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Biochemistry

2 में 1: प्रोटीन और प्रोटीन-Metabolite परिसरों के समानांतर विश्लेषण के लिए एक कदम संबध शुद्धि

Published: August 6, 2018 doi: 10.3791/57720
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटीन प्रोटीन और प्रोटीन metabolite बातचीत सभी सेलुलर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस के साथ साथ, हम एक प्रोटोकॉल है कि पसंद की एक प्रोटीन के साथ इन बातचीत के समानांतर विश्लेषण की अनुमति देता है का वर्णन । हमारे प्रोटोकॉल संयंत्र सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया था और जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटीन और metabolite का पता लगाने के साथ समानता शुद्धि को जोड़ती है ।

Abstract

सेलुलर प्रक्रियाओं ऐसे प्रोटीन, चयापचयों, और न्यूक्लिक एसिड के रूप में जैविक अणुओं के बीच बातचीत द्वारा विनियमित रहे हैं । हालांकि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) की जांच कोई नवीनता नहीं है, अंतर्जात प्रोटीन-metabolite इंटरैक्शन (पीएमआई) को चिह्नित करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का गठन एक जगह हाल ही में विकास है । इस के साथ साथ, हम एक प्रोटोकॉल है कि पीपीआई और पसंद की एक प्रोटीन के पीएमआई के एक साथ लक्षण वर्णन, चारा के रूप में निर्दिष्ट की अनुमति देता है वर्तमान । हमारे प्रोटोकॉल Arabidopsis सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित और जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ समानता शुद्धि (एपी) को जोड़ती है-प्रोटीन और metabolite का पता लगाने आधारित है । संक्षेप में, ट्रांसजेनिक Arabidopsis लाइनों, एक समानता टैग करने के लिए जुड़े चारा प्रोटीन व्यक्त, पहली लीजड ड एक देशी सेलुलर निकालने प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं । विरोधी टैग एंटीबॉडी को नीचे प्रोटीन और चारा प्रोटीन के metabolite भागीदारों खींचने के लिए उपयोग किया जाता है । संबध-शुद्धि परिसरों एक एक कदम मिथाइल tert-butyl ईथर (MTBE)/methanol/water विधि का उपयोग कर निकाले जाते हैं । Whilst चयापचयों या तो ध्रुवीय या hydrophobic चरण में अलग, प्रोटीन गोली में पाया जा सकता है । दोनों चयापचयों और प्रोटीन तो अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण कर रहे है (UPLC-ms या UPLC-ms/ खाली वेक्टर (EV) नियंत्रण लाइनों झूठी सकारात्मक बाहर करने के लिए उपयोग किया जाता है । हमारे प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ यह है कि यह प्रोटीन और निकट शारीरिक स्थितियों (सेलुलर lysate) में समानांतर में एक लक्ष्य प्रोटीन की metabolite भागीदारों की पहचान में सक्षम बनाता है । प्रस्तुत विधि सीधा है, जल्दी है, और आसानी से जैविक संयंत्र सेल संस्कृतियों के अलावा अंय प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

यहां वर्णित विधि के पास मेंvivo सेलुलर lysate शर्तों में पसंद की एक प्रोटीन की metabolite और प्रोटीन भागीदारों की पहचान करने के लिए करना है । यह अटकलें लगाई गई है कि आज की तुलना में कई और अधिक चयापचयों एक महत्वपूर्ण विनियामक समारोह1है । चयापचयों जैविक स्विच के रूप में कार्य कर सकते हैं, गतिविधि, कार्यक्षमता को बदलने, और/या उनके रिसेप्टर प्रोटीन के स्थानीयकरण2,3,4. पिछले दशक में कई सफलता के तरीके, vivo में या निकट मेंvivo स्थितियों में पीएमआई की पहचान को सक्षम करने,5विकसित किया गया है । उपलब्ध दृष्टिकोण दो समूहों में अलग किया जा सकता है । पहले समूह तकनीक है कि एक ज्ञात metabolite चारा के साथ शुरू करने के लिए जाल उपंयास प्रोटीन भागीदारों में शामिल हैं । तरीकों संबध क्रोमैटोग्राफी6, दवा संबध उत्तरदायी लक्ष्य-स्थिरता परख7, chemo-प्रोटियोमिक्8, और थर्मल proteome9profiling शामिल हैं । दूसरे समूह के एक एकल तरीका है कि एक ज्ञात प्रोटीन के साथ शुरू होता है क्रम में छोटे अणु लाइगैंडों10,11की पहचान के होते हैं ।

एपी एमएस आधारित lipidomics के साथ मिलकर Saccharomyces cerevisiae12में प्रोटीन लिपिड परिसरों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, लेखक खमीर ergosterol में शामिल 21 एंजाइमों व्यक्त उपभेदों का इस्तेमाल किया और १०३ kinases एक मिलकर-संबध शुद्धि (नल) टैग से जुड़े । एंजाइमों और kinases के 20% के ७०% विभिंन hydrophobic लाइगैंडों बांध पाया गया, जटिल प्रोटीन लिपिड संपर्क नेटवर्क में प्रकाश बहा ।

पहले, हम प्रदर्शित कर सकते है कि, इसी तरह लिपिड, ध्रुवीय और अर्द्ध ध्रुवीय यौगिकों भी प्रोटीन lysates13से पृथक परिसरों के लिए बाध्य रहना । इन निष्कर्षों के आधार पर, हम पहले10,संयंत्र कोशिकाओं और हाइड्रोफिलिक यौगिकों14के लिए11 प्रकाशित एपी विधि को अनुकूलित करने का फैसला किया । इस प्रयोजन के लिए, हम वान Leene एट अल. २०१० द्वारा वर्णित नल वैक्टर इस्तेमाल किया, सफलतापूर्वक संयंत्र पीपीआई अध्ययन15में इस्तेमाल किया । ट्रांसजेनिक लाइनों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय को छोटा करने के लिए, हम Arabidopsis सेल संस्कृतियों पर फैसला किया । हम एक एक कदम मिथाइल tert-butyl ईथर कार्यरत हैं, (MTBE)/methanol/water निष्कर्षण विधि, प्रोटीन (गोली), लिपिड (कार्बनिक चरण), और हाइड्रोफिलिक चयापचयों (जलीय चरण) के लक्षण वर्णन की अनुमति एक एकल में16 अपनत्व-शुद्धि प्रयोग. EV नियंत्रण लाइनें झूठी सकारात्मक बाहर करने के लिए पेश किया गया, जैसे अकेले टैग करने के लिए बाध्यकारी प्रोटीन । अवधारणा के सबूत के रूप में हम तीन टैग (पांच के) nucleoside diphosphate Arabidopsis जीनोम (NDPK1-NDPK3) में मौजूद kinases । अंय निष्कर्षों के अलावा, हम प्रदर्शन कर सकते है कि NDPK1 glutathione एसके साथ बातचीत-ट्रांस्फ़्रेज़ और glutathione । नतीजतन हम साबित कर सकते है कि NDPK114glutathionylation के अधीन है ।

योग करने के लिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल निस्र्पक प्रोटीन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है प्रोटीन और प्रोटीन छोटे अणु संपर्क नेटवर्क और मौजूदा तरीकों पर एक प्रमुख अग्रिम का गठन किया ।

Protocol

क्लोनिंग, परिवर्तन, चयन, और विकास की स्थिति सहित ट्रांसजेनिक Arabidopsis सेल संस्कृति लाइनों की तैयारी17में पाया जा सकता है । ध्यान दें कि EV नियंत्रण लाइनों को झूठी सकारात्मक के लिए सही करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं । प्रयोग करने से पहले, पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा चारा प्रोटीन की अधिकता की पुष्टि, जी के खिलाफ आईजीजी एंटीबॉडी का उपयोग कर-प्रोटीन मिलकर संबध टैग का हिस्सा । यह संयंत्र सेल संस्कृति सामग्री से विकास मीडिया को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

1. संयंत्र सेल सामग्री की तैयारी प्रयोग करने से पहले

  1. बढ़ती एक PSB-L a. थालियाना सेल संस्कृति रेखा18ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त ।
    1. MSMO मध्यम तैयार करें, जिसमें ४.४३ g/l MSMO को 30 ग्राम/l सुक्रोज के साथ मिलाया जाता है । 1 M KOH के साथ ५.७ करने के लिए बफ़र का पीएच समायोजित करें और समाधान आटोक्लेव । प्रयोग करने से पहले, ०.५ मिलीग्राम/l α-naphthaleneacetic एसिड, ०.०५ mg/l kinetin और ५० μg/एमएल कनमीसिन के साथ मध्यम पूरक ।
    2. MSMO माध्यम के ५० मिलीलीटर में बदल संयंत्र सेल संस्कृतियों की खेती एक १०० मिलीलीटर कुप्पी में कोमल आंदोलन (१३० rpm) के साथ एक कक्षीय मंच शेखर पर । 20 डिग्री सेल्सियस और प्रकाश की तीव्रता पर एक संस्कृति कमरे में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए ८० μmol एम-2 एस-1के बराबर है ।
    3. ताजा मीडिया में उपसंस्कृति कोशिकाओं हर 7 दिन, उंहें 1:10 कमजोर ।
  2. फिल्टर के रूप में एक नायलॉन जाल का उपयोग कर, एक वैक्यूम पंप के साथ संयुक्त एक गिलास कीप का उपयोग लघुगणकीय विकास के चरण में कोशिकाओं को इकट्ठा । एल्यूमीनियम पंनी में घुसपैठ लपेटो और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज ।
    सावधानी: याद रखें कि लिक्विड नाइट्रोजन बेहद ठंडा होता है । गलत हैंडलिंग जलता पैदा कर सकता है । उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण, थर्मल अछूता दस्ताने, सुरक्षात्मक चश्मा, और एक प्रयोगशाला कोट सहित पहनते हैं ।

2. ठोकर प्रोटोकॉल

नोट: निम्न चरण माएदा एट अल. २०१४11 और वान Leene एट अल. २०११17से अनुकूलित है.

  1. Homogenize काटा और जमे हुए संयंत्र सेल संस्कृति एक मिक्सर मिल का उपयोग कर सामग्री (20 हर्ट्ज पर 2 मिनट) या मोर्टार और मूसल ठीक पाउडर प्राप्त करने के लिए । जमीन सामग्री के Aliquot 3 जी (लगभग ९० मिलीग्राम कुल प्रोटीन के) प्रति नमूना । तरल नाइट्रोजन पूर्व ठंडा उपकरणों का उपयोग करके इस कदम के दौरान नमूने के गल से बचें ।
    नोट: स्टोर जमीन संयंत्र सामग्री में ५० मिलीलीटर ट्यूब में-८० डिग्री सेल्सियस एक एपी प्रक्रिया की शुरुआत करने के लिए ।
  2. Triturate के साथ एक तरल नाइट्रोजन-ठंडा मोर्टार में नमूना 3 मिलीलीटर बर्फ ठंडा lysis बफर (०.०२५ एम Tris – एचसीएल पीएच ७.५; ०.५ मी NaCl; १.५ मिमी MgCl2; ०.५ मिमी डीटीटी; 1 मिमी NaF; 1 मिमी न3VO4; 100x पतला वाणिज्यिक छेड़ो अवरोधक कॉकटेल; 1 मिमी PMSF) तक सामग्री गल जाती है. एक बार नमूना गल जाता है, तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ना ।
    नोट: lysis बफ़र ताजा तैयार करें । इस चरण में रिक्त नमूने पेश करना । डिटर्जेंट की सिफारिश के रूप में वे एमएस का पता लगाने में समस्या पैदा कर सकता है नहीं कर रहे हैं ।
  3. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए, 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में सामग्री विभाजित और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०,८१७ x g पर केंद्रापसारक । एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में स्पष्ट lysate के 3 मिलीलीटर ले लीजिए ।
  4. केंद्रापसारक कदम के दौरान, equilibrate आईजीजी-Sepharose मोती । Aliquot १०० µ नमूना प्रति मोतियों की एल और उंहें lysis बफर के 1 मिलीलीटर के साथ धो लो । भंवर मोतियों और फ्लैश-स्पिन resuspend करने के लिए । lysis बफ़र छोड़ें और चरण दोहराएं दो बार । lysis बफर के ४०० µ एल में मोती resuspend ।
  5. एकत्र संयंत्र lysate के लिए मोती जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर मिश्रण गर्मी ।
  6. एक Luer के माध्यम से संयुक्त सिरिंज में मिश्रण स्थानांतरण-फिल्टर ताकना आकार के साथ एक स्पिन कॉलम के साथ ताला टोपी ३५ µm. के माध्यम से lysate पारित करने के लिए दबाव लागू होते हैं । संलग्न परिसरों के साथ मोती फिल्टर पर रहेगा, जबकि lysate के माध्यम से जाना जाएगा ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक वैक्यूम कई गुना प्रणाली का उपयोग करें । कोमल दबाव को लागू करने के लिए निश्चित करें ताकि मोतियों को नुकसान न पहुंचे ।
  7. धोने बफर के 10 मिलीलीटर (०.०२५ एम Tris-एचसीएल पीएच ७.५; ०.५ m NaCl), और फिर के साथ 1 मिलीलीटर के रेफरेंस बफर (10 mM Tris – hcl ph ७.५; १५० mm NaCl; ०.५ mm EDTA; 1000x पतला E64 और 1 mm PMSF) के साथ पहली बार में मोतियों को धोएं । एक कॉलम या निर्वात कई गुना प्रणाली से जुड़ी सिरिंज का उपयोग कर धुलाई प्रदर्शन ।
    नोट: जब एक निर्वात कई गुना प्रणाली का उपयोग कर कोमल दबाव इतना के रूप में नहीं मोतियों को नुकसान लागू करने के लिए कुछ कर ।
  8. एक तंबाकू खोदना वायरस (AcTEV) की एक उंनत संस्करण के ५० यू युक्त रेफरेंस बफर के ४०० µ एल के साथ मशीन मोती 16 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १,००० rpm पर तालिका के बरतन का उपयोग करें ।
    नोट: रेफरेंस बफ़र जोड़ने के लिए नीचे स्तंभ को बंद करने के लिए किसी प्लग का उपयोग करना याद रखें ।
  9. कॉलम में एंजाइम के एक अतिरिक्त भाग (५० यू) जोड़ें और उसी के तहत अगले 30 मिनट के लिए मिश्रण गर्मी, ऊपर वर्णित है, शर्तों ।
  10. एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में या तो (1 मिनट, २०,८१७ एक्स जी) द्वारा या निर्वात कई गुना से eluate लीजिए । शेष परिसरों को निकालने के लिए, रेफरेंस बफर के २०० µ l का उपयोग करते हुए एक अतिरिक्त रेफरेंस स्टेप का परिचय दें ।
    नोट: पर नमूना स्टोर-20 ° c या – ८० ° c, या तुरंत प्रोटीन और metabolite निष्कर्षण कदम के साथ आगे बढ़ना. गल बर्फ पर जमे हुए नमूने ।

3. पश्चिमी दाग विश्लेषण

  1. एकत्र eluate उपयोग में चारा प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए प्रोटीन के 10 µ एल-metabolite युक्त eluate एसडीएस प्रदर्शन-पृष्ठ और पश्चिमी दाग विश्लेषण । के लिए ब्याज की प्रोटीन की पहचान, streptavidin-बाध्यकारी प्रोटीन के खिलाफ माउस प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें (1:200), टेव को छेड़ो दरार के बाद शेष टैग के एक भाग के रूप में वान Leene एट अल २०११17में वर्णित है । अगले, माध्यमिक बकरी विरोधी माउस एचआरपी के साथ युग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करें ।

4. Metabolite और प्रोटीन निष्कर्षण

नोट: इस प्रोटोकॉल Giavalisco एट अल. २०११16से अनुकूलित है ।

नोट: इस कदम के बाद से UPLC-एमएस-ग्रेड समाधान का उपयोग करें ।

  1. एकत्र eluate के लिए मिथाइल tert-butyl ईथर (MTBE)/methanol/water विलायक (3:1:1) की 1 मिलीलीटर जोड़ें और उलटा करके नमूना मिश्रण । सुनिश्चित करें कि विलायक ठंडा है-20 ° c निष्कर्षण कदम से पहले ।
    सावधानी: MTBE और मेथनॉल हानिकारक पदार्थ हैं । धुएं डाकू के तहत निष्कर्षण कदम प्रदर्शन और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं, जैसे, दस्ताने ।
  2. ०.४ मिलीलीटर मेथनॉल जोड़ें: पानी 1:3 प्रत्येक नमूने के लिए समाधान और उलटा द्वारा नमूना की सामग्री को मिला ।
    नोट: मेथनॉल के साथ मिश्रण के पूरकता: चरण जुदाई में पानी के समाधान के परिणाम. ऊपरी चरण लिपिड शामिल हैं, निचले चरण ध्रुवीय और अर्द्ध ध्रुवीय चयापचयों शामिल हैं, और प्रोटीन गोली में पाया जा सकता है ।
  3. अलग चरणों के लिए, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए २०,८१७ x g पर नमूना केंद्रापसारक, तो लिपिड माप के लिए ऊपरी चरण (इस प्रोटोकॉल में नहीं किया) 1 मिलीलीटर मात्रा क्षमता के साथ एक मैनुअल तरल हैंडलिंग पिपेट का उपयोग कर इकट्ठा ।
  4. मेथनॉल के ०.२ मिलीलीटर जोड़ें और उलटा करके मिश्रण ।
  5. आरटी में 2 मिनट के लिए २०,८१७ x जी पर नमूना केंद्रापसारक, तो metabolite माप के लिए ध्रुवीय चरण (ध्रुवीय और अर्द्ध ध्रुवीय यौगिकों) इकट्ठा । को प्रोटीन गोली परेशान से बचने के लिए, चारों ओर छोड़ तरल चरण के ५० µ एल ट्यूब के तल पर ।
  6. सूखी metabolite माप के लिए एक केंद्रापसारक वाष्पीकरण में रातोंरात एकत्र नमूनों । से बचें-30-60 मिनट के बाद वाष्पर से नमूनों को हटाने के द्वारा प्रोटीन छर्रों सुखाने ।
    नोट: स्टोर नमूनों पर-20 ° c या-८० ° c, या तुरंत नियंत्रण रेखा के लिए प्रोटीन की तैयारी के साथ आगे बढ़ें – ms/

5. Proteomic विश्लेषण के लिए नमूनों की तैयारी

नोट: यह कदम ऑलसेन एट अल से अनुकूलित है । २००४19 और Trypsin के तकनीकी मैनुअल/Lys-सी मिक्स ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

  1. नमूना के एंजाइमी पाचन प्रदर्शन ।
    चेतावनी: एंजाइमी पाचन और नमूने के लवण के दौरान इस्तेमाल किया सॉल्वैंट्स हानिकारक हैं । धुएं डाकू के तहत काम करते है और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं, जैसे, दस्ताने ।
    1. ताजा तैयार विकार बफर के 30 µ एल में प्रोटीन गोली भंग (४० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट युक्त 2 एम thiourea/6 एम यूरिया, पीएच 8) । बेहतर प्रोटीन घुलनशीलता प्राप्त करने के लिए, एक 15-ंयूनतम sonication चरण निष्पादित करें । जब तक गोली भंग कदम दोहराएं ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०,८१७ x g पर नमूना केंद्रापसारक, तो एक नया microcentrifuge ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण ।
    3. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण ।
    4. आगे के विश्लेषण के लिए, aliquot प्रोटीन के १०० µ जी के बराबर मात्रा और विकार बफर के साथ ४६ µ एल तक नमूना भरें ।
    5. ताजा तैयार कमी बफर के नमूने 2 µ एल में जोड़ें (५० mM एच2ओ में भंग डीटीटी) और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    6. ताजा तैयार alkylation बफर के 2 µ एल के साथ नमूना इलाज (१५० mm ४० mm अमोनियम बिकारबोनिट बफर में भंग iodoacetamide) और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए अंधेरे में मिश्रण गर्मी ।
    7. ४० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट बफर के 30 µ एल के साथ नमूना पतला और LysC/Trypsin मिश्रण के 20 µ एल जोड़ें ।
    8. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 एच की मशीन के बाद ४० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट बफर के ३०० µ एल के साथ नमूना पतला ।
    9. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी के साथ जारी रखें ।
    10. Acidify 10% trifluoroacetic एसिड (TFA) के लगभग 20 µ एल के साथ नमूना पीएच < 2 प्राप्त करने के लिए । एक पीएच पट्टी का उपयोग नमूना पीएच की जाँच करें ।
      नोट: नमूना पर-20 डिग्री सेल्सियस या अगले कदम के लिए आगे बढ़ना स्टोर ।
  2. पचता प्रोटीन को नमक ।
    नोट: अधिमानतः, एक वैक्यूम कई गुना प्रणाली का उपयोग करें । कॉलम के अधिक सुखाने से बचें ।
    1. C18 एसपीई स्तंभ कुल्ला ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ १००% MeOH की 1 मिलीलीटर और फिर ८०% acetonitrile (ACN) ०.१% TFA पानी में पतला युक्त की 1 मिलीलीटर के साथ । का प्रयोग करें, यहां और आगे प्रोटीन में कदम, एक निर्वात कई गुना प्रणाली की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए । कॉलम के अधिक सुखाने से बचें ।
    2. Equilibrate के साथ दो बार धोने से कॉलम को ०.१% TFA के 1 मिलीलीटर पानी में पतला कर दीजिये ।
    3. नमूना स्तंभ पर लोड । ०.१% TFA के अतिरिक्त २०० µ एल के साथ कुल्ला ट्यूब और कॉलम पर समाधान हस्तांतरण । समाधान को स्तंभ के माध्यम से चलाएं ।
    4. स्तंभ को दो बार ०.१% TFA की 1 मिलीलीटर से धोएं ।
  3. Elute के साथ कॉलम से ८०० µ l के ६०% ACN, ०.१% TFA समाधान । एक केंद्रापसारक वाष्पीकरण में एकत्र अंश सूखी, से परहेज अधिक-30 के बाद वाष्पर से नमूनों को हटाने के द्वारा प्रोटीन अंश के सुखाने-60 मिनट.
    नोट: नमूनों पर-20 डिग्री सेल्सियस या – ८० डिग्री सेल्सियस या तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ना । बाद के चरणों में, बर्फ पर नमूने रखें ।

6. माप तैयार प्रोटीन UPLC का उपयोग कर नमूने-ms/

नोट: से पहले proteomic और metabolomic माप, फ़िल्टर (०.२ µm ताकना आकार) और degas सभी बफ़र्स 1 एच के लिए एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर ।

  1. निलंबित सूख पेप्टाइड गोली में संग्रहीत 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ५० µ l के बफर सी (3% v/v ACN, ०.१% v/v प्रपत्र एसिड) मैनुअल तरल हैंडलिंग पिपेट के साथ का उपयोग कर २०० µ l मात्रा क्षमता. ३५ kHz अल्ट्रासोनिक आवृत्ति के साथ एक अल्ट्रासोनिक स्नान में एक 15 मिनट के लिए Sonicate नमूने ।
    सावधानी: ACN और फार्मिक एसिड हानिकारक पदार्थ होते हैं । धुएं डाकू के तहत काम करते है और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं, जैसे, दस्ताने ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०,८१७ x g पर नमूना केंद्रापसारक, तो एक गिलास शीशी को supernatant के 20 µ एल हस्तांतरण ।
  3. अलग पच पेप्टाइड्स का उपयोग कर एक C18 उलट-चरण स्तंभ एक तरल क्रोमैटोग्राफी से जुड़े और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा प्राप्त एक जन स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर.
    1. एक 300-nl/ंयूनतम प्रवाह दर का उपयोग कर नमूने के कॉलम 3 µ एल पर अलग । एक मोबाइल चरण के लिए, बफर सी और डी का उपयोग करें (६३% v/v ACN, ०.१% v/वी फार्म का एसिड), एक ढाल बनाने 3% ACN से 15% ACN 20 मिनट से अधिक और फिर से 30% ACN पर अगले 10 मिनट ।
      नोट: कुछ महीनों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस या – ८० डिग्री सेल्सियस पर नमूना के बाकी स्टोर. proteomic माप से पहले, बर्फ पर नमूना refreeze ।
    2. ६०% ACN का उपयोग कर 10 मिनट के लिए बाहर दूषित पदार्थों को धोने और अगले नमूने के माप से पहले बफर सी के 5 µ एल के साथ कॉलम equilibrate ।
    3. लाभ मास स्पेक्ट्रा ७०,००० पर सेट संकल्प के साथ डेटा-निर्भर एमएस/एमएस विधि का उपयोग कर, 3e6 आयनों के AGC लक्ष्य, १०० MS का अधिकतम इंजेक्शन समय, और ३०० से १६०० के लिए एक एम/जेड । १७,५०० के एक प्रस्ताव पर 15 ms/ms स्कैन की अधिकतम प्राप्त करें, AGC लक्ष्य की 1e5, १०० ms की अधिकतम इंजेक्शन समय, 20% के अनुपात को कम करें, १.६ m/z और m/z की एक आइसोलेशन विंडो के साथ २०० से २००० । शीर्ष ट्रिगर सक्षम करें (6-20 एस), 15 एस के लिए गतिशील अपवर्जन सेट, और 1 और > 5 के आरोपों को छोड़ दें ।

7. Proteomic डेटा की प्रोसेसिंग

  1. नवीनतम Arabidopsis थालियाना proteome डेटाबेस http://www.uniprot.org/से डाउनलोड करें और contaminant डेटाबेस शामिल हैं । नियंत्रण रेखा से प्राप्त कच्चे डेटा का विश्लेषण – एमएस एकीकृत एंड्रोमेडा पेप्टाइड खोज इंजन के साथ MaxQuant का उपयोग कर के साथ डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग कर चलाता है LFQ सामान्यीकरण20,21,22. तालिका sमें प्रयुक्त पैरामीटर्स के बारे में विस्तृत जानकारी ढूंढें ।
  2. "प्रोटीन groups. txt" आउटपुट फ़ाइल खोलें । आगे के विश्लेषण के लिए, प्रोटीन समूहों के लिए फ़िल्टर कम से दो अद्वितीय पेप्टाइड्स के साथ पहचाना. संभावित संदूषणों के रूप में MaxQuant द्वारा परिभाषित प्रोटीन समूहों को निकालें और डेटाबेस में मौजूद थालियाना प्रोटीन्स (फसता हेडर कॉलम में अरथ) के लिए फ़िल्टर करें ।
  3. नमूनों के बीच प्रोटीन संवर्धन के महत्व का परीक्षण करने के लिए, LFQ सामान्यीकृत तीव्रता का उपयोग करें और बिगड़ा, दो पूंछ छात्र टी परीक्षण कई तुलना सुधार के द्वारा पीछा किया (जैसे Benjamini और Hochberg झूठी डिस्कवरी दर (एफडीआर) सुधार या Bonferroni सुधार) ।
    1. EV नियंत्रण और NDPK1 के लिए प्राप्त LFQ तीव्रता की तुलना करके p-मान की गणना करें । सभी अनिर्धारित मानों को फ़िल्टर करें । p-मानों को आरोही क्रम में सॉर्ट करें और एफडीआर सुधार की गणना करने के लिए R स्क्रिप्ट या ऑनलाइन कैल्क्यूलेटर (उदा., https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR) का उपयोग करे । ०.१ के नीचे एफडीआर मानों के लिए फ़िल्टर करें ।
      नोट: शोध के लिए उपयुक्त डेटा विश्लेषण के रूप में विचार करें । मात्रात्मक अध्ययन के लिए (नमूनों के बीच प्रोटीन संवर्धन का विश्लेषण) "LFQ तीव्रता" मूल्य का उपयोग करें, जबकि गुणात्मक अनुसंधान के लिए (उपस्थिति या विशेष रूप से प्रोटीन की अनुपस्थिति) "तीव्रता" मूल्य चुनें ।
    2. NDPK1 में अधिक प्रचुर मात्रा में है कि प्रोटीन समूहों के लिए फ़िल्टर EV नियंत्रण की तुलना । संभावित प्रोटीन भागीदारों के स्थानीयकरण का निर्धारण सूबे के डाटाबेस23 का उपयोग और प्रोटीन सह NDPK1 के साथ स्थानीय के लिए सही है ।

8. ध्रुवीय चरण युक्त नमूनों की माप UPLC का उपयोग कर – MS.

  1. पानी की २०० µ एल में ४.५ कदम से सूखे ध्रुवीय चरण resuspend और 5 मिनट के लिए नमूना sonicate ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०,८१७ x g पर नमूना केंद्रापसारक, तो एक गिलास शीशी को supernatant हस्तांतरण ।
    नोट: पर नमूना के बाकी स्टोर-20 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस के लिए कई महीनों के लिए. metabolomic माप से पहले, बर्फ पर नमूना refreeze ।
  3. एक जुदाई UPLC का उपयोग कर कदम प्रदर्शन C18 उलट-चरण कॉलम और एमएस के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा प्राप्त ।
    1. प्रत्येक ionization मोड के लिए इंजेक्शन प्रति नमूना के कॉलम 2 µ एल पर लोड (सकारात्मक और नकारात्मक) और ४०० µ एल का उपयोग अंश अलग/ metabolite माप के लिए आवश्यक ग्रेडिएंट बनाने के लिए, मोबाइल चरण समाधान निम्नानुसार तैयार करें: बफर A (०.१% एच2ओ में अंलीय अम्ल) और बफर बी (०.१% ACN में फार्मिक एसिड).
    2. ४०० µ l/न्यूनतम और निम्न ग्रेडिएंट पर अलग चयापचयों: बफर a के 1 मिनट ९९%, 11-ंयूनतम रैखिक ढाल के ९९% से एक बफर के ६०% के लिए एक, 13-ंयूनतम के लिए बफर के ६०% से रेखीय ढाल एक बफर के 30% से एक, 15-ंयूनतम रैखिक ढाल के 30% से 1% करने के लिए बफर a एक बफर की, 16 मिनट तक 1% एकाग्रता पकड़ो । 17 मिनट से शुरू, एक बफर के 1% से रैखिक ढाल का प्रयोग करें बफर ए के ९९% के लिए 3 मिनट के लिए कॉलम equilibrate एक बफर की ९९% एकाग्रता के साथ अगले नमूने की माप से पहले ।
    3. अधिग्रहण १०० और १५०० एम/जेड के बीच मास रेंज कवर के लिए संकल्प के साथ २५,००० और लोड करने के लिए निर्धारित समय १०० ms. set AGC लक्ष्य को 1e6, केशिका वोल्टेज एक म्यान गैस प्रवाह और सहायक गैस मूल्य के साथ 3kV को ६० और 20 क्रमशः. २५० डिग्री सेल्सियस और 25V के लिए स्किमर वोल्टेज के लिए केशिका तापमान सेट करें ।

9. Metabolomics डेटा की प्रोसेसिंग

  1. प्रक्रिया दोनों ionization मोड से प्राप्त chromatograms एकत्र की । का प्रयोग करें सॉफ्टवेयर मास निकालने के लिए अनुपात (एम/जेड), प्रतिधारण समय (आरटी) और जुड़े चोटियों की तीव्रता, उदाहरण के लिए, वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) या विकल्प24।
    1. exe फ़ाइल डबल-क्लिक करके सॉफ़्टवेयर संसाधित करना प्रारंभ करें
    2. नया वर्कफ़्लो बनाएं, गतिविधि "फ़ाइल से लोड करें" खोजें और इस गतिविधि को "खींचें और छोड़ें" द्वारा रिक्त कार्यप्रवाह स्थान में ले जाएं । गतिविधि को सही माउस बटन के साथ दबाएं और गतिविधि की सेटिंग खोलें ।
      1. "सामान्य" सेटिंग वाले टैब में, "नाम" फ़ील्ड में प्रयोग का एक नाम सेट करें और अगले क्लिक "फ़ाइलों और फ़ोल्डरों का चयन" और कच्चे chromatograms निशान.
      2. "उन्नत" सेटिंग वाले टैब में, 0 तीव्रता के लिए "प्रोफ़ाइल डेटा कटऑफ" सेट. "Apply" और "ok" पर क्लिक करें ।
    3. के लिए खोज और गतिविधि जोड़ें "डाटा स्वीप" । गतिविधि को सही माउस बटन के साथ दबाएं और गतिविधि की सेटिंग खोलें ।
      1. "सामांय" सेटिंग वाले टैब में, "केन्द्रक डेटा" और "ms/ms डेटा" चिह्नित करें । चयन पैनल में "सब कुछ" चुनकर सभी ms/
    4. के लिए खोज और गतिविधि जोड़ें "वर्णलेख रासायनिक शोर घटाव" । गतिविधि को सही माउस बटन के साथ दबाएं और गतिविधि की सेटिंग खोलें ।
      1. "सामान्य" सेटिंग वाले टैब में, "वर्णलेख स्मूथिंग" को चिह्नित करें और "3" और "अनुमानक" को "चलायमान औसत" पर स्कैन की संख्या सेट करें. सेट "आरटी खिड़की" ५१ स्कैन करने के लिए, "Quantile" करने के लिए ५०%, घटाव "विधि" और ७५० तीव्रता "दहलीज".
      2. "उन्नत" सेटिंग वाले टैब में, "rt संरचना निकालना" चिह्नित करें और 5 स्कैन करने के लिए "न्यूनतम rt लंबाई" सेट करें.
      3. "उन्नत" सेटिंग वाले टैब में, "m/z संरचना निष्कासन" चिह्नित करें और 3 बिंदुओं पर "न्यूनतम m/
    5. के लिए खोज और गतिविधि "वर्णलेख RT संरेखण" जोड़ें । गतिविधि को सही माउस बटन के साथ दबाएं और गतिविधि की सेटिंग खोलें ।
      1. "सामान्य" सेटिंग वाले टैब में, "संरेखण योजना" को "Pairwise संरेखण बेस ट्री" और "RT खोज अंतराल" से ०.५ मिनट पर सेट करें.
      2. "उन्नत" सेटिंग वाले टैब में, डिफ़ॉल्ट पैरामीटर्स का उपयोग करें.
    6. गतिविधियों के "वर्णलेख" समूह में गतिविधि "पीक डिटेक्शन" के लिए खोजें और जोड़ें । गतिविधि को सही माउस बटन के साथ दबाएं और गतिविधि की सेटिंग खोलें ।
      1. "सामान्य" सेटिंग वाले टैब में, "summer विंडो" को ०.०९ मिनट पर सेट करें, "न्यूनतम पीक आकार" को ०.०३ मिनट, "अधिकतम मर्ज दूरी" से 5 अंक और "मर्ज कार्यनीति" को "centers". "पीक RT बंटवारे में" बॉक्स सेट "गैप/पीक अनुपात" ५०% करने के लिए ।
      2. "उन्नत" सेटिंग वाले टैब में, "स्मूथिंग विंडो" को 5 पॉइंट्स पर सेट करें, "परिशोधन थ्रेशोल्ड" को ८०% और "संगतता थ्रेशोल्ड" को 1. ७०% पर सेट "तीव्रता सीमा" के साथ "तीव्रता भारित" के रूप में "केंद्र गणना" सेट करें ।
    7. के लिए खोज और "वर्णलेख" गतिविधियों के समूह में गतिविधि "आइसोटोप clustering" जोड़ें । गतिविधि को सही माउस बटन के साथ दबाएं और गतिविधि की सेटिंग खोलें ।
      1. "सामांय" सेटिंग वाले टैब में, "RT सहिष्णुता" को ०.०१५ मिनट और "m/z सहिष्णुता" को 5 पीपीएम पर सेट करें ।
      2. "लिफाफा फिटिंग" सेटिंग वाले टैब में, "विधि" के रूप में "कोई आकार प्रतिबंध" और "Ionization" (सकारात्मक मोड के लिए) और "प्रोटॉन" (नकारात्मक मोड के लिए) के रूप में सेट करें । सेट "ंयूनतम और अधिकतम शुल्क" 1 और 4 के लिए, क्रमशः ।
      3. "उन्नत" सेटिंग वाले टैब में, डिफ़ॉल्ट पैरामीटर्स का उपयोग करें.
    8. के लिए खोज और गतिविधि जोड़ें "सिंगलटन फ़िल्टर" ।
    9. डेटा प्रोसेसिंग के परिणामों को निर्यात करने के लिए, गतिविधियों के "निर्यात" समूह में गतिविधि "विश्लेषक" खोजें और जोड़ें ।
      1. "सामान्य" सेटिंग वाले टैब में, "प्रकार" को "क्लस्टर" और "अवलोकनीय" के रूप में "अभिव्यक्त तीव्रता" के रूप में सेट करें. चुनें "कस्टम गंतव्य" और निर्यात फ़ाइल की निर्देशिका निर्दिष्ट करें ।
      2. "उन्नत" सेटिंग वाले टैब में, डिफ़ॉल्ट पैरामीटर्स का उपयोग करें.
  2. व्याख्या जन सुविधाओं में घर संदर्भ-यौगिक डाटाबेस का उपयोग कर ।
    1. विश्लेषण एक या एक से अधिक एमएस ग्रेड संदर्भ-यौगिक UPLC का उपयोग-ms. संदर्भ के विश्लेषण के लिए एक ही नियंत्रण रेखा-एमएस विधि का उपयोग-यौगिकों और चयापचयों सह-ब्याज के प्रोटीन के साथ शुद्ध.
      नोट: इस अध्ययन के लिए, लगभग ३०० dipeptides का एक सेट का विश्लेषण किया गया था और संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया-यौगिक पुस्तकालय.
    2. विश्लेषण का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) सॉफ्टवेयर रॉ वर्णलेख फ़ाइल खोलने के लिए और विशिष्ट m/z और आरटी के लिए खोज के साथ जुड़े मापा संदर्भ-यौगिक (उपयोगकर्ता गाइड देखें) ।
      नोट: द्वितीयक चयापचयों ionization के प्रकार में अलग है । आम adducts की उपस्थिति के लिए जांच करें आयन मास के बराबर के लिए एम-१.००७२७६, एम + 1.007276, एम + 18.033823 और एम + 22.989218 के लिए [एम एच], [एम + एच], [एम + एनएच4] और [एम + ना], क्रमशः ।
    3. chromatograms और विशिष्ट आयन मास के लिए खोज के प्रसंस्करण के बाद प्राप्त निर्यात "विश्लेषक" फ़ाइल को खोलने के लिए स्प्रेडशीट का उपयोग करें । संदर्भ यौगिक के प्रयोग और आरटी में मापा जन सुविधा के आरटी की तुलना करें । एम/जेड के लिए ०.००५ दा के विचलन की अनुमति दें और आर टी के लिए ०.१ मिनट
  3. metabolite संवर्धन के महत्व का परीक्षण करने के लिए नमूने के बीच विशेष रूप से प्रोटीन के साथ शुद्ध (ब्याज बनाम EV नियंत्रण के प्रोटीन के साथ लाइन), पीक मूल्यों की तुलना में दो पूंछ गैर युग्मित छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर कई के बाद तुलना सुधार (उदा. Benjamini & Hochberg गलत डिस्कवरी दर सुधार या Bonferroni सुधार) ।

Representative Results

मूल अध्ययन में तीन ए. थालियाना NDPK जीन को PSB-एल सेल निलंबन संस्कृतियों में गठित 35S प्रवर्तक14 (चित्रा 1) के नियंत्रण में पुनः व्यक्त किया गया. मिलकर संबंध टैग या तो carboxy-या एमिनो एक चारा प्रोटीन के टर्मिनल के अंत से जुड़े थे । संबध-शुद्धि परिसरों MTBE/मेथनॉल/पानी निकासी16के अधीन थे । समानता-खींचा प्रोटीन और छोटे अणुओं एमएस का उपयोग कर पहचान की गई (तालिकाओं S2 और S3) ।

झूठी सकारात्मक के लिए सही करने के लिए, खाली नमूनों रसायनों और प्रयोगशाला उपभोग्य सामग्रियों से छोटे अणु संदूषणों को बाहर करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इसके अलावा, चयापचयों और प्रोटीन है कि या तो एक संबंध टैग या अकेले राल को बाइंड EV नियंत्रण लाइनों का उपयोग करके के लिए जवाबदेह थे । सच सकारात्मक पुनः प्राप्त करने के लिए, दो पूंछ गैर युग्मित छात्र टी परीक्षण और Benjamini और Hochberg झूठी खोज दर सुधार चयापचयों (तालिका S4) और प्रोटीन (तालिका S5) काफी NDPKs एपी में समृद्ध की पहचान करने के लिए लागू किया गया था EV नियंत्रण रेखाओं (एफडीआर < ०.१) की तुलना में प्रयोग (N-और C-टर्मिनली टैग किए गए NDPKs) । ध्यान दें कि पिछले काम में, हम प्रोटीन और छोटे-अणु चित्रित के लिए अनुपस्थिति/उपस्थिति मानदंड का इस्तेमाल किया ।

प्रतिनिधि परिणाम NDPK1 के लिए दिए जाते हैं, जबकि metabolite डेटा dipeptides पर ध्यान केंद्रित करते हैं, छोटे-अणु नियामकों का एक उपन्यास वर्ग हमारे समूह में अध्ययन करता है. Proteomic विश्लेषण से पता चला NDPK1 के 26 ख्यात प्रोटीन पार्टनर्स हैं । NDPK1 (cytosol) के रूप में एक ही उपसेलुलर डिब्बे में सह स्थानीयकृत के लिए आगे फ़िल्टरिंग द्वारा, सूची 13 ख्यात प्रोटीन इंटरैक्टर्स के लिए नीचे संकुचित. इनमें पहचाने गए प्रोटीन्स glutathione एस-ट्रांस्फ़्रेज़, दो बढ़ाव दीक्षा कारक, tubulin, और aconitate hydratase थे । Metabolomic विश्लेषण चार dipeptides वैल-लियू, इले-Glu, लियू-इले, और इले-Phe से पता चला है कि विशेष रूप से eluted के साथ सह-NDPK1 (चित्रा 2). नोट करें कि सभी चार dipeptides एक hydrophobic अवशेषों को उनके N-टर्मिनस में साझा करते हैं, साझा बाइंडिंग विशिष्टता का सुझाव देते हैं ।

ज्ञात प्रोटीन के लिए देखने के लिए-प्रोटीन और प्रोटीन-metabolite परिसरों हम 13 की पहचान की प्रोटीन और चार dipeptides सिलाई डेटाबेस25 (चित्रा 3) के खिलाफ । कई अवलोकन किए जा सकते हैं: (i) NDPK1 के लिए कोई भी सूचना पहले रिपोर्ट नहीं की गई थी । (ii) APX1 ortholog एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज परिवार के सदस्य ALDH7B4 के साथ बातचीत करने के लिए सूचित किया गया था, जबकि अनुवाद दीक्षा कारक जीन FBR12 द्वारा इनकोडिंग एक और अनुवाद दीक्षा कारक के साथ AT2G40290. (iii) पहचाने गए dipeptides के पास कोई रिपोर्ट किया गया प्रोटीन भागीदार नहीं है । सह eluted dipeptides पहले किसी भी प्राप्त संयंत्र प्रोटीन से संबंधित के रूप में रिपोर्ट नहीं थे । हालांकि, वे अंय जीवों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं: लियू-इले, जैसे, एक मानव कोशिका लाइन26में एक neurotrophin सक्रिय प्रभाव है । ध्यान दें कि प्रयोग सिस्टम की सटीक टोपोलॉजी पहचानने की अनुमति नहीं देता है । उदाहरण के लिए, एक dipeptide सीधे NDPK1 के साथ बातचीत कर सकते हैं, लेकिन अच्छी तरह से किसी भी सह शुद्ध प्रोटीन से संबंधित हो सकता है ।

एक साथ लिया, हमारे परिणाम बताते है कि स्थापित प्रक्रिया, जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ एक साथ एपी रोजगार, प्रोटीन प्रोटीन और प्रोटीन की पहचान की सुविधा छोटे-अणु इंटरैक्टर्स और के बारे में विस्तृत जानकारी उत्पंन करने में मदद करता है लक्ष्य प्रोटीन की interactome ।

Figure 1
चित्र 1. एपी-एमएस कार्यप्रवाह की योजना । (एक) संयंत्र सेल संस्कृति से एक देशी घुलनशील अंश की तैयारी । (ख) एपी प्रक्रिया में अगले कदम । कॉलम पर नमूना लोड करने के बाद, ब्याज की प्रोटीन (POI) एक नल टैग से जुड़े आईजीजी एंटीबॉडी agarose मोतियों पर मैटीरियल को बांधता है । स्तंभ की धुलाई असीम प्रोटीन और चयापचयों को हटाने की सुविधा । AcTEV दरार प्रदर्शन के बाद, POI प्रोटीन-metabolite परिसरों eluted हैं । (ग) प्रोटीन और metabolite अंश अर्द्ध मात्रात्मक एमएस विश्लेषण के बाद में परिसरों की जुदाई । इस आंकड़े का हिस्सा Luzarowski एट अल. २०१७14से reproduced है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. NDPK1 के साथ Dipeptides विशेष रूप से सह eluting । चार dipeptides वैल की औसत तीव्रता-लियू (ए), इले-Glu (बी), लियू-इले (सी), और इले-Phe (D) एपी प्रयोग में मापा साजिश रची गई. सभी चार dipeptides EV नियंत्रण की तुलना में NDPK1 नमूनों में महत्वपूर्ण संवर्धन दिखाते है (तारांकन एफडीआर < ०.१ का प्रतिनिधित्व करते हैं) । त्रुटि पट्टियां 6 माप के लिए मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती है (3 के एन-और 3 सी-टर्मिनल टैग किए गए प्रोटीन की प्रतिकृति) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. सभी अणुओं सह NDPK1 के साथ eluting के संपर्क नेटवर्क, सिलाई केवल पिछले प्रयोगात्मक और डेटाबेस सबूत (विश्वास > ०.२) पर विचार डेटाबेस के खिलाफ पूछे । उच्च विश्वास बातचीत की अधिक संभावना इंगित करता है और जमा किए गए डेटा के आधार पर गणना की जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका एस सी । MaxQuant आउटपुट तालिका "पैरामीटर्स. txt" । तालिका में पहचान और ठहराव के लिए थ्रेशोल्ड मान, साथ ही उपयोग किए गए डेटाबेस के बारे में जानकारी शामिल है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

तालिका S2 । MaxQuant आउटपुट तालिका से जानकारी "proteinGroups. txt"। तालिका में सभी पहचाने गए प्रोटीन समूहों, तीव्रता, और अद्वितीय पेप्टाइड्स और स्कोर की संख्या के रूप में अतिरिक्त जानकारी की एक सूची है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

तालिका S3 । आउटपुट फ़ाइल ध्रुवीय चयापचयों के विश्लेषण युक्त । तालिका विशिष्ट एम/जेड, आर टी और तीव्रता द्वारा विशेषता सभी की पहचान की जन सुविधाओं की एक सूची में शामिल है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

तालिका S4. Dipeptides में एपी के नमूनों में पाया गया जिसमें NDPK1, NDPK2 या NDPK3 को चारा के रूप में इस्तेमाल किया गया. रिक्त नमूनों में उपस्थित Dipeptides को सूची से बाहर रखा गया । दो स्वतंत्र लाइनें (या तो N-या सी में टैग-टर्मिनस) प्रत्येक NDPK के लिए तपसिल में चलाए गए थे । Benjamini & Hochberg पद्धति का उपयोग करके p-मान के छात्र का t-परीक्षण और सुधार के लिए काफी समृद्ध इंटरैक्टकर्ता भागीदारों NDPKs (एफडीआर < ०.१) का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया गया था । दी ΔRT संदर्भ यौगिकों और Δppm27Metlin में दिए गए monoisotopic मास के संबंध में गणना के संबंध में है. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

तालिका S5 । प्रोटीन NDPK1 के साथ सह शुद्ध । दो स्वतंत्र लाइनें (या तो N-या सी में टैग-टर्मिनस) प्रत्येक NDPK के लिए तपसिल में चलाए गए थे । Benjamini & Hochberg पद्धति का उपयोग करके p-मान के छात्र का t-परीक्षण और सुधार के लिए काफी समृद्ध इंटरैक्टकर्ता भागीदारों NDPKs (एफडीआर < ०.१) का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल पीपी और प्रधानमंत्री एक लक्ष्य प्रोटीन के परिसरों की समानांतर पहचान की अनुमति देता है । क्लोनिंग से अंतिम परिणाम के लिए, प्रयोग के रूप में छोटे रूप में 8-12 सप्ताह में पूरा किया जा सकता है । पूरा एपी के बारे में 12 से 24 नमूनों का एक सेट के लिए 4-6 एच लेता है, हमारे प्रोटोकॉल के मध्य प्रवाह विश्लेषण के लिए उपयुक्त प्रतिपादन ।

प्रोटोकॉल, समग्र सीधा होने के बावजूद, महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर है । (i) इनपुट प्रोटीन और संबध मोतियों की पर्याप्त मात्रा में metabolite का पता लगाने के एक गतिशील रेंज तक पहुंचने के लिए महत्वपूर्ण है । कुशल कोशिका lysis इसलिए प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है । गरीब प्रोटीन पैदावार सामग्री या इष्टतम lysis-बफर/सामग्री अनुपात के अपर्याप्त चूर्णन का परिणाम हो सकता है । (ii) देखभाल की जानी चाहिए कि इस्तेमाल किया एजेंट एमएस के अनुकूल हैं । मजबूत डिटर्जेंट, ग्लिसरॉल, या नमक की अत्यधिक मात्रा के रूप में वे एमएस का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप से बचा जाना चाहिए । (iii) Agarose मोतियों की धुलाई चरणों के दौरान खत्म नहीं होना चाहिए, और जब एक निर्वात कई गुना यह एक धीमी प्रवाह की दर को लागू करने के लिए इतना के रूप में मोतियों को नष्ट या जटिल स्थिरता को प्रभावित नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है का उपयोग कर ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए कुछ महत्वपूर्ण संभव संशोधनों हैं: (i) हम गठन CaMV35S प्रमोटर का उपयोग करने के लिए चारा प्रोटीन की मात्रा को अधिकतम । बहुत उपयोगी है, जबकि व्यक्त, सेल homeostasis28 पर गंभीर प्रभाव है और शारीरिक रूप से अप्रासंगिक बातचीत के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । टैग की अभिव्यक्ति प्रोटीन देशी प्रवर्तकों का उपयोग कर और जहां एक नुकसान में संभव-समारोह पृष्ठभूमि सही जैविक सूचना प्राप्त करने के लिए बेहतर माना जाता है । प्रोटीन के लिए आम तौर पर संयंत्र सेल संस्कृतियों में व्यक्त नहीं, एक संयंत्र पृष्ठभूमि प्रासंगिक बातचीत की पहचान करने के लिए आवश्यक साबित हो सकता है । (ii) झिल्ली प्रोटीन के साथ काम करते समय, lysis बफर एक एमएस-संगत डिटर्जेंट के साथ पूरक होने की जरूरत है । (iii) एक दूसरे संबध का परिचय-शुद्धि चरण सही-सकारात्मक अनुपात के लिए झूठी-सकारात्मक सुधार और EV नियंत्रण29की जरूरत को खत्म कर सकता है । दो स्वतंत्र के साथ एक उपंयास मिलकर टैग-दरार साइटों आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी कदम के लिए एक आकर्षक विकल्प प्रस्तुत करता है माएदा एट अल. २०१४11है, जो दोनों श्रमसाध्य और समय लगता है द्वारा जोड़ा गया ।

एपी की सबसे गंभीर खामी झूठी सकारात्मक की उच्च दर है । कारण अनेक होते. गठन से पहले ही स्पष्ट उल्लेख किया गया था । शारीरिक अप्रासंगिक बातचीत का एक अंय स्रोत है, जब तक पृथक organelles के साथ काम कर रहे, पूरे सेल lysates प्रोटीन और चयापचयों के विभिंन उपसेलुलर डिब्बों से युक्त मिश्रण की तैयारी है । सेलुलर स्थानीयकरण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए के लिए फ़िल्टर सच है । फिर भी, विशिष्ट प्रोटीन और agarose रेजिन के बीच बंधन से झूठी सकारात्मक परिणाम के बहुमत । एक दूसरे शुद्धि कदम का परिचय, जैसा कि ऊपर वर्णित है, समस्या का सबसे अच्छा समाधान प्रदान करता है, लेकिन समय और प्रवाह की कीमत पर आता है । इसके अलावा, कमजोर बातचीत के रूप में प्रोटोकॉल लंबा खो सकता है । एपी का एक और चेतावनी है कि व्यापक जानकारी के बावजूद यह एक लक्ष्य प्रोटीन के interactome के बारे में प्रदान करता है, चारा प्रोटीन के प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष लक्ष्यों के बीच अंतर असंभव है । लक्षित bimolecular दृष्टिकोण को बातचीत की पुष्टि की जरूरत है ।

एमएस के साथ मिलकर एपी आधारित metabolomics एस cerevisiae12 में प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह काम, साथ में हमारे पहले अवलोकन13 कि, लिपिड के लिए इसी तरह, ध्रुवीय और अर्द्ध ध्रुवीय यौगिकों प्रोटीन परिसरों सेलुलर lysates से पृथक करने के लिए बाध्य रहते हैं, प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए वैचारिक आधार प्रदान की है । हमारे प्रोटोकॉल तीन अद्वितीय अंक की विशेषता है: (मैं) खमीर12काम करने के लिए इसके विपरीत, यह दर्शाता है कि एपी न केवल hydrophobic लेकिन यह भी हाइड्रोफिलिक प्रोटीन लाइगैंडों वापस लाने के लिए उपयुक्त है । (ii) एक तीन में एक निष्कर्षण प्रोटोकॉल शुरू करने से, एक एपी के लिए प्रोटीन और चारा प्रोटीन के metabolite के इंटरैक्टर्स का अध्ययन किया जा सकता है । (iii) हम संयंत्र कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित ।

भविष्य के प्रयासों के साथ एक उपंयास मिलकर टैग बनाने पर ध्यान केंद्रित करेंगे दो स्वतंत्र टीज़-दरार साइटों । हम भी कम बहुतायत छोटे अणुओं जैसे संयंत्र हार्मोन के लिए प्रोटोकॉल की उपयुक्तता का पता लगाने के लिए करना चाहते हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कृपया चाहते है कि परियोजना, उत्पादक चर्चा, और महान पर्यवेक्षण में उनकी भागीदारी के लिए प्रो Dr. लोथार Willmitzer स्वीकार करते हैं । हम proteomic एमएस माप के साथ मदद करने के लिए डॉ डैनियल Veyel के लिए आभारी हैं । हम श्रीमती Änne Michaelis जो हमें नियंत्रण रेखा-एमएस माप के साथ अमूल्य तकनीकी मदद प्रदान की सराहना करते हैं । इसके अलावा, हम उनकी मदद और मूल पांडुलिपि पर काम में शामिल करने के लिए डॉ मोनिका Kosmacz और dr. Ewelina Sokołowska शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और तकनीकी सहायता के लिए Jasińska Weronika ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics Sigma-Aldrich M6899
1-Naphthylacetic acid Sigma-Aldrich N1641
Kinetin solution Sigma-Aldrich K3253
Tris base Sigma-Aldrich 10708976001
NaCl Sigma-Aldrich S7653
MgCl2 Carl Roth 2189.1
EDTA Sigma-Aldrich 3609
NaF Sigma-Aldrich S6776
DTT Sigma-Aldrich D0632
PMSF Sigma-Aldrich P7626
E-64 protease inhibitor Sigma-Aldrich E3132
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P9599
Na3VO4 Sigma-Aldrich S6508
AcTEV Protease Thermo Fischer Scientific 12575015
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) Carl Roth 3029.2
TEMED Carl Roth 2367.3
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fischer Scientific 26616
SBP Tag Antibody (SB19-C4) Santa Cruz Biotechnology sc-101595
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005
Bradford Reagent Sigma-Aldrich B6916
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega  V5071
Urea Sigma-Aldrich U5128
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149
MTBE  Biosolve 138906
Methanol  Biosolve 136806
Water Biosolve 232106
Acetonitrile Biosolve 12006
Trifluoroacetic acid  Biosolve 202341
Formic acid  Biosolve 69141
Unimax 2010 Platform Shaker Heidolph 5421002000
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) Prosepa Custom order
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml Restek KT953751-0000
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St VWR International GmbH 514-0340
Mixer Mill MM 400 Retsch GmbH 207450001
IgG Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0969-02
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters MoBiTec GmbH M1002
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 MoBiTec GmbH M513515
Variable Speed Tube Rotator SB 3 Carl Roth Y550.1
Rotary dishes for rotators SB 3 Carl Roth Y555.1
Resprep 24-Port SPE Manifolds Restek  26080
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml Teknokroma TR-F034000
Autosampler Vials Klaus Trott Chromatographie-Zubehör 40 11 01 740
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column Thermo Fischer Scientific 164534
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph Thermo Fischer Scientific LC120
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Fischer Scientific IQLAAEGAAPFALGMBDK
Acquity UPLC system  Waters  Custom order
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg Waters  186003533
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions Bandelin RK 31
Genedata Expressionist Genedata NaN
Xcalibur Software Thermo Fischer Scientific NaN
MaxQuant NaN NaN

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References

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Luzarowski, M., Wojciechowska, I., Skirycz, A. 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes. J. Vis. Exp. (138), e57720, doi:10.3791/57720 (2018).

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