrittes durch die Verwendung von flüssigem Stickstoff vorgekühlt Ausrüstung.
Hinweis: Store Boden Pflanzenmaterial in 50 mL-Tube bei –80 ° C an den Anfang eines AP-Verfahrens. - Genannte Probe in einem flüssig-Stickstoff-vorgekühlt Mörser mit 3 mL eiskaltes Lyse Puffer (0,025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl; 1,5 mM MgCl2; 0,5 mM DTT; 1 mM NaF; 1 mM Na3VO4; 100 x verwässerte kommerzielle Proteaseinhibitor cocktail; 1 mM PMSF) bis das Material auftaut. Sobald die Probe Taut, sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Hinweis: Die Lyse Puffer frisch zubereiten. Leere Proben bei diesem Schritt einführen. Reinigungsmittel sind nicht empfehlenswert, da sie in MS-Detektion Probleme verursachen können. - Um zelltrümmer zu entfernen, teilen Sie das Material in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 20.817 x g für 10 min bei 4 ° C. Sammeln Sie 3 mL klare lysate in einem konischen Zentrifugenröhrchen 15 mL.
- Während Zentrifugationsschritt equilibrate IgG-Sepharose-Kügelchen. Aliquoten 100 µL der Perlen pro Probe und waschen Sie sie mit 1 mL Lyse-Puffer. Wirbel, Perlen und Blitz-Spin aufzuwirbeln. Verwerfen Sie die Lyse-Puffer zu und wiederholen Sie den Schritt zweimal. Perlen in 400 µL Lyse Puffer aufzuwirbeln.
- Die gesammelten Pflanze lysate Perlen hinzufügen und die Mischung auf einem rotierenden Rad für 1 h bei 4 ° c inkubieren
- Übertragung der Mischung in eine Spritze kombiniert über Luer-Lock-Kappe mit einer Spin-Spalte mit Filter Pore Größe 35 µm. übernehmen Druck lysate durch übergeben. Perlen mit beigefügten Anlagen bleiben auf dem Filter, während die lysate durchlaufen wird.
Hinweis: Verwenden Sie optional ein Vakuumsystem vielfältig. Stellen Sie sicher, sanften Druck um die Perlen zu Schaden nicht zu gelten. - Perlen am Anfang mit 10 mL Waschpuffer waschen (0,025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl), und dann mit 1 mL der Elution Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,5 mM EDTA; 1000 x verdünnten E64 und 1 mM PMSF). Führen Sie das Waschen mit einer Spritze an der Spalte oder die vielfältigen Vakuumsystem befestigt.
Hinweis: Wenn mit einem vielfältigen Vakuumsystem stellen Sie sicher, sanften Druck um die Perlen zu Schaden nicht zu gelten. - Inkubieren Sie Perlen mit dem 400 µL Elution Puffer mit 50 U eine verbesserte Version des Tabaks Ätzen (entwicklelt) Virus-Protease. Verwenden Sie Tabelle Shaker bei 1.000 u/min für 30 min bei 16 ° C.
Hinweis: Denken Sie daran, einen Stecker zu verwenden, um die Spalte an der Unterseite der Elution Buffer hinzufügen zu schließen. - Fügen Sie eine extra-Portion (50 U) des Enzyms in der Spalte und inkubieren Sie die Mischung für die nächsten 30 min unter den gleichen, oben beschriebenen Bedingungen.
- Sammeln Sie das Eluat in einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch durch Zentrifugation (1 min, 20.817 x g) oder durch Vakuum-Verteiler. Entfernen der restlichen komplexe stellen Sie einen zusätzliche Elution Schritt mit 200 µL der Elution Puffer vor.
Hinweis: Bewahren Sie die Probe bei – 20 ° C oder –80 ° C, oder sofort mit dem Protein und Metabolit Extraktionsschritt fortfahren. Gefrorene Proben auf Eis Auftauen.
3. Western-Blot Analyse
- Um das Vorhandensein des Köders zu bestätigen Protein in den gesammelten Eluat verwenden 10 µL Protein-Metabolit-haltigen Eluat für SDS-PAGE und western-Blot Analysen. Um das Protein des Interesses zu identifizieren, verwenden Sie Maus primären Antikörper gegen Streptavidin-bindeprotein (1: 200), ein Teil des TAP-Tags bleiben nach TEV Protease Spaltung, wie unter Van Leene Et Al. 201117. Als nächstes verwenden Sie sekundäre Ziege-Anti-Maus-Antikörper mit HRP gekoppelt.
(4) Metaboliten und Proteingewinnung
Hinweis: Dieses Protokoll wird von Giavalisco Et Al. 201116angepasst.
Hinweis: Von diesem Schritt ab verwenden Sie UPLC-MS-Lösungen.
- Fügen Sie 1 mL Methyl- Tert-Butyl Ether (MTBE) / Methanol/Wasser, Lösungsmittel (3:1:1) um die gesammelten Eluat und mischen die Probe durch Umkehrung. Stellen Sie sicher, dass das Lösungsmittel bis – 20 ° C vor dem Extraktionsschritt gekühlt wird.
Achtung: MTBE und Methanol sind Schadstoffe. Führen Sie die Extraktionsschritt unter dem Abzug und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, z. B. Handschuhe zu. - Fügen Sie 0,4 mL Methanol: Wasser 1:3 Lösung zu jeder Probe hinzu und mischen Sie den Gehalt der Probe durch Umkehrung.
Hinweis: Ergänzung der Mischung mit Methanol: Wasser-Lösung führt Phasentrennung. Die obere Phase enthält Lipide, untere Phase enthält polar und semi-polare Metaboliten und Proteine finden Sie im Pellet. - Phasen zu trennen, Zentrifugieren der Probe bei 20.817 x g für 2 min bei Raumtemperatur, dann sammeln die obere Phase für Lipid Messungen (nicht in diesem Protokoll) mit einer manuellen Handhabung von Flüssigkeiten-Pipette mit 1 mL Fassungsvermögen.
- 0,2 mL Methanol und Mix durch Umkehrung hinzufügen.
- Zentrifugieren Sie die Probe 20.817 x g für 2 min bei RT, dann sammeln Sie die polaren Phase für Metabolit Messungen (polar und semi-polaren Verbindungen). Um nicht zu stören das Protein-Pellet, verlassen Sie rund 50 µL der flüssigen Phase an der Unterseite des Rohres.
- Trockenen gesammelte Proben für Metabolit Messungen über Nacht in eine zentrifugale Verdampfer. Vermeiden Sie übermäßig trocknen die Protein-Pellets durch Entfernen von Proben aus dem Verdampfer nach 30-60 min.
Hinweis: Bewahren Sie Proben bei – 20 ° C oder –80 ° C, oder fahren Sie sofort mit der Vorbereitung von Proteinen für LC-MS/MS-Analyse.
5. Vorbereitung Proben Proteomic Analysen
Hinweis: Dieser Schritt ist von Olsen Et al. 200419 und das technische Handbuch des Trypsin/Lys-C-Mix (siehe Tabelle der Materialien).
- Führen Sie enzymatische Verdauung der Probe.
Achtung: Lösungsmittel verwendet, während der enzymatischen Verdauung und Entsalzung der Probe sind schädlich. Arbeiten unter dem Abzug und geeignete persönliche Schutzausrüstung, z. B. Handschuhe zu tragen.- Lösen Sie Protein-Pellet in 30 µL frisch zubereitete Denaturierung Puffer (40 mM Ammonium Bicarbonat mit 2 M Thioharnstoff/6 M Harnstoff, pH 8 auf). Um bessere Löslichkeit des Proteins zu erreichen, führen Sie einen 15-min-Beschallung Schritt aus. Wiederholen Sie den Schritt, bis sich die Tablette aufgelöst.
- Zentrifugieren Sie die Probe 20.817 x g für 10 min bei 4 ° C, dann übertragen Sie den überstand zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch.
- Proteinkonzentration mit Bradford Protein Assay zu bestimmen.
- Für weitere Analysen, aliquoten ein Volumen entspricht 100 µg Protein und die Probe bis zu 46 µL mit Denaturierung Puffer zu füllen.
- Hinzu kommt die Probe 2 µL der frisch zubereiteten Reduktion Puffer (50 mM, die DVB-t-H2O aufgelöst) und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Probe mit 2 µL der frisch zubereiteten Alkylierung Puffer (150 mM Iodoacetamide in 40 mM Ammonium Bicarbonat Puffer aufgelöst) zu behandeln und die Mischung in der Dunkelheit für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Probe mit 30 µL 40 mM Ammonium Bicarbonat-Puffer verdünnen und 20 µL des LysC/Trypsin-Mix hinzufügen.
- Verdünnen Sie nach 4 h Inkubation bei 37 ° C die Probe mit 300 µL 40 mM Ammonium Bicarbonat Puffer.
- Fahren Sie mit Übernachtung Inkubation bei 37 ° C.
- Ansäuern der Probe mit ca. 20 µL 10 % Trifluoroacetic Säure (TFA), pH < 2 zu erhalten. Überprüfen Sie die Probe pH-Wert mit einem pH-Streifen.
Hinweis: Speichern Sie die Probe bei – 20 ° C oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Entsalzen Sie die verdaute Proteine.
Hinweis: Verwenden Sie vorzugsweise, einem vielfältigen Vakuumsystem. Vermeiden Sie übermäßige Trocknung der Spalte.- Spülen Sie die C18 SPE-Spalte (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 mL 100 % MeOH und dann mit 1 mL 80 % Acetonitril (ACN) mit 0,1 % TFA in Wasser verdünnt. Verwendung, hier und in weiteren Protein-Entsalzung Schritte, einem vielfältigen Vakuumsystem, um den Prozess zu beschleunigen. Vermeiden Sie übermäßige Trocknung der Spalte.
- Equilibrate der Spalte durch Waschen zweimal mit 1 mL 0,1 % TFA in Wasser verdünnt.
- Laden Sie die Probe auf die Säule. Spülen-Tube mit zusätzlichen 200 µL 0,1 % TFA und Übertragung der Lösung auf die Spalte. Laufen Sie die Lösungen durch die Säule.
- Waschen Sie die Spalte zweimal mit 1 mL 0,1 % TFA.
- Eluieren entsalzten Peptide aus der Spalte mit 800 µL 60 % ACN, 0,1 % TFA Lösung. Trocknen Sie die gesammelten Bruch in eine zentrifugale Verdampfer, über die Proteinfraktion durch Entfernen von Proben aus dem Verdampfer nach 30 – 60 min trocknen zu vermeiden.
Hinweis: Bewahren Sie Proben bei – 20 ° C oder –80 ° C oder sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren. Halten Sie in den nachfolgenden Schritten Proben auf Eis.
6. Messung vorbereitet Proteinproben mit UPLC-MS/MS.
Hinweis: Vor der Proteomik und Metabolomic Messungen Filtern (0,2 µm Porengröße) und degas alle Puffer mit Hilfe einer Vakuumpumpe für 1 h.
- Aufschwemmen getrocknet Peptid Pellet gespeichert in 2 mL Microcentrifuge Schlauch in 50 µL Puffer C (3 % V/V ACN, Ameisensäure 0,1 % V/V) mit manueller Handhabung von Flüssigkeiten Pipette mit 200 µL Volumenkapazität. Beschallen Sie Proben für ein 15 min in ein Ultraschallbad mit 35 kHz Ultraschallfrequenz.
Achtung: ACN und Ameisensäure sind Schadstoffe. Arbeiten unter dem Abzug und geeignete persönliche Schutzausrüstung, z. B. Handschuhe zu tragen. - Zentrifugieren Sie die Probe 20.817 x g für 10 min bei 4 ° C, dann 20 µL des Überstands auf einer Glasflasche.
- Separate verdauten Peptide mit einer C18 umgekehrt Phase Spalte verbunden ein Flüssigchromatographie und Massenspektren mit einem Massenspektrometer zu erwerben.
- Trennen Sie in der Spalte 3 µL der Probe einen 300-nl/min Durchfluss. Verwenden Sie für eine mobile Phase Puffer C und D (63 % V/V ACN, Ameisensäure 0,1 % V/V), bilden ein Gefälle von 3 % Rampen ACN auf 15 % ACN über 20 min und dann 30 % ACN über die nächsten 10 min.
Hinweis: Bewahren Sie den Rest der Probe bei – 20 ° C oder –80 ° C bis zu einigen Monaten. Vor der Messung der Proteomik Einfrieren der Probe auf dem Eis. - Auswaschen von Verunreinigungen für 10 min. mit 60 % ACN und equilibrate die Spalte mit 5 µL Puffer C vor der Messung der nächsten Probe.
- Gewinnen Sie Massenspektren mit datenabhängiges MS/MS-Methode mit Auflösung bei 70.000, AGC Ziel der 3e6 Ionen, maximale Einspritzzeit von 100 ms und eine von 300 bis 1600 m/Z. Erwerben Sie bis zu 15 MS/MS-Scans mit einer Auflösung von 17.500, AGC-Ziel von 1e5, maximale Einspritzzeit von 100 ms Unterfüllung Verhältnis von 20 %, mit einer Isolierung Fenster von 1,6 m/Z und m/Z von 200 bis 2000. Apex-Trigger (6 – 20 s), Set dynamische Ausgrenzung 15 s und ausschließen Gebühren 1 und > 5 zu ermöglichen.
- Trennen Sie in der Spalte 3 µL der Probe einen 300-nl/min Durchfluss. Verwenden Sie für eine mobile Phase Puffer C und D (63 % V/V ACN, Ameisensäure 0,1 % V/V), bilden ein Gefälle von 3 % Rampen ACN auf 15 % ACN über 20 min und dann 30 % ACN über die nächsten 10 min.
7. Verarbeitung Proteomic Daten
- Laden Sie die neueste Arabidopsis Thaliana Proteome Datenbank von http://www.uniprot.org/ und enthalten Sie Schadstoff-Datenbank. Analysieren von Rohdaten aus der LC-MS gewonnen läuft mit MaxQuant mit der integrierten Andromeda Peptid-Suchmaschine mit Standardeinstellung mit aktiviert LFQ Normalisierung20,21,22. Finden Sie detaillierte Informationen über Parameter, die in Tabelle S1eingesetzt.
- Öffnen Sie die Ausgabedatei "Protein groups.txt". Für die weitere Analyse filter für Protein-Gruppen mit mindestens zwei einzigartige Peptide identifiziert. Entfernen Sie Protein Gruppen definiert durch MaxQuant als potenzielle Schadstoffe und Filter für A. Thaliana Proteine (ARATH in Fasta Header Spalte) in Datenbank vorhanden.
- Um die Bedeutung der proteinanreicherung zwischen Proben zu testen, verwenden Sie LFQ normalisiert Intensitäten und führen Sie ungepaarte, zweiseitigen Student t-Test, gefolgt von mehreren Vergleich Korrektur (z.B. Benjamini & Hochberg false Discovery Rate (FDR) Korrektur oder Bonferroni-Korrektur).
- Berechnen Sie p-Wert, durch den Vergleich LFQ Intensitäten für EV Kontroll- und NDPK1 erhalten. Alle unbestimmte Werte herausfiltern. Sortieren Sie p-Werte in aufsteigender Reihenfolge zu und mit R-Skript oder Online-Rechner (z. B. https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR), um FDR-Korrektur zu berechnen. Filter für FDR Werte unter 0,1.
Bitte beachten Sie die Form der Datenanalyse für die Forschung geeignet. Für quantitative Studien (Analyse der proteinanreicherung zwischen Proben) den Intensitätswert "LFQ" verwenden, während für qualitative Forschung (Vorhandensein oder Fehlen von bestimmten Proteins) wählen Sie die "Intensität"-Wert. - Filter für Protein-Gruppen, die häufiger in NDPK1 im Vergleich zu EV-Kontrolle sind. Lokalisierung von Protein-Partnern mit SUBA Datenbank23 ermitteln und beheben für Protein zusammen mit NDPK1 lokalisiert.
- Berechnen Sie p-Wert, durch den Vergleich LFQ Intensitäten für EV Kontroll- und NDPK1 erhalten. Alle unbestimmte Werte herausfiltern. Sortieren Sie p-Werte in aufsteigender Reihenfolge zu und mit R-Skript oder Online-Rechner (z. B. https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR), um FDR-Korrektur zu berechnen. Filter für FDR Werte unter 0,1.
8. Messung von Proben mit polaren Phase mit UPLC-MS.
- Getrocknete polaren Phase vom Schritt 4.5 in 200 µL Wasser aufschwemmen und die Probe für 5 min beschallen.
- Zentrifugieren Sie die Probe 20.817 x g für 10 min bei 4 ° C, dann des Überstands auf eine Glasflasche.
Hinweis: Bewahren Sie den Rest der Probe bei – 20 ° C oder –80 ° C für bis zu mehreren Monaten. Vor der Metabolomic Messung wieder Einfrieren der Probe auf dem Eis. - Führen Sie einen Trennung Schritt mit UPLC gekoppelt, um C18 umgekehrt Phase Spalte und erwerben Sie Massenspektren mit MS zu.
- Auf die Spalte 2 µL der Probe pro Injektion für jeden Modus Ionisation (positiv und negativ) laden und den Bruch mit 400 µL/min Durchfluss zu trennen. Zum Erstellen den erforderlichen Farbverlauf für Metabolit Messung mobilen Phase Lösung wie folgt vorbereiten: eine (0,1 % Ameisensäure in H2O) zu puffern und Puffer B (0,1 % Ameisensäure ACN).
- Separaten Metaboliten bei 400 µL/min und die folgende Steigung: 1 min 99 % der Puffer A, 11-min lineare Farbverlauf von 99 % der Puffer A bis 60 % der Puffer A, 13 min linearen Verlauf von 60 % des Puffers A bis 30 % der Puffer A, 15-min linearen Farbverlauf von 30 % der Puffer A bis 1 % der Puffer A halten Sie Konzentration von 1 % bis 16 min. ab 17 min, Verwendung linearer Farbverlauf von 1 % des Puffers A zu 99 % des Puffers A. neu equilibrate der Spalte 3 min mit 99 % Konzentration von A vor der Messung der nächsten Probe zu puffern.
- Massenspektren für Massenbereich erwerben zwischen 100 und 1500 m/Z mit Auflösung auf 25.000 und Ladezeit auf 100 Ms. eingestellt AGC Ziel bis 1e6beschränkt, Kapillare Spannung 3kV mit einem Mantel gas Flow und Hilfs Gaswert von 60 und 20 , beziehungsweise. Kapillare Temperatur auf 250 ° C und Skimmer Spannung bis 25V einstellen.
9. Datenverarbeitung Metabolomics
- Verfahren gesammelt Chromatogramme von beiden Modi Ionisation erworben. Verwenden Sie Software, um Masse, Ladung-Verhältnis (m/Z), Verweilzeit (RT) und Intensität der damit verbundenen Gipfeln, z. B. kommerzielle Software zu extrahieren (siehe Tabelle der Materialien) oder alternative24.
- Starten Sie Processing-Software durch Doppelklicken auf die .exe-Datei
- Erstellen Sie neuen Workflow, suchen Sie Aktivität "Aus Datei laden" und bewegen Sie diese Aktivität durch "drag and drop" in den leeren Workflow Raum. Drücken Sie die Aktivität mit der rechten Maustaste und öffnen Sie die Einstellungen der Aktivität.
- Legen Sie in der Registerkarte "Allgemeine" Einstellungen enthält einen Namen für das Experiment im Feld "Name" und klicken Sie anschließend auf "ausgewählte Dateien und Ordner" und markieren Sie roh Chromatogramme.
- In der Registerkarte "Erweitert" Einstellungen enthält soll "Profil Daten Cutoff" 0 Intensität. Klicken Sie auf "Übernehmen" und "OK".
- Suchen und Aktivität "Fegen Daten" hinzufügen. Drücken Sie die Aktivität mit der rechten Maustaste und öffnen Sie die Einstellungen der Aktivität.
- Markieren Sie in der Registerkarte "Allgemeine" Einstellungen enthält "Schwerpunkt" und "MS/MS-Daten". Entfernen Sie alle MS/MS-Daten durch Auswahl von "Alles" im Auswahlfenster.
- Suchen nach und Hinzufügen der Aktivität "Chromatogramm chemische Lärm Subtraktion". Drücken Sie die Aktivität mit der rechten Maustaste und öffnen Sie die Einstellungen der Aktivität.
- Markieren Sie in der Registerkarte "Allgemeine" Einstellungen enthält "Chromatogramm Glätten" und legen Sie Anzahl der Scans auf "3" und "Gutachter", "Moving Average". Legen Sie "RT-Fenster" auf 51 Scans, "Quantil" auf 50 %, Subtraktion "Methode" und 750 Intensität "Threshold".
- Markieren Sie in der Registerkarte "Erweitert" Einstellungen enthält "RT Struktur entfernen" und "RT Mindestlänge" auf 5 Scans.
- Markieren Sie in der Registerkarte "Advanced" Einstellungen enthält "m/Z Struktur entfernen" und "Minimum m/Z Länge" auf 3 Punkte.
- Suchen nach und Hinzufügen der Aktivität "Chromatogramm RT Alignment". Drücken Sie die Aktivität mit der rechten Maustaste und öffnen Sie die Einstellungen der Aktivität.
- In der Registerkarte "Allgemeine" Einstellungen enthält soll "Ausrichtung Scheme", "Paarweise Ausrichtung Basis Baum" und "RT Suchintervall" 0,5 min.
- Verwenden Sie in der Registerkarte "Erweitert" Einstellungen enthält Standard-Parameter.
- Suchen nach und Hinzufügen der Aktivität "Peak Detection" in "Chromatogramm" Gruppe von Aktivitäten. Drücken Sie die Aktivität mit der rechten Maustaste und öffnen Sie die Einstellungen der Aktivität.
- Legen Sie in der Registerkarte "Allgemeine" Einstellungen enthält "Summierung Fenster" auf 0,09 min, "Peak Mindestgröße" auf 0,03 min, "Merge Höchstentfernung" um 5 Punkte und "Merge-Strategie" zu "Zentren". In der "Peak-RT-Splitting" Box "Lücke/Peak-Ratio" auf 50 % eingestellt.
- Stellen Sie in der Registerkarte "Erweitert" Einstellungen enthält ein "Smoothing Window" auf 5 Punkte, "Verfeinerung Schwelle" zu 80 % und "Konsistenz Threshold" auf 1 Set "Center Computation" als "Intensität-gewichteten" mit "Intensität Threshold" auf 70 % eingestellt.
- Suchen nach und Hinzufügen der Aktivität "Isotop Clustering" in "Chromatogramm" Gruppe von Aktivitäten. Drücken Sie die Aktivität mit der rechten Maustaste und öffnen Sie die Einstellungen der Aktivität.
- Legen Sie auf der Registerkarte "Allgemeine" Einstellungen enthält "RT Toleranz" zu 0,015 min und "m/Z Toleranz" bis 5 ppm.
- In der Registerkarte "festgelegt enthält"Umschlag passenden"Einstellungen"Methode"als"No Form Einschränkung"und"Ionisation"als"Protonierung (für positiv Mode) und "Deprotonierung" (für negative Modus). Legen Sie "Minimum und Maximum berechnen" auf 1 und 4, jeweils.
- Verwenden Sie in der Registerkarte "Erweitert" Einstellungen enthält Standard-Parameter.
- Suchen nach und Hinzufügen von Aktivität "Singleton-Filter".
- Um Ergebnisse der Datenverarbeitung zu exportieren, suchen nach und Hinzufügen der Aktivität "Analyst" in "Export" Gruppe von Aktivitäten.
- Legen Sie in der Registerkarte "Allgemeine" Einstellungen enthält "Typ" als "Cluster" und "Observable" als "Summiert Intensität". Wählen Sie "Benutzerdefiniert" und geben Sie Verzeichnis der Exportdatei.
- Verwenden Sie in der Registerkarte "Erweitert" Einstellungen enthält Standard-Parameter.
- Kommentieren Sie Masse Funktionen mit Hilfe von internen Referenz-Compound-Datenbank.
- Analysieren eines oder mehrerer MS Klasse Referenz-Verbindung per UPLC-MS. benützen die gleiche LC-MS-Methode für die Analyse von Referenz-Verbindungen und Metaboliten zusammen mit Protein des Interesses gereinigt.
Hinweis: Für diese Studie wurde eine Reihe von fast 300 Dipeptide analysiert und als Referenz-Compound-Bibliothek verwendet. - Analyse (siehe Tabelle der Materialien) Software, raw Chromatogramm Datei und Suche zu öffnen, für spezifische m/Z und RT zugeordnet gemessen Referenz-Verbindung (siehe Bedienungsanleitung).
Hinweis: Sekundärmetaboliten unterscheiden sich in Art der Ionisation. Überprüfen Sie, ob die Anwesenheit des gemeinsamen Addukte durch Suche nach Masse gleich M-1.007276 und M + 1.007276, 18.033823 M + M + 22.989218 Ion für [M-H], [M + H], [M + NH4] und [M + Na], beziehungsweise. - Gebrauch Kalkulationstabelle öffnen "Analyst" Datei nach der Verarbeitung der Chromatogramme und Suche nach spezifischen Ionen erhalten exportiert Masse. RT der Masse Funktion gemessen in Experiment und RT der Referenz Verbindung zu vergleichen. Erlauben Sie eine Abweichung von 0,005 Da für m/Z und 0,1 min für RT.
- Analysieren eines oder mehrerer MS Klasse Referenz-Verbindung per UPLC-MS. benützen die gleiche LC-MS-Methode für die Analyse von Referenz-Verbindungen und Metaboliten zusammen mit Protein des Interesses gereinigt.
- Um die Bedeutung der Metabolit Bereicherung Co gereinigt mit bestimmten Proteins zwischen Proben (Linie mit überexprimieren Protein des Interesses Vs EV Kontrolle) zu testen, zu vergleichen mit zweiseitigen nicht gepaart Schülers t-Test, gefolgt von mehreren Spitzenwerte Vergleich-Korrektur (z.B. Benjamini & Hochberg false Discovery Rate Korrektur oder Bonferroni-Korrektur).
Representative Results
In der ursprünglichen Studie wurden drei A. Thaliana NDPK Gene in Zellkulturen Aussetzung PSB-L unter der Kontrolle der konstitutiven 35 s-Promoter14 (Abbildung 1) überexprimiert. Tandem-Affinität-Tag war an entweder Carboxy oder amino-terminalen Ende eines Köder-Proteins fusioniert. Die komplexe Affinität gereinigt wurden MTBE/Methanol/Wasser-Extraktion16unterzogen. Affinität zog Proteinen und kleinen Molekülen wurden mit MS (Tabellen S2 und S3) identifiziert.
Um Fehlalarme zu beheben, wurden leere Proben verwendet, um kleine Molekül Verunreinigungen aus der Chemie- und Labor-Verbrauchsmaterialien auszuschließen. Darüber hinaus wurden Metaboliten und Proteine, die entweder einen Affinität Tag binden oder Harz allein entfielen mit EV Steuerleitungen. Zum Abrufen von wahren positiven, zweiseitige nicht gepaart Schülers t-Test und Benjamini & Hochberg false Discovery Rate wurde Korrektur angewandt, um Metaboliten (Tabelle S4) und Proteine (Tabelle S5) wesentlich bereichert, in der NDPKs AP zu identifizieren Experimente (N - und C-Terminal NDPKs markiert) im Vergleich zu den EV-Steuerleitungen (FDR < 0,1). Beachten Sie, dass in den früheren arbeiten wir Abwesenheit/Präsenz Kriterien, Protein und kleine Molekül Interaktoren abzugrenzen.
Repräsentative Ergebnisse erhalten für NDPK1, während auf Dipeptide, einer neuartigen Klasse der kleinen Molekül Regulierungsbehörden studierte in unserer Gruppe Metabolit Daten konzentrieren. Proteomic Analyse ergab 26 vermeintliche Protein-Partner des NDPK1. Durch weitere Filterung für Proteine, die gemeinsam im selben subzelluläre Raum als NDPK1 lokalisiert (Zytosol), die Liste verengt sich auf 13 mutmaßliche Protein Interaktoren. Unter den identifizierten Proteine waren Glutathion S-Transferase, zwei Dehnung Einleitung Faktoren, Tubulin und aconitate Hydratase. Metabolomic Analyse ergab vier Dipeptide Val-Leu, Ile-Glu Leu-Ile und Ile-Phe, die speziell Co eluiert mit NDPK1 (Abbildung 2). Beachten Sie, dass alle vier Dipeptide einen hydrophoben Rest in ihrem N-Terminus, was auf gemeinsame verbindliche Spezifität teilen.
Suchen Sie nach bekannten Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe wir identifiziert abgefragten 13 Proteine und vier Dipeptide gegen den Stich Datenbank25 (Abbildung 3). Mehrere Beobachtungen gemacht werden könnte: (i) keines der interagierenden wurde zuvor für NDPK1 gemeldet. (Ii) APX1 Ortholog wurde berichtet, dass Aldehyde Dehydrogenase Familienmitglied ALDH7B4, während der Einleitung Übersetzungsfaktor FBR12 mit einer anderen Übersetzung Einleitung Faktor kodiert durch das Gen AT2G40290 interagieren. (Iii) die identifizierten Dipeptide haben kein Protein Partner berichtet. Co eluierten Dipeptide wurden früher als alle abgerufenen pflanzlichem Eiweiß verbunden nicht gemeldet. Allerdings spielen sie eine wichtige Rolle in anderen Organismen: Leu-Ile, z. B.hat eine Neurotrophin-aktivierende Wirkung in einer menschlichen Zelle Zeile26. Beachten Sie, dass das Experiment nicht erlaubt die genaue Topologie des Systems zu identifizieren. Zum Beispiel ein Dipeptid kann direkt mit NDPK1 interagieren aber kann auch im Zusammenhang mit einem der Co gereinigter Proteine.
Zusammen genommen, unsere Ergebnisse zeigen, dass das festgelegte Verfahren, Einsatz von AP zusammen mit Massenspektrometrie, erleichtert die Identifizierung von Protein-Protein und Protein-Small-Molecule Interaktoren und hilft umfassende Informationen über generieren die Interaktom des Zielproteins.
Abbildung 1: Schema des AP-MS-Workflow. (A) Vorbereitung einer native lösliche Fraktion aus pflanzlichen Zellkultur. (B) die nächsten Schritte in der AP-Prozedur. Nach dem Laden der Probe auf die Säule, bindet das Protein von Interesse (POI) verschmolzen zu einem TAP-Tag an der IgG-Antikörper auf die Agarose-Perlen immobilisiert. Waschen der Spalte erleichtert die Entfernung von ungebundenen Proteinen und Metaboliten. Nach der Durchführung entwicklelt Spaltung, sind POI Protein-Metabolit komplexe eluiert. (C) Trennung von komplexen in Protein und Metabolit Fraktion gefolgt von semi-quantitativen MS-Analyse. Teil dieser Figur wird von Luzarowski Et Al. 201714wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Dipeptide speziell Co eluierenden mit NDPK1. Durchschnittliche Intensität von vier Dipeptide Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)und Ile-Phe (D) in AP Experiment gemessen wurden aufgetragen. Alle vier Dipeptide zeigen deutliche Bereicherung in NDPK1 Proben im Vergleich zur Kontrolle der EV (Sternchen darstellen FDR < 0,1). Fehlerbalken darzustellen Standardfehler für 6 Messungen (3 Wiederholungen von N- und C-Terminal 3 markiert Proteine). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Interaktion-Netzwerk aller Moleküle zusammen mit NDPK1, eluierenden abgefragt gegen Stich-Datenbank unter Berücksichtigung nur frühere experimentelle und Datenbank Beweise (Vertrauen > 0,2). Mehr Zuversicht zeigt höhere Chancen von Interaktion und errechnet sich anhand der hinterlegten Daten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle S1. MaxQuant output-Tabelle "parameters.txt". Tabelle enthält Grenzwerte für die Identifizierung und Quantifizierung sowie Informationen über die verwendeten Datenbanken. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Tabelle S2. Ausgabe von Informationen aus MaxQuant Tabelle "proteinGroups.txt". Tabelle enthält eine Liste aller identifizierten Protein Gruppen, Intensitäten und zusätzliche Informationen wie Anzahl der einzigartigen Peptide und Partitur. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Tabelle S3. Ausgabedatei, die Analyse der polaren Metaboliten. Tabelle enthält eine Liste aller identifizierten Masse Features zeichnet sich durch spezifische m/Z, RT und Intensität. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Tabelle S4. Dipeptide in AP Proben gefunden, in denen NDPK1, NDPK2 oder NDPK3 als Köder verwendet wurden. Dipeptide im leeren Proben wurden aus der Liste ausgeschlossen. Zwei unabhängige Linien (gekennzeichnet in beiden N - oder C-Terminus) für jede NDPK wurden in dreifacher Ausführung ausgeführt. Schülers t-test und weitere Korrektur der p-Wert mit Benjamini & Hochberg Methode wurden verwendet, um deutlich bereichert interactor Partner des NDPKs zu bestimmen (FDR < 0,1). ΔRT errechnet sich in Bezug auf die Referenzverbindungen und Δppm in Bezug auf die Monoisotopic Masse in Metlin27gegeben gegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Tabelle S5. Proteine, die gemeinsam mit NDPK1 gereinigt. Zwei unabhängige Linien (gekennzeichnet in beiden N - oder C-Terminus) für jede NDPK in dreifacher Ausfertigung ausgeführt wurden. Schülers t-test und weitere Korrektur der p-Wert mit Benjamini & Hochberg Methode wurden verwendet, um deutlich bereichert interactor Partner des NDPKs zu bestimmen (FDR < 0,1). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Discussion
Die vorgestellte Protokoll ermöglicht parallele Identifikation von PP und PM-komplexe an ein Zielprotein. Von Klonen zur endgültigen Ergebnisse, kann das Experiment in weniger als 8 bis 12 Wochen abgeschlossen werden. Komplette AP dauert ca. 4-6 h für eine Gruppe von 12 bis 24 Proben, Rendern unser Protokoll für mittleren Durchsatz Analyse geeignet.
Das Protokoll, trotz insgesamt einfach, hat eine Reihe von kritischen Schritte. (i) ausreichende Menge an input Protein und Affinität Perlen ist entscheidend für einen dynamischen Bereich von Metaboliten Erkennung zu erreichen. Effiziente Zelle Lysis ist daher ein entscheidender Schritt im Verfahren. Armen Protein Erträge können eine Folge der unzureichenden Pulverisierung des Materials oder der suboptimalen Lyse-Puffer/Material-Verhältnis sein. (Ii) Vorsicht geboten, dass die verwendeten Reagenzien MS-freundlich sind. Starke Reinigungsmittel, Glycerin oder übermäßige Mengen von Salz sollte vermieden werden, da sie mit MS-Detektion stören. (Iii) Agarose Korne sollte nicht über getrocknete während Waschschritte, und bei Vakuum vielfältige Verwendung ist es wichtig, einen langsamen Durchfluss um nicht zu zerstören die Perlen oder beeinflussen Komplexstabilität anzuwenden.
Es gibt einige wichtigen möglichen Änderungen des vorliegenden Protokolls: (i) Wir verwenden die konstitutive CaMV35S Promotor Köder Eiweißmenge zu maximieren. Überexpression, kann zwar sehr nützlich, ernsthafte Auswirkungen auf Zelle Homöostase28 haben und führen zur Bildung von physiologisch irrelevant Interaktionen. Ausdruck der tagged Proteine mit native Promotoren und wo möglich in einem Verlust der Funktion zum Abrufen der wahre biologische Interaktoren überlegen ist. Für Proteine, die normalerweise nicht in pflanzlichen Zellkulturen ausgedrückt könnte ein Pflanze Hintergrund notwendig, um relevante Interaktoren identifizieren. (Ii) bei der Arbeit mit Membranproteine muss der Lyse Puffer mit einer MS-kompatible Reinigungsmittel ergänzt werden. (Iii) Einführung eines zweiten Affinitätsreinigung Schritts Fehlalarme wahr-positive Verhältnis verbessern und beseitigen die Notwendigkeit für EV Steuerelemente29. Ein neuartiger Tandem-Tag mit zwei unabhängigen Protease-spaltstellen stellt eine attraktive Alternative zu der Größe-Ausschluss Chromatographie Schritt hinzugefügt von Maeda Et Al. 201411, das ist mühsam und zeitaufwendig.
Der schwerwiegendste Nachteil des AP ist die hohe Rate falsch positiver Ergebnisse. Die Gründe sind zahlreich. Konstitutive Überexpression wurde bereits erwähnt. Eine weitere Quelle für physiologisch irrelevant Interaktionen ist, wenn Arbeit mit isolierten Organellen, Vorbereitung der gesamten Zelle Lysates mit Mischungen von Proteinen und Metaboliten aus verschiedenen subzelluläre Kompartimente. Subzelluläre Lokalisation sollte für wahre Interaktoren Filtern verwendet werden. Dennoch ergeben sich die Mehrheit der Fehlalarme durch unspezifische Bindung zwischen Proteinen und Agarose Harze. Einführung einer zweiten Reinigungsstufe, wie oben beschrieben, bietet die beste Lösung für das Problem, geht jedoch auf Kosten der Zeit und Durchsatz. Darüber hinaus können schwächere Interaktion verloren gehen, da das Protokoll verlängert. Ein weiterer Nachteil von AP ist, dass trotz der umfassenden bereitgestellten Informationen über die Interaktom an ein Zielprotein, Unterscheidung zwischen direkten und indirekten Ziele des eifrigen Proteins unmöglich. Gezielte Bimolekulare Ansätze sind notwendig, um Interaktionen zu bestätigen.
AP in Verbindung mit MS-basierte Metabolomik wurde verwendet, um Proteinkomplexe in S. Cerevisiae12. zu studieren Dieser Arbeit, zusammen mit unseren früheren Beobachtung13 , dass ähnlich, Lipide, polar und semi-polare Verbindungen isoliert von zellulären Lysates Proteinkomplexe gebunden bleiben vorgesehen konzeptionelle Vorarbeit für die vorgestellten Protokoll. Unser Protokoll zeichnet sich durch drei einzigartige Punkte: (i) im Gegensatz zu der Hefe arbeiten12, es zeigt, dass AP geeignet für das Abrufen von nicht nur wasserabweisend, aber auch hydrophile Protein Liganden. (Ii) durch die Einführung eines drei-in-One-Extraktion-Protokolls, ist eine einzelne AP einsetzbar, Proteinen und Metaboliten Interaktoren des Proteins Köder zu studieren. (Iii) Wir haben das Protokoll zur Pflanzenzellen angepasst.
Zukünftige Bemühungen konzentrieren sich auf einen neuartige Tandem-Tag mit zwei unabhängigen Protease-spaltstellen erstellen. Wir würden auch gerne Eignung des Protokolls zu niedrig-Fülle kleine Moleküle wie pflanzlichen Hormonen zu erkunden.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten bitte Prof. Dr. Lothar Willmitzer für sein Engagement im Projekt, produktive Diskussionen und tolle Betreuung anerkennen. Wir sind dankbar, Dr. Daniel Veyel für die Hilfe bei Proteomik-MS-Messungen. Wir schätzen Frau Änne Michaelis, die uns wertvolle technische Hilfe mit LC-MS-Messungen. Darüber hinaus möchten wir Dr. Monika Kosmacz und Dr. Ewelina Sokołowska für ihre Hilfe und Beteiligung an der Arbeit auf dem Originalmanuskript und Weronika Jasińska für technische Unterstützung zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
| 1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
| Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
| NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
| Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
| SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| MTBE | Biosolve | 138906 | |
| Methanol | Biosolve | 136806 | |
| Water | Biosolve | 232106 | |
| Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
| Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
| Formic acid | Biosolve | 69141 | |
| Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
| Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
| Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
| Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
| Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
| Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
| Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
| Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
| Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
| Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
| Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
| Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
| EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
| ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
| High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
| Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
| Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
| MaxQuant | NaN | NaN |
References
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