Summary
Aqui, apresentamos um protocolo que usa JC-1 tintura para avaliar o potencial de membrana mitocondrial das células após serem expostos a hipóxia/reoxigenação com ou sem um agente protetor.
Abstract
Oportuna e eficiente de reperfusão da artéria coronária obstruída é a melhor estratégia para diminuir o tamanho do infarto do miocárdio em pacientes com um segmento ST elevado de infarto do miocárdio. No entanto, reperfusão por si pode resultar em mais casos de morte, um fenômeno conhecido como lesão de reperfusão. A abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), com a diminuição do potencial de membrana mitocondrial (MMP), ou despolarização mitocondrial, é universalmente reconhecida como a etapa final da lesão de reperfusão e é responsável por mitocondrial e casos de morte. JC-1 é um corante lipofílico catiônico que se acumula nas mitocôndrias, dependendo do valor da MMP. Quanto maior o MMP é, quanto mais JC-1 acumula-se nas mitocôndrias. As quantidades crescentes de JC-1 na mitocôndria podem ser refletidas por uma mudança de emissão de fluorescência do verde (~ 530 nm) ao vermelho (~ 590 nm). Portanto, a redução do rácio da intensidade de fluorescência vermelha/verde pode indicar a despolarização da mitocôndria. Aqui, levamos vantagem do JC-1 para medir MMP, ou a abertura do mPTP em miócitos humanos após hipóxia/reoxigenação, detectada por citometria de fluxo.
Introduction
Doença coronariana é a principal causa de morte no mundo. O tratamento de escolha para reduzir lesões isquêmicas e limitar o tamanho do infarto em pacientes com ST-segmento elevados do miocárdio é oportuna e eficaz de reperfusão miocárdica através de intervenção coronária percutânea primária (PCI)1, 2. No entanto, a reperfusão causa dano adicional, que pode representar até 30% do tamanho final de infarto3. É universalmente reconhecido que o poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) não é apenas central na morte de danos e célula mitocondrial durante a isquemia/reperfusão (eu / R), mas é também um destino convergente do cardioprotetores sinalização4 , 5. como a abertura do mPTP acarretaria a despolarização da membrana mitocondrial interna potencial (MMP)4, detectamos mPTP abertura usando o 5, 5, 6, 6 '-tetracloro-1, 1, 3, 3 '-tetraetil-imidacarbocyanineiodide (JC-1) do ensaio.
O ensaio de JC-1 é um método de cytofluorimetric que é tanto qualitativas como quantitativas, e foi validado mais analisando o MMP ao nível de uma única mitocôndria6. JC-1 existe como forma agregada, rendendo um vermelho a laranja colorida de emissão (590 ± 17.5 nm) na matriz da mitocôndria com MMP normal; com a perda de MMP, JC-1 é convertido para a forma monomérica que produz fluorescência verde com uma emissão de 530 nm ± 15. Portanto, uma diminuição do rácio de intensidade de fluorescência vermelha/verde pode indicar a redução de MMP em condições tais como isquemia/reperfusão (eu / R).
Além de JC-1, MMP também tem sido estudada com membrana permeável cações lipofílicas como Rodamina 123 e 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine iodeto [DiOC6(3)]. No entanto, em comparação com estas duas sondas, JC-1 é mais confiável para a análise de MMP. Rodamina 123 tem sensibilidade relativamente pobre (especialmente em têmpera de7,de modo8) e especificidade de pobre. A mudança de rodamina 123 às vezes é tão pequena que é difícil para os pesquisadores ou equipamento para observar/detectar. Além disso, em uma única célula, existem sites de ligação diferentes mitocôndria para Rodamina 123 e assim que ele pode ter fluorescência diferentes emissões9. DiOC6(3) não é recomendado para a detecção de MMP também como ele reage com sensibilidade para a despolarização da membrana plasmática10.
Portanto, aqui vamos usar o JC-1 ensaio para avaliar a MMP de HCMs após serem expostos a hipóxia/reoxigenação com ou sem um agente protetor.
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Protocol
1. preparação de reagentes e soluções
- Prepare meio completo humano miócitos (HCMs) adicionando-se 25 mL de mistura de suplemento miócito crescimento médio de 500 mL do meio de crescimento do miócito conforme as instruções do fabricante. Loja a 4 ° C e aquecer a 37 ° C antes de usar.
- Preparar a solução de Tongxinluo (TXL) pela dissolução TXL pó ultrafino em soro/glicose-livre de Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) e ajustar a concentração de TXL a 400 µ g/mL, adicionando DMEM (para mais detalhes, ver11). Loja a 4 ° C e aquecer a 37 ° C antes de usar.
- Prepare-se 5 mL da solução de trabalho de JC-1 adicionando 25 µ l de solução-mãe (200x) JC-1, 4 mL de água ultrapura e 1 mL de estoque coloração tampão (5x) em um tubo de centrífuga de 15 mL no escuro. Pipetar a mistura acima e para baixo várias vezes e aquecer até 37 ° C antes de usar.
- Prepare 30 mL de trabalhar buffer de coloração adicionando 24 mL de água ultrapura para 6 mL de estoque coloração buffer (5x) em um tubo de centrífuga de 50 mL. Use esta solução gelada.
2. estabelecimento de modelo de hipóxia/reoxigenação
- Placa de 1,0 x 105 células por poço com meio completo de HCM em um prato bem 6. Crescer para atingir uma confluência de cerca de 70% em uma incubadora de células contendo 5% de CO2 e 95% ar a 37 ° C.
- HCMs lavar com soro fisiológico de tampão fosfato (PBS). Expô-las a diferentes tratamentos (400 µ g/mL TXL ou não) em 2 mL de soro/glicose livre DMEM por 30 min antes de hipóxia em uma incubadora de células contendo 5% de CO2 e 95% ar a 37 ° C.
- Incube HCMs em um frasco hermético e hipóxico (2,5 L) equipados com um catalisador para eliminar o oxigênio livre e induzir a hipóxia por 18 h (figura 1A) e um indicador anaeróbio para medir a tensão de oxigênio no médio11,12, 13, em uma incubadora de células contendo 5% de CO2 e 95% ar a 37 ° C.
Nota: Demora cerca de 1,5 h para o catalisador eliminar oxigênio livre no frasco. Portanto, os HCMs são mantidos no frasco para 19,5 h antes que o frasco é aberto. A cor do indicador anaeróbica muda de luz azul no ambiente normoxic para branco pálido em condições de hipóxia (figura 1B). - Reoxygenate HCMs movendo a placa bem 6 para uma incubadora definir a 37 ° C, contendo 5% CO2 e 95% do ar por 2 h.
3. preparação de HCMs por citometria de fluxo
- Aquecer a solução de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético-tripsina 0,25% e PBS a 37 ° C.
- Médio de cada poço, Aspire, enxaguar as células com 1 mL de PBS e adicionar 0,5 mL de tripsina 0,25% ao longo da parede do poço.
- Incube a 37 ° C até HCMs todos são quase isoladas (cerca de 1 min).
- Adicione 1 mL de DMEM completo meio (meio DMEM com 10% de soro fetal bovino) nos poços para neutralizar a tripsina. Pelota HCMs por centrifugação a 500 x g, durante 3 min à temperatura ambiente e transfira a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Adicione 0,5 mL de meio completo HCM e 0,5 mL de solução de trabalho de JC-1 para cada tubo. Ressuspender os HCMs pipetando para cima e para baixo.
- Cobrir os tubos todo com papel de alumínio para evitar o branqueamento do indicador fluorescente e incubar HCMs em condições normais (a 37 ° C contendo 5% de CO2 e 95% ar) por 20 min.
- HCMs pelota por centrifugação a 500 x g, durante 3 min a 4 ° C.
- Enxágue HCMs duas vezes com 2 mL de tampão de coloração gelada JC-1.
- Resuspenda HCMs em um volume final de 300 µ l de tampão de coloração gelada no tubo de amostra (12 x 75 mm) e usar as células para análise dentro de 30 min.
Nota: Use Carbonilcianeto m-clorofenil-hidrazona (CCCP), um potente inibidor da cadeia respiratória de transporte de elétrons, para tratar HCMs por 1h em uma concentração de 20 µM, para o controlo positivo.
4. instalação de citômetro de fluxo
- Inicie o citômetro de fluxo e certifique-se de que o software é ligado a ela.
- Executar inicialização fluidics, iniciar o fluxo e configurar o breakoff.
- Abra duas janelas de trama do ponto do software de citometria de fluxo.
- Selecione Avançar espalhadas (FSC) no eixo X e luz lado espalhado (SSC) no eixo Y na primeira parcela ponto para representar as características das células em termos de seu tamanho e sua granularidade, respectivamente.
- Selecione o canal da deteção do PE (575 ± 26 nm) para o eixo Y e FITC (530 ± 30 nm) para o eixo X, usar uma escala logarítmica na trama do segunda ponto, que é usada para medir a intensidade de fluorescência do corante JC-1 nas células.
5. fluxo Cytometry medição e análise de dados
- Clique em descarregar para fora o tubo suporte braço e posicione-a em branco (HCMs que não foram tingidos com JC-1) amostra tubo nele. Clique em Load para retornar o braço de suporte do tubo, a sua posição de trabalho.
- Clique em registro para coletar partículas de suspensão no tubo de amostra em branco e então portão população celular (P1) para posterior análise na trama do primeira ponto (Figura 3).
- Coletar HCMs em outros tubos de amostra e otimizar a medição ajustando as tensões dos canais de fluorescência, para certificar-se que o ponto de célula está localizado na área central da trama do segunda ponto.
- Exibir as estatísticas de cada tubo de amostra e calcular as MMPs de cada amostra, dividindo-se a relação de intensidade de fluorescência vermelha por que da intensidade de fluorescência verde.
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Representative Results
Antes de realizar o ensaio de JC-1 para avaliar as alterações de MMP, é altamente recomendável que ser realizados experimentos confirmar as condições com êxito definido pelos pesquisadores. Como mostram os resultados de citometria de fluxo (Figura 2), em comparação com o grupo normal, hipóxia/reoxigenação (H/R) significativamente induziu a apoptose de HCMs (anexina V + /PI±), indicando que nós tinha estabelecido um modelo baseado em pilha de I / R (45.00 ± 2,13% vs. 11,50 ± 0,18% no grupo normal, p < 0,05). Tongxinluo, uma medicina tradicional chinesa com efeitos cardioprotetores, impediu a apoptose de HCMs na condição de H/R (24,50 ± 1,13% vs 45,00 ± 2,13% no grupo H/R, p < 0,05).
CCCP é um protonophore que pode inibir a fosforilação oxidativa em mitocôndrias por desatrelar o gradiente de prótons (perda de MMP) estabelecido durante a atividade normal de carreadoras de elétrons na cadeia de transporte de elétrons. Consequentemente, HCMs tratados com CCCP foi definida como controle positivo. Como mostrado na Figura 4, a proporção de vermelho/verde no grupo CCCP-tratados foi quase zero. Consistente com os resultados do ensaio de apoptose, o Grupo H/R-tratados exibido um rácio de vermelho/verde significativamente menor em comparação com o grupo normal (0,69 ± 0,07% vs. 5.64 ± 0,21 no grupo normal, p < 0,05) e Tongxinluo reverteu tal proporção de alterar (2,92 ± 0.22 vs 0,69 ± 0,07% no grupo H/R, p< 0,05).
Figura 1. Estabelecimento de modelo de hipóxia/reoxigenação (H/R). R. materiais necessários para estabelecer o modelo de H/R; B. confirmação do ambiente hipóxico na jarra. A cor do indicador anaeróbica muda de luz azul no ambiente normoxic para branco pálido em condições de hipóxia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Validação do estabelecimento do modelo de hipóxia/reoxigenação (H/R) por citometria de fluxo. Comparado com o grupo normal, a taxa de apoptose dos miócitos humanas foi significativamente maior no grupo H/R, enquanto Tongxinluo inverteu esta mudança (*p < 0.05 vs Normal; # p < 0.05 vs H/R; n = 3)11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Retenção de população celular (P1, vermelho) no SSC contra enredo de ponto FSC para uma análise mais aprofundada. A integridade da população celular é avaliada usando dispersão lateral (SSC) e dispersão para a frente (FSC). Espalhamento, excluem-se os restos de célula (fora do portão P1, preto), que reduziram a luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Avaliação de potencial em miócitos humanos de membrana mitocondrial. Comparado com o grupo normal, o Grupo H/R exibido uma proporção significativamente menor de vermelho/verde, enquanto Tongxinluo inverteu esta tendência (vermelho: células com nenhuma fluorescência; Azuis, células com fluorescência vermelha; Roxas, células com fluorescência verde. Negativo de controle, em branco e não mancha; Controlo positivo, as células tratadas com CCCP; p < 0.05 vs Normal; #p < 0.05 vs H/R; n = 3)11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, apresentamos um protocolo que utiliza o corante de JC-1 para avaliar a MMP das células após serem expostos a H/R. detectadas pelo ensaio de JC-1, o MMP de células independe de fatores como tamanho mitocondrial, forma e densidade que possam influenciar a fluorescência do único-componente sinais de14. Consequentemente, os resultados do ensaio de JC-1 são relativamente confiáveis. Além disso, é conveniente e economia de tempo para realizar o ensaio de JC-1. Este ensaio tem uma baixa exigência para materiais e reagentes, e geralmente, leva menos de 1,5 h para fazer a coloração, do destacamento de célula para medição de MMP.
A poucos passos de críticos não podem ser exagerados ao executar o ensaio de JC-1 se os investigadores querem obter resultados confiáveis e satisfatórios. Em primeiro lugar, as células carregadas com JC-1 devem ser armazenadas em buffer de coloração bem gelada, até que eles são recolhidos pelo citômetro de fluxo. Temperatura tem um efeito considerável sobre a estabilidade do MMP e o valor de uma amostra varia muito depois de um breve tempo na temperatura ambiente. Além disso, experimentos preliminares são recomendados para determinar o tempo de pretreating e concentração de CCCP, garantindo que a relação vermelho/verde do controlo positivo é ~ 0. Vale ressaltar que carbonila cianeto 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), que pode também eliminar MMP e inibir a fosforilação oxidativa, é uma alternativa ao CCCP e também pode ser usado para configurar o controle positivo10.
O ensaio de JC-1 tem uma grande limitação em que outros fluorochromes não podem ser combinados com JC-1, para a sua fluorescência emissão abrange o verde, amarelo e parte dos comprimentos de onda vermelhos do espectro. Além disso, JC-1 ensaio deve ser combinado com um ou mais métodos, como o uso de calceína-acetoxymethylester15,16 ou17,de manipulação genética até18, para determinar se a abertura do mPTP é responsável por a diminuição da MMP. Isso ocorre porque a abertura de outros poros mitocondriais, como os canais de K sensíveis ao ATP+ 19,20 também pode levar à despolarização da mitocôndria.
O ensaio de JC-1 é o mais adequado a mais grossa "Sim/não" avaliações com o objetivo de avaliar se as mitocôndrias são largamente polarizada (por exemplo, experimentos relacionados ao apoptosis)8. Isso também foi aplicado para medir MMP em uma variedade de tipos de células que não sejam cardiomyocytes, incluindo neurônios21, hepatócitos22, células renais23 e mitocôndrias isoladas até24. Em resumo, nós descrevemos um método rápido, simples e sensível para a detecção de MMP na HCMs depois H/R.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por concessões do nacional a chave de pesquisa e programa de desenvolvimento da China (n. º 2017YFC1700503), programa nacional de pesquisa básica (programa 973) da China (No.2012CB518602), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81370223 e n. º 81573957) e Fundação de pesquisas inovadoras dos pós-graduados a de Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
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