Protein-protein och protein-metaboliten interaktioner är avgörande för alla cellulära funktioner. Häri, beskriver vi ett protokoll som möjliggör parallell analys av dessa interaktioner med ett protein val. Våra protokoll var optimerad för växt cellkulturer och kombinerar affinitet rening med massa spektrometri-baserade protein och metaboliten upptäckt.
Cellulära processer regleras av samspelet mellan biologiska molekyler som proteiner, metaboliter och nukleinsyror. Utredningen av protein-protein interaktioner (PPI) är ingen nyhet, utgör experimentella metoder som syftar till att karakterisera endogen protein-metaboliten interaktioner (PMI) en ganska nyligen utveckling. Häri, presenterar vi ett protokoll som tillåter samtidig karakterisering av PPI och PMI ett protein val, avses som bete. Våra protokoll var optimerad för Arabidopsis cell kulturer och kombinerar affinitet rening (AP) med masspektrometri (MS)-baserat identifiering av protein och metabolit. Kort sagt, är transgena Arabidopsis linjer, uttrycker bete protein smält till en affinitet tagg, först lyserat för att erhålla en native cellulära extrakt. Anti tagg antikroppar används för att dra ner protein och metaboliten partners av proteinet bete. Affinitet-renat komplexen extraheras med hjälp av en one-step metyl tert-butyl ether (MTBE) / metanol/vatten-metoden. Samtidigt metaboliter separera i antingen den polära eller fasen hydrofoba, kan proteiner hittas i pelleten. Både metaboliter och proteiner analyseras sedan av ultra-prestanda liquid chromatography-masspektrometri (UPLC-MS eller UPLC-MS/MS). Tom-vektor (EV) kontroll linjer används för att utesluta falska positiva. Den stora fördelen med våra protokoll är att det möjliggör identifiering av protein och metaboliten partners ett målprotein parallellt i nära-fysiologiska förhållanden (cell lysate). Den presenterade metoden är enkelt, snabbt och enkelt kan anpassas till biologiska system än växt cellkulturer.
Metoden som beskrivs här syftar på identifiering av metaboliten och protein partner av ett protein av val i nära –in vivo – cell lysate villkor. Det har spekulerats att många fler metaboliter än kännetecknas idag har en viktig reglerande funktion1. Metaboliter kan fungera som biologiska växlar, ändra den aktivitet, funktionalitet eller lokalisering av sin receptor protein2,3,4. Under det senaste decenniet har flera genombrott metoder, som möjliggör identifiering av PMI i vivo eller i nära –in vivo – förhållanden, varit utvecklade5. Tillgängliga metoder kan delas in i två grupper. Den första gruppen består av tekniker som startar med en känd-metaboliten bete för att fånga roman protein partners. Metoder inkluderar affinitet kromatografi6, drog affinitet lyhörd mål-stabilitet analys7, kemo-proteomik8och termisk proteomet profilering9. Den andra gruppen består av en enda metod som börjar med en känd protein för att identifiera småmolekylär ligander10,11.
AP tillsammans med MS-baserad gammaldags användes för att analysera protein-lipid komplex i Saccharomyces cerevisiae12. Som utgångspunkt, författarna använde jäststammar som uttrycker 21 enzymer som är involverade i ergosterol biosyntes och 103 kinaser smält till en tandem affinitet rening (TAP) tag. 70% av enzymer och 20% av kinaser konstaterades för att binda olika hydrofoba ligander, sprider ljus i intrikata protein-lipid interaktion nätverket.
Tidigare kunde vi visa att likaså att lipider, polar och semi polära föreningar också förbli bundet till proteinkomplex isolerade från den cellulära lysates13. Baserat på dessa fynd, beslutade vi att optimera AP metod tidigare publicerade10,11 för växtceller och hydrofil föreningar14. För detta ändamål använde vi TAP vektorer beskrivs av Van Leene et al. 2010, framgångsrikt används i anläggningen PPI studier15. För att förkorta den tid som krävs för att erhålla transgena linjerna, bestämde vi oss på Arabidopsis cellkulturer. Vi anställt en one-step metyl tert-butyl ether, (MTBE) / metanol/vatten utvinning metod, vilket gör att karakterisering av proteiner (pellets), lipider (organiska fasen) och hydrofila metaboliter (vattenfas)16 i en enda affinitet-rening experiment. EV kontroll linjer infördes för att utesluta falska positiva, e.g. proteiner som binder till taggen ensam. Som bevis på koncept vi taggade tre (av fem) nukleosid diphosphate kinaser presentera i Arabidopsis genomet (NDPK1-NDPK3). Bland andra fynd kunde vi visa att NDPK1 interagerar med glutation S-transferas och glutation. Följaktligen kunde vi bevisa att NDPK1 utsätts för glutathionylation14.
Sammanfattningsvis redovisade protokollet är ett viktigt verktyg för karaktärisering av protein-protein och protein-småmolekylär interaktion nätverk och utgör ett stort framsteg jämfört med befintliga metoder.
Presenterade protokollet tillåter parallella identifiering av PP och PM komplexen av ett målprotein. Från kloning till slutresultat, kan experimentet utföras i så lite som 8-12 veckor. Komplett AP tar ca 4-6 h för en uppsättning av 12 till 24 prover, rendering våra protokoll lämplig för mitten av genomströmning analys.
Protokollet, trots att totalt okomplicerad, har ett antal kritiska moment. a tillräcklig mängd indata protein och affinitet pärlor är avgörande för att nå ett dynamiskt spektrum av metaboliten upptäckt. Effektiv cellys är därför ett avgörande steg i förfarandet. Stackars protein avkastningen kan bli en följd av otillräcklig pulvrisering av materialet eller suboptimala baserat på Lys-buffert/material. (ii) bör vara försiktig att använda reagenser är MS-vänlig. Starka rengöringsmedel, glycerol eller överdrivna mängder salt bör undvikas eftersom de stör efter MS upptäckt. (iii) agaros pärlor bör inte vara alltför torkade under tvätt steg, och när du använder ett vakuum grenrör är det viktigt att tillämpa en långsamt flöde så att inte för att förstöra pärlor eller påverka komplexa stabilitet.
Det finns några viktiga eventuella ändringar presenteras protokollet: (i) vi använder konstituerande CaMV35S arrangören för att maximera mängden bete protein. Överuttryck, kan medan mycket användbart, ha allvarliga effekter på cellen homeostas28 och leda till bildandet av fysiologiskt irrelevant interaktioner. Uttrycket av märkta proteiner med hjälp av infödda initiativtagare och där möjligt i en förlust-av-funktion bakgrund anses överlägsen för att hämta sanna biologiska interactmedlemmar. För proteiner som normalt inte uttryckt i växten cellkulturer, kan en växt bakgrund bli nödvändigt att identifiera relevanta interactmedlemmar. (ii) när du arbetar med membranproteiner, behöver lyseringsbuffert kompletteras med en MS-kompatibla rengöringsmedel. (iii) införande av ett andra affinitet-rening steg kunde förbättra falsk-positiv sant positiva förhållande till och eliminera behovet för EV kontroller29. En roman tandem tagg med två oberoende proteas-klyvning platser presenterar ett attraktivt alternativ till storlek-utslagning kromatografi steg till av Maeda et al. 201411, som är både mödosam och tidskrävande.
Den allvarligaste nackdelen med AP är den höga andelen falskt positiva. Skälen är många. Konstituerande överuttryck nämndes redan. En annan källa till fysiologiskt irrelevant interaktioner, är såvida inte arbetar med isolerade organeller, beredning av hela-cell lysates innehåller blandningar av proteiner och metaboliter från olika subcellulär fack. Subcellulär lokalisering bör användas för att filtrera för sann interactmedlemmar. Dock majoriteten av falska positiva resultat från ospecifik bindning mellan proteiner och agaros hartser. Införandet av ett andra reningssteg, som beskrivits ovan, erbjuder den bästa lösningen på problemet, men sker på bekostnad av tid och genomströmning. Svagare interaktion kan dessutom förloras som protokollet förlänger. En annan varning till AP är att trots den omfattande informationen den ger om interactome av ett målprotein, att skilja mellan direkta och indirekta mål av proteinet agnade är omöjligt. Målinriktade bimolecular strategier behövs för att bekräfta interaktioner.
AP tillsammans med MS-baserad metabolomik användes för att studera protein-komplex i S. cerevisiae12. Detta verk, tillsammans med våra tidigare observation13 att likaså att lipider, polar och semi polära föreningar förbli bundet till proteinkomplex isolerade från cellulära lysates, föreskrivs begreppsmässiga grunden presenterade protokollet. Våra protokoll kännetecknas av tre unika punkter: (i) i kontrast till jästen arbetar12, visar att AP är lämplig för att hämta inte bara hydrofoba men också hydrofil protein ligander. (ii) genom att införa ett tre-i-en extraktion protokoll, kan en enda AP användas för att studera protein och metaboliten interactmedlemmar av proteinet bete. (iii) vi anpassade protokoll för att plantera celler.
Framtida insatser inriktas på att skapa en roman tandem-tagg med två oberoende proteas-klyvning platser. Vi vill också undersöka lämpligheten av protokollet till låg-överflöd små molekyler som växt hormoner.
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja Vänligen bekräfta Prof. Dr. Lothar Willmitzer för hans engagemang i projektet, produktiva diskussioner och bra tillsyn. Vi är tacksamma mot Dr. Daniel Veyel för att hjälpa till med proteomiska MS mätningar. Vi uppskattar Mrs. Änne Michaelis som gett oss ovärderlig teknisk hjälp med LC-MS mätningar. Dessutom vill vi tacka Dr Monika Kosmacz och Dr. Ewelina Sokołowska för deras hjälp och engagemang i arbetet på det original-manuskriptet, och att Weronika Jasińska för teknisk support.
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |