Protein-protein og protein-metabolit interaktioner er afgørende for alle cellulære funktioner. Heri, beskriver vi en protokol, der tillader parallel analyse af disse interaktioner med et protein valg. Vores protokol var optimeret til plante cellekulturer og kombinerer affinitet rensning med massespektrometri-baseret protein og metabolitten påvisning.
Cellulære processer er reguleret af vekselvirkninger mellem biologiske molekyler som proteiner, metabolitter og nukleinsyrer. Mens undersøgelsen af protein-protein interaktioner (PPI) er ingen nyhed, udgør eksperimentelle metoder med henblik på at karakterisere endogene protein-metabolit interaktioner (PMI) en temmelig seneste udvikling. Heri, præsenterer vi en protokol, der giver mulighed for samtidige karakterisering af PPI og PMI en protein valg, omtales som agn. Vores protokol var optimeret til Arabidopsis celle kulturer og kombinerer affinitet rensning (AP) med massespektrometri (MS)-baseret protein og metabolitten afsløring. Kort sagt, er gensplejsede Arabidopsis linjer, udtrykker agn protein smeltet til en affinitet tag, først mængden for at opnå en native cellulære ekstrakt. Anti-tag antistoffer bruges til at trække ned protein og metabolitten partnere agn protein. De affinitet-renset komplekser er udvundet ved hjælp af en et-trins methyl tert-butyl ether (MTBE) / methanol/vand metode. Mens metabolitter adskille i enten den polar eller den hydrofobe fase, kan proteiner findes i toerstoffet. Både metabolitter og proteiner er derefter analyseret af ultra-performance liquid chromatography-massespektrometri (UPLC-MS eller UPLC-MS/MS). Tom-vektor (EV) kontrol linjer er brugt til at udelukke falske positiver. Den største fordel ved vores protokol er, at det muliggør identifikation af protein og metabolitten partnere en target protein parallelt i nær-fysiologiske tilstande (cellulære lysate). Metoden præsenteres er enkel, hurtig og nemt kan tilpasses til biologiske systemer end plante cellekulturer.
Metoden beskrevet her sigter identifikation af metabolitten og protein partnere et protein valg i i nærheden af –in vivo cellulære lysate betingelser. Det er blevet spekuleret, at mange flere metabolitter end karakteriseret i dag har en vigtig regulativfunktionen1. Metabolitter kan fungere som biologiske parametre, ændre aktivitet, funktionalitet og/eller lokalisering af deres receptor proteiner2,3,4. I det sidste årti blevet flere gennembrud metoder, muliggør identifikation af PMI i vivo eller i nærheden af –in vivo forhold, udviklede5. Tilgængelige tilgange kan opdeles i to grupper. Den første gruppe består af teknikker, der starter med en kendt-metabolit agn for at fælde roman protein partnere. Metoder omfatter affinitet kromatografi6, drug affinitet lydhør target-stabilitet assay7, kemo-proteomics8og termisk proteomet profilering9. Den anden gruppe består af en enkelt metode, der starter med et kendt protein for at identificere små-molekyle ligander10,11.
AP kombineret med MS-baserede lipidomics blev brugt til at analysere protein-lipid komplekser i Saccharomyces cerevisiae12. Som udgangspunkt, forfatterne brugt gærstammer udtrykker 21 enzymer involveret i ergosterol biosyntese og 103 kinaser smeltet til en tandem-affinitet rensning (TAP) tag. 70% af enzymerne og 20% af kinaser fandtes for at binde forskellige hydrofobe ligander, kaste lys ind i indviklede protein-lipid interaktion netværk.
Tidligere kunne vi vise, at tilsvarende til lipider, polar og semi-polære forbindelser også være bundet til proteinkomplekser isoleret fra de cellulære lysates13. Baseret på disse resultater, besluttede vi at optimere AP metode offentliggjort tidligere10,11 for planteceller og hydrofile forbindelser14. Til dette formål brugte vi TAP vektorer beskrevet af Van Leene et al. 2010, med held anvendt i anlægget PPI undersøgelser15. For at forkorte den tid, der kræves for at opnå transgene linjer, besluttede vi på Arabidopsis cellekulturer. Vi ansat en et-trins methyl- tert-butylether, (MTBE) / methanol/vand ekstraktion metode, giver karakterisering af proteiner (pellet), lipider (organiske fase) og hydrofile metabolitter (vandfasen)16 i en enkelt affinitet-rensning eksperiment. EV kontrol linjer blev indført for at udelukke falske positiver, fx proteiner bindende at koden alene. Som proof of concept vi markeret tre (af de fem) nucleoside ud kinaser præsentere i Arabidopsis genom (NDPK1-NDPK3). Blandt andre fund, kunne vi vise, at NDPK1 interagerer med glutathion S-transferase og glutathion. Vi kan derfor vise sig, at NDPK1 er udsat for glutathionylation14.
Sammenfattende præsenteres protokollen er et vigtigt redskab til karakterisering af protein-protein og protein-små-molekyle interaktion netværk og udgør et stort fremskridt over eksisterende metoder.
Præsenteres protokollen tillader parallelle identifikation af PP og PM komplekser af en target protein. Fra kloning til endelige resultater, kan forsøget gennemføres på så lidt som 8-12 uger. Komplet AP tager omkring 4-6 h for et sæt af prøver, 12-24, rendering vores protokol egnet til midten overførselshastighed analyse.
Protokollen, trods samlede ligetil, har en række vigtige skridt. (i) tilstrækkelig mængde af input protein og affinitet perler er afgørende for at nå frem til en dynamisk række metabolit påvisning. Effektiv celle lysis er derfor et afgørende skridt i proceduren. Dårlig protein udbyttet kan være en følge af utilstrækkelig pulverisering af materialet eller suboptimal lysis-buffer/materielle forhold. (ii) omhu bør tages, brugte reagenser er MS-venlige. Stærke rengøringsmidler, glycerol eller store mængder salt bør undgås, da de forstyrrer MS påvisning. (iii) Agarosen perler bør ikke være over tørrede under vask trin, og når du bruger et vakuum manifold er det vigtigt at anvende en langsom strømningshastighed uden at ødelægge perlerne eller påvirke komplekse stabilitet.
Der er nogle vigtige mulige ændringer i præsenteres protokollen: (i) vi bruger konstitutiv CaMV35S initiativtageren til at maksimere mængden af agn protein. Overekspression, kan mens meget nyttig, have alvorlige virkninger på celle homøostase28 og føre til dannelsen af fysiologisk irrelevant interaktioner. Udtryk for mærket proteiner ved hjælp af indfødte initiativtagere og hvor muligt i et tab af funktion baggrund skønnes superior til hentning af sande biologiske interactors. For proteiner normalt ikke til udtryk i anlægget cellekulturer, en plante baggrund kan vise sig nødvendigt at identificere relevante interactors. (ii) når du arbejder med Membranproteiner, skal lysisbuffer suppleres med en MS-kompatible vaskemiddel. (iii) indførelse af en anden affinitet-rensning fase kunne forbedre falske-positiver til sand-positiver forholdet og fjerne behovet for EV kontrol29. En roman tandem tag med to uafhængige protease-kavalergang websteder præsenterer et attraktivt alternativ til trinnet størrelse-udelukkelse kromatografi tilføjet af Maeda et al. 201411, som er både besværligt og tidskrævende.
Den mest alvorlige ulempe af AP er den høje sats af falske positiver. Årsagerne er talrige. Konstituerende overekspression blev allerede nævnt. En anden kilde til fysiologisk irrelevant interaktioner, er medmindre arbejder med isolerede organeller, forberedelsen af hele-cellelysater der indeholder blandinger af proteiner og metabolitter fra forskellige subcellulært rum. Subcellulært lokalisering bør bruges til at filtrere for sande interactors. Ikke desto mindre, skyldes størstedelen af falske positiver uspecifik bindingen mellem proteiner og Agarosen harpiks. Indførelsen af en anden rensning trin, som beskrevet ovenfor, tilbyder den bedste løsning på problemet, men kommer på bekostning af tid og overførselshastighed. Derudover kan svagere interaktion gå tabt, som protokollen forlænger. En anden advarsel af AP er, at trods de omfattende oplysninger det giver om interactome af en target protein, skelne mellem direkte og indirekte mål for den madding protein er umuligt. Målrettet bimolecular tilgange er nødvendige for at bekræfte interaktioner.
AP kombineret med MS-baseret metabolomics blev brugt til at studere proteinkomplekser i S. cerevisiae12. Dette arbejde, sammen med vores tidligere observation13 , ligeledes til lipider, polar og semi-polære forbindelser forbliver bundet til proteinkomplekser isoleret fra cellulære lysates, fastsatte præsenteres protokollen begrebsmæssige grundlag. Vores protokol er karakteriseret ved tre unikke punkter: (i) i modsætning til gæren arbejde12, det viser, at AP er egnet til hentning af ikke kun hydrofobe men også hydrofile protein ligander. (ii) ved at indføre en tre-i-én udvinding protokol, kan en enkelt AP bruges til at studere proteiner og metabolitten interactors agn protein. (iii) vi tilpasset protokol for at plante celler.
Fremtidige indsats vil fokusere på at skabe en roman tandem tag med to uafhængige protease-kavalergang websteder. Vi vil også gerne udforske egnetheden af protokollen til lav-overflod små molekyler såsom plantehormoner.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne venligst anerkende Prof. Dr. Lothar Willmitzer for hans engagement i projektet, produktive diskussioner og store tilsyn. Vi er taknemmelige for Dr. Daniel Veyel for at hjælpe med proteom MS målinger. Vi sætter pris på fru Änne Michaelis der har givet os uvurderlig teknisk hjælp med LC-MS målinger. Desuden vil vi gerne takke Dr. Monika Kosmacz og Dr. Ewelina Sokołowska for deres hjælp og engagement i arbejdet på det originale manuskript og Weronika Jasińska for teknisk support.
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |