Summary
Здесь мы представляем протокол, использующий JC-1 краска оценить потенциал митохондриальной мембраны клеток после воздействия гипоксии/реоксигенацию с или без защитного агента.
Abstract
Своевременное и эффективное реперфузии перекрытых коронарной артерии является лучшей стратегией для уменьшения размера при инфаркте миокарда у больных с ST-сегмента повышенных инфаркт миокарда. Однако реперфузия само по себе может привести к дальнейшей cardiomyocyte смерти, явление, известное как реперфузионных повреждений. Открытие митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP), с уменьшение потенциальных митохондриальной мембраны (СПП), или митохондриальной деполяризации, повсеместно признается в качестве заключительного шага реперфузионных повреждений и отвечает за митохондриальных и смерть cardiomyocyte. JC-1 является липофильных Катионный красителем, который накапливается в митохондрии в зависимости от значения ММП. Выше МЦП, больше JC-1 накапливается в митохондриях. Все большее количество JC-1 в митохондриях могут быть отражены с флуоресцентным выбросов переход от зеленого (~ 530 Нм) красный (~ 590 нм). Таким образом сокращение коэффициента интенсивности флуоресценции красный/зеленый может указывать деполяризации митохондрий. Здесь мы берем преимущество JC-1 для измерения ММП, или открытие mPTP в культивировании человека после гипоксии/реоксигенацию, обнаруживаемых проточной цитометрии.
Introduction
Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смерти во всем мире. Препаратом выбора для уменьшения ишемических повреждений и ограничивая размер infarct у больных с ST-сегмента повышенной инфаркт миокарда является своевременным и эффективным миокарда реперфузии через первичного чрескожного коронарного вмешательства (PCI)1, 2. Однако реперфузия вызывает дополнительные повреждения, которые могут составлять до 30 процентов окончательной инфаркте размер3. Повсеместно признается, что митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP) не только Центральной в митохондриальной смерти повреждения и клетки во время ишемии/реперфузии (I / R), но также сходящихся мишенью кардиопротекторное сигнализации4 , 5. как открытие mPTP принесет деполяризации внутренней митохондриальной мембраны потенциал (СПП)4, мы обнаружили mPTP открытия с помощью 5, 5 ', 6, 6 ' тетрахлор-1, 1′, 3, 3 ' тетраэтил imidacarbocyanineiodide (JC-1) пробирного.
Assay JC-1 является метод cytofluorimetric, который как качественные, так и количественных, и он далее протестирована, анализируя ММП на уровне одной митохондрии6. JC-1 существует в агрегированной форме, уступая красный оранжевый цветные выбросов (590 нм ± 17,5) в матрице митохондрий с обычной СПП; с потерей ММП JC-1 преобразуется в односегментную форму, которая дает зеленый флуоресценции с выбросами 530 нм ± 15. Таким образом, снижение коэффициента интенсивности флуоресценции красный/зеленый может означать сокращение ММП в условиях ишемии/реперфузии (I / R).
В дополнение к JC-1 ММП также были изучены с проницаемой мембраны липофильных катионов как родамин 123 и 3, 3 ' dihexyloxadicarbocyanine йодид [DiOC6(3)]. Однако по сравнению с этих двух зондов, JC-1 является более надежным для анализа ММП. Родамин 123 имеет сравнительно бедных чувствительность (особенно в закалки режим7,8) и бедных специфичности. Сдвиг в родамин 123 иногда настолько мала, что это трудно для исследователей или оборудование для обнаружения и наблюдения. Кроме того в отдельной ячейке, есть различные митохондрий привязки сайтов для родамин 123 и так, что оно может иметь различные флуоресценции выбросов9. DiOC6(3) не рекомендуется для обнаружения MMP либо, как он чутко реагирует на деполяризации мембраны плазмы10.
Таким образом здесь мы используем пробирного JC-1 для оценки СПП МСБ после воздействия гипоксии/реоксигенацию с или без защитного агента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка реагентов и решения
- Подготовка полного среднего человека культивировании (МСБ) путем добавления 25 мл смеси среднего роста Myocyte дополнение к 500 мл Myocyte среднего роста в соответствии с инструкциями производителя. Хранить при 4 ° C и тепло до 37 ° C перед использованием.
- Приготовляют раствор Tongxinluo (TXL) путем растворения TXL ультрадисперсных порошок в сыворотке крови, глюкоза свободно Дульбекко изменение средних орла (DMEM) и регулировка концентрации TXL до 400 мкг/мл, добавив DMEM (для более подробной информации, см.11). Хранить при 4 ° C и тепло до 37 ° C перед использованием.
- Подготовьте 5 мл JC-1 рабочего раствора путем добавления 25 мкл Стоковый раствор (200 x) JC-1, 4 мл сверхчистой воды и 1 мл бульона, окрашивание буфера (5 x) в пластиковых пробирок 15мл в темноте. Пипетка смесь вверх и вниз несколько раз и нагреть до 37 ° C перед использованием.
- Подготовьте работы окрашивание буфера путем добавления 6 мл бульона, окрашивание буфера (5 x) в 50 мл пластиковых пробирок 24 мл ультрачистая вода по 30 мл. Используйте это решение ледяной.
2. Создание гипоксии/реоксигенацию модели
- Пластина 1.0 x 105 клеток на колодец с полного среднего HCM в 6 пластины хорошо. Расти, чтобы достичь confluency около 70% в инкубаторе ячейки, содержащей 5% CO2 и 95% воздуха при 37 ° C.
- Промойте МСБ фосфатный буфер (PBS). Предоставить различные виды лечения (400 мкг/мл TXL или нет) по 2 мл сыворотки/глюкозы-Free DMEM за 30 мин до гипоксии в инкубаторе ячейки, содержащей 5% CO2 и 95% воздуха при 37 ° C.
- Инкубировать МСБ в герметичном и гипоксических банку (2,5 Л) оснащены катализатором Мусоробот свободного кислорода и заставить гипоксии для 18 h (рис. 1A) и анаэробной индикатор для измерения напряжения кислорода в средних11,12, 13, в инкубаторе ячейки, содержащей 5% CO2 и 95% воздуха при 37 ° C.
Примечание: Она занимает около 1,5 часа для катализатора очистить свободного кислорода в банку. Таким образом МСБ хранятся в банку для 19,5 ч, перед открытием jar. Цвет анаэробных индикатора меняется от светло-голубой в нормоксические среде бледно белый в состоянии гипоксии (рис. 1B). - Reoxygenate МСБ, перемещая 6 хорошо пластины в инкубаторе набор при 37 ° C, содержащих 5% CO2 и 95% воздуха за 2 ч.
3. Подготовка МСБ для проточной цитометрии
- Теплый 0,25% раствор трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и PBS до 37 ° C.
- Аспирационная среднего от каждой скважины, промойте клетки с 1 мл раствора PBS и добавить 0,5 мл 0,25% трипсина вдоль стены колодца.
- Инкубируйте при 37 ° C, до тех пор, пока все МСБ почти отдельностоящий (около 1 мин).
- Добавьте 1 mL DMEM полной среды (DMEM средний с 10% плода бычьим сывороточным) к скважинам для нейтрализации трипсина. Передать пластиковых пробирок 15 мл суспензии клеток и Пелле МСБ центрифугированием на 500 g x 3 мин при комнатной температуре.
- Тщательно удалить супернатант не нарушая гранулы.
- Добавьте 0,5 мл HCM полного среднего и 0,5 мл JC-1 рабочего раствора в каждую пробирку. Ресуспензируйте МСБ, закупорить вверх и вниз.
- Покрывают весь трубы с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить обесцвечивание флуоресцентный индикатор и инкубировать МСБ в нормальных условиях (при 37 ° C, содержащих 5% CO2 и 95% воздуха) 20 мин.
- Пелле МСБ центрифугированием на 500 g x 3 мин при 4 ° C.
- Промойте МСБ дважды с 2 мл ледяной JC-1 окрашивание буфера.
- Ресуспензируйте МСБ в окончательный объем 300 мкл ледяной окрашивание буфера в образец трубки (12 мм x 75 мм) и использовать клетки для анализа в течение 30 мин.
Примечание: Используйте карбонильных цианида m хлорфенил гидразоны (CCCP), мощный ингибитор дыхания электрон-транспортной цепи, для лечения МСБ на 1 ч в концентрации 20 мкм, для позитивного элемента управления.
4. потока цитометр установки
- Запустите проточный цитометр и убедитесь, что программное обеспечение подключен к нему.
- Выполняют fluidics запуска, запуск потока и создать отрыв.
- Откройте два окна участок точка в программном обеспечении цитометрия потоков.
- Выберите вперед разбросаны свет (FSC) на оси X и стороны рассеянного света (SSC) на оси Y в первый участок точка представляют характеристики клеток с точки зрения их размера и их гранулярности, соответственно.
- Выберите канал обнаружения (575 Нм ± 26) PE для оси Y и FITC (530 ± 30 Нм) для оси X, используя логарифмическую шкалу в второй участок точка, которая используется для измерения интенсивности флуоресценции JC-1 краска в клетках.
5. поток цитометрии измерение и анализ данных
- Нажмите кнопку выгрузить из трубки поддержка руку и поместите пустой (МСБ, не был окрашенных с JC-1) образец трубки на нем. Нажмите кнопку загрузки для возвращения трубки поддержка руку в рабочее положение.
- Нажмите кнопку запись для сбора частиц взвеси в пустой образец трубки и затем ворота популяции клеток (P1) для дальнейшего анализа в первой точкой сюжета (рис. 3).
- Собирать МСБ в других пробоотборные трубки и оптимизировать измерение, регулируя напряжение флуоресценции каналов, чтобы убедиться, что клетки точка расположен в центральном районе второго участка точка.
- Отображение статистики каждого образца трубки и рассчитать путем деления отношение интенсивности красной флуоресценцией, зеленой флуоресценцией интенсивности равенству каждого образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Перед выполнением assay JC-1 для оценки изменений ММП, настоятельно рекомендуется, что быть проведены эксперименты для подтверждения условий успешно установленные исследователи. Как показывают результаты цитометрии потока (рис. 2), по сравнению с обычной группой, гипоксии/реоксигенацию (H/R) значительно индуцированного апоптоза МСБ (Annexin V + /PI±), указав, что мы была создана на основе ячеек модель я / R (45.00 ± 2,13% против. 11.50 ± 0,18% в группе обычных p < 0,05). Tongxinluo, китайской традиционной медицины с кардиопротекторное эффекты, помешали апоптоз МСБ в состоянии H/r (24.50 ± 1,13% против 45.00 ± 2,13% в группе H/R, p < 0,05).
CCCP является protonophore, который может сдерживать окислительного фосфорилирования в митохондриях, расцеплять протонного градиента (потеря MMP) создана в ходе нормальной деятельности перевозчиков электрона в электрон-транспортной цепи. Следовательно МСБ, получавших CCCP был установлен как позитивный элемент управления. Как показано на рисунке 4, красный/зеленый в группе CCCP-лечение составляло почти до нуля. В соответствии с результатами от апоптоза assay, Группа H/R-лечение отображаются значительно ниже по сравнению с обычной группой соотношение красный/зеленый (0,69 ± 0,07 против 5.64 ± 0,21 в нормальной группе p < 0,05) и Tongxinluo вспять такой коэффициент изменить (2.92 ± 0,22 против 0,69 ± 0,07 в группе H/R, p< 0,05).
Рисунок 1. Создание модели гипоксии/реоксигенацию (H/R). A. материалы, необходимые для установления H/R модель; B. подтверждение гипоксических окружающей среды в банку. Цвет анаэробных индикатора меняется от светло-голубой в нормоксические среде бледно белый в состоянии гипоксии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Проверка создания модели гипоксии/реоксигенацию (H/R) подачей cytometry. По сравнению с обычной группой, apoptotic человека культивировании составлял значительно выше в группе H/R, в то время как Tongxinluo вспять это изменение (*p < 0,05 против нормальный; p # < 0,05 против H/R; n = 3)11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Строб популяции клеток (P1, красный) в ССК против FSC точку участка для дальнейшего анализа. Целостность клеток населения оценивается с помощью стороны точечной (SSC) и вперед точечной (FSC). Клетки мусора (за воротами P1, черный), которые уменьшили свет рассеяния, исключаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Оценка митохондриальной мембраны потенциал человека культивировании. По сравнению с обычной группой, Группа H/R отображается соотношении значительно ниже красным/зеленым цветом, в то время как Tongxinluo вспять этой тенденции (красный: клетки с не флуоресценции; Синий, клетки с красной флуоресценцией; Фиолетовый, клетки с зеленой флуоресценцией. Отрицательный контроль, пустой и не пятнать; Положительный контроль, клетки лечат CCCP; p < 0,05 против нормального; #p < 0,05 против H/R; n = 3)11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем протокол, использующий JC-1 краска для оценки СПП клеток после подвергнуться Ч/р. обнаружено пробирного JC-1, ММП клеток зависит от таких факторов, как митохондриальных размер, форму и плотность, которые могут повлиять однокомпонентный флуоресценции сигналы14. Следовательно результаты анализа JC-1 относительно надежный. Кроме того это удобно и экономия времени для выполнения анализа JC-1. Этот assay имеет низкие требования для материалов и реагентов, и как правило, она занимает менее чем 1,5 h сделать окрашивание, от клеток отряд для измерения ММП.
Несколько важных шагов нельзя переоценить, если при выполнении анализа JC-1 исследователей хотят получить надежные и удовлетворительных результатов. Во-первых ячеек, загружаемых с JC-1 должны храниться в ледяной окрашивание буфера до тех пор, пока они собираются проточный цитометр. Температура имеет значительное влияние на стабильность системы СПП и значение одного образца колеблется много после короткого промежутка времени в комнатной температуре. Кроме того, предварительные эксперименты, рекомендуется определить pretreating времени и концентрации CCCP, обеспечивая красный/зеленый соотношение позитивных элемента управления ~ 0. Примечательно, что использованием phenylhydrazone 4-(trifluoromethoxy) цианида карбонильных (FCCP), который может также устранить ММП и подавляют окислительного фосфорилирования, является альтернативой CCCP и может также использоваться для настройки положительный контроль10.
Assay JC-1 имеет одним из основных ограничений в том, что другие флуорохромов нельзя сочетать с JC-1, для его флуоресценции выбросов охватывает зеленый, желтый и частью красный длинах волн спектра. Кроме того пробирного JC-1 должен быть объединен с один или несколько методов, например с помощью Флуорексон acetoxymethylester,1516 или даже генетические манипуляции17,18, чтобы определить, если открытие mPTP счетов снижение СПП. Это потому, что открытие других митохондриальной поры как АТФ чувствительных К+ каналов19,20 может также привести к деполяризации митохондрий.
Assay JC-1 является наилучшим образом подходит для более грубой «да/нет» оценок с целью оценки ли митохондрий в значительной степени поляризации (например, связанных с apoptosis эксперименты)8. Он также применяется для измерения ММП в различных типах клеток помимо кардиомиоцитов, включая нейроны21,22гепатоцитов, почечных клеток23 и даже изолированных митохондриях24. В целом мы описываем метод быстрый, простой и чувствительных для обнаружения ММП в МСБ после Ч/р.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано гранты национальных ключевых исследований и развития программа Китая (№ 2017YFC1700503), Национальная программа основных исследований (973 программа) Китая (No.2012CB518602), Национальный фонд Китая естественных наук (№ 81370223 и № 81573957) и аспирантов инновационный исследовательский фонд Peking союза медицинского колледжа (2016-1002-01-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J.
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
