Les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite sont indispensables pour toutes les fonctions cellulaires. Ici, les auteurs décrivent un protocole qui permet une analyse parallèle de ces interactions avec une protéine de choix. Notre protocole a été optimisé pour les cultures de cellules végétales et combine purification d’affinité avec la protéine basé sur la spectrométrie de masse et de la détection de métabolite.
Les processus cellulaires sont réglementés par des interactions entre molécules biologiques telles que des protéines, des métabolites et des acides nucléiques. Alors que l’étude des interactions protéine-protéine (PPI) n’est aucune nouveauté, approches expérimentales visant à caractériser les interactions protéine-métabolite endogène (PMI) constituent un développement assez récent. Ici, nous présentons un protocole qui permet la caractérisation simultanée de l’IPP et PMI d’une protéine de choix, dénommé comme appât. Notre protocole a été optimisé pour des Arabidopsis cell cultures et combine la purification d’affinité (AP) avec la spectrométrie de masse (MS)-fonction détection de protéines et de métabolites. En bref, les lignées transgéniques d’Arabidopsis, exprimant la protéine appât fusionnée à une balise d’affinité, sont tout d’abord lysées pour obtenir un extrait cellulaire natif. Anticorps anti-Tags servent à tirer vers le bas des partenaires protéiques et métabolite de la protéine de l’appât. Les complexes purifiés par affinité sont extraites à l’aide d’une seule étape méthyl tert-butyl éther (MTBE) / méthanol/eau méthode. Alors que les métabolites séparent dans le polaire ou la phase hydrophobe, protéines se trouvent dans le culot. Les métabolites et les protéines sont ensuite analysés par spectrométrie de masse par chromatographie liquide ultra performance (UPLC-MS ou UPLC-MS/MS). Lignes de contrôle vide-vector (EV) sont utilisés pour exclure des faux positifs. L’avantage majeur de notre protocole est qu’il permet d’identifier des partenaires protéiques et métabolite d’une protéine cible en parallèle dans des conditions physiologiques près (lysat cellulaire). La méthode présentée est simple, rapide et peut être facilement adaptée aux systèmes biologiques autres que les cultures de cellules végétales.
La méthode décrite ici vise à l’identification des partenaires métabolite et protéine d’une protéine de choix dans des conditions de lysat cellulaire prochein vivo . Il a été spéculé que nombreux métabolites plus que caractérise aujourd’hui ont une importante fonction de réglementation1. Métabolites peuvent agir comme des auxiliaires biologiques, modification de l’activité, fonctionnalité, et/ou la localisation de leurs récepteurs protéines2,3,4. Dans la dernière décennie, plusieurs méthodes de percée, ce qui permet l’identification des PMI en vivo ou dans des conditions quasiin vivo , ont été développés5. Les approches disponibles peuvent être séparés en deux groupes. Le premier groupe comprend les techniques qui commencent avec un appât connu-métabolite afin d’emprisonner les partenaires de la nouvelle protéine. Méthodes incluent affinité chromatographie6drogues affinité cible sensible-stabilité dosage7, chimio-protéomique8et thermique proteome profilage9. Le deuxième groupe est constitué d’une seule méthode qui commence par une protéine connue afin d’identifier des ligands de petit-molécule10,11.
AP couplé avec lipidomique axée sur le MS a été utilisé pour analyser les complexes protéines-lipides dans Saccharomyces cerevisiae12. Comme point de départ, les auteurs ont utilisé des souches de levures exprimant 21 enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’ergostérol et 103 kinases fusionnée à une purification d’affinité en tandem de tag (TAP). 70 % des enzymes et 20 % des kinases trouvées pour lier les différents ligands hydrophobes, éclairant dans le réseau d’interactions complexes protéines-lipides.
Auparavant, nous pourrions démontrer que, de la même façon aux lipides, composés polaires et semi polaires aussi restent liés à des complexes de protéine isolées de lysats cellulaires13. Se fondant sur ces constatations, nous avons décidé d’optimiser l’AP méthode publiée précédemment10,11 pour cellules végétales et des composés hydrophiles14. À cet effet, nous avons utilisé des vecteurs robinet décrites par Van lhonneux et al. 2010, utilisée avec succès dans l’usine PPI études15. Pour raccourcir le temps nécessaire pour obtenir des lignées transgéniques, nous avons décidé sur des cultures cellulaires Arabidopsis. Nous avons utilisé un one-step méthyl tert-butyl éther, (MTBE) / méthanol/eau méthode d’extraction, ce qui permet la caractérisation des protéines (pellet), lipides (phase organique) et métabolites hydrophile (phase aqueuse)16 dans une seule expérience de purification d’affinité. Les lignes de contrôle EV ont été introduites afin d’exclure des faux positifs, par exemple les protéines liant à la balise seule. Comme preuve de concept, nous avons marqué trois (sur cinq) kinase de diphosphate de nucléoside présents dans le génome d’Arabidopsis (NDPK1-NDPK3). Entre autres conclusions, nous pourrions démontrer que NDPK1 interagit avec le glutathion S-transférase et glutathion. Par conséquent, nous pourrions prouver que NDPK1 est soumis à glutathionylation14.
Pour résumer, le protocole présenté est un outil important pour caractériser les protéines et les réseaux d’interaction de protéine-petit-molécule et constitue une avancée majeure par rapport aux méthodes existantes.
Le protocole présenté permet une identification parallèle de PP et PM complexes d’une protéine cible. Du clonage aux résultats définitifs, l’expérience peut être complétée en aussi peu que 8 à 12 semaines. AP complète prend environ 4 à 6 h pour une série d’échantillons de 12 à 24, rendant notre protocole d’analyse de débit moyen.
Le protocole, tout en étant simple dans l’ensemble, a un certain nombre d’étapes critiques. (i) suffisamment de protéines d’entrée et des billes d’affinité est cruciale pour atteindre une plage dynamique de détection de métabolite. Lyse cellulaire efficace est donc une étape cruciale dans la procédure. Protéine pauvres rendements peuvent être une conséquence de pulvérisation insuffisante du matériel ou du ratio de lyse-tampon/matériel sous-optimale. (ii) il faut que les réactifs utilisés sont respectueux de MS. Détergents forts, glycérol ou des quantités excessives de sel doivent être évitées car ils interfèrent avec la détection de MS. (iii) l’agar-agar ne devrait pas être trop secs pendant les étapes de lavage, et lorsque vous utilisez une tubulure de vide, il est important d’appliquer un taux de débit lent afin de ne pas pour détruire les billes ou affecter la stabilité complexe.
Il y a quelques importantes modifications possibles au protocole présenté : (i) nous permet de maximiser la quantité de protéine appât le promoteur constitutif de CaMV35S. Surexpression, bien que très utile, peut avoir de graves effets sur la cellule homéostasie28 et conduisent à la formation des interactions physiologiquement non pertinentes. Expression de protéines étiquetées à l’aide de promoteurs natifs et où possible dans un contexte de perte de fonction est considéré comme supérieur afin de récupérer le vrais Interactiens biologiques. Pour les protéines normalement ne pas exprimés dans les cultures de cellules végétales, un fond de plantes peut-être s’avérer nécessaire pour identifier les Interactiens pertinentes. (ii) lorsque vous travaillez avec des protéines membranaires, le tampon de lyse doit être complété par un détergent MS-compatible. (iii) l’introduction d’une deuxième étape de purification d’affinité pourrait améliorer le nombre de faux positifs au ratio de true-positifs et éliminent la nécessité de contrôles de EV29. Une balise de roman en tandem avec deux sites de clivage protéase indépendant présente une alternative intéressante à l’étape de chromatographie liquide d’exclusion ajoutée par Maeda et al 201411, qui est laborieuse et chronophage.
Le plus grave inconvénient de l’AP est le taux élevé de faux positifs. Les raisons sont nombreuses. Surexpression constitutive a été déjà mentionnée. Une autre source d’interactions physiologiquement non pertinentes, à moins que travaillant avec des organites isolés, est préparation de mélanges de protéines et de métabolites des différents compartiments subcellulaires des lysats de cellules entières. Localisation sous-cellulaire devrait être utilisée pour filtrer les Interactiens vrais. Néanmoins, la majorité des faux positifs proviennent de liaison non-spécifique entre les protéines et les résines d’agarose. Introduction d’une deuxième étape de purification, comme décrit plus haut, offre la meilleure solution au problème, vient toutefois au détriment du temps et débit. En outre, plus faible interaction peut être perdue car le protocole s’allonge. Une autre restriction d’AP, c’est que, malgré les informations complètes qu’il fournit sur l’interactome d’une protéine cible, différencier les cibles directes et indirectes de la protéine appâtée est impossible. Les approches bimoléculaires ciblées sont nécessaires pour confirmer les interactions.
AP couplé avec métabolomique basée sur MS a permis d’étudier les protéines complexes dans S. cerevisiae12. Ce travail, ainsi que de notre précédente observation13 , que, de même aux lipides, les composés polaires et semi polaires restent liés à des complexes de protéine isolées de lysats cellulaires, a fourni les bases conceptuelles pour le protocole présenté. Notre protocole est caractérisée par trois points uniques : (i) en revanche à la levure travail12, il montre que l’AP est approprié pour récupérer non seulement les ligands protéine hydrophobe mais aussi hydrophile. (ii) en introduisant un protocole d’extraction de trois-en-un, un seul point d’accès peut servir à étudier les Interactiens de protéine et métabolite de la protéine de l’appât. (iii) nous avons adapté le protocole de cellules végétales.
Futurs efforts porteront sur la création d’une balise de roman en tandem avec deux sites de clivage protéase indépendant. Nous tenons également à explorer les qualités du protocole à la faible abondance de petites molécules telles que des hormones végétales.
The authors have nothing to disclose.
Nous aimerions bien vouloir reconnaître Prof. Dr. Lothar Willmitzer pour son implication dans le projet, des discussions productives et grande surveillance. Nous sommes reconnaissants à m. Daniel Veyel pour aider avec les mesures de MS de protéomique. Nous remercions Mme Änne Michaelis qui nous a fourni une aide technique précieuse avec mesures LC-MS. En outre, nous tenons à remercier le Dr. Monika Kosmacz et Dr. Ewelina Sokołowska pour leur aide et leur implication dans le travail sur le manuscrit original et à Weronika Jasińska pour le support technique.
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |