Summary
Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de Mitochondriale membraanpotentiaal van cellen na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.
Abstract
Tijdige en efficiënte reperfusie van de afgesloten kransslagader is de beste strategie voor het verkleinen van het myocard infarct bij patiënten met een ST-segment verheven myocardiaal infarct. Echter kan reperfusie per se resulteren in verdere cardiomyocyte dood, een fenomeen dat bekend staat als reperfusie letsel. De opening van de mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP), met een daling van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) of een mitochondriale depolarisatie, is algemeen erkend als de laatste stap van reperfusie letsel en is verantwoordelijk voor mitochondriale en dood van de cardiomyocyte. JC-1 is een lipofiele kationogene kleurstof dat zich in de mitochondriën afhankelijk van de waarde van MMP ophoopt. Hoe hoger de MMP is, hoe meer JC-1 hoopt zich op in de mitochondriën. De stijgende hoeveelheden voor JC-1 in de mitochondriën kunnen worden weergegeven door een verschuiving van de emissie fluorescentie van groen (~ 530 nm) tot rood (~ 590 nm). Dus, de vermindering van de fluorescentie van de rood/groen intensiteit verhouding kunt aangeven de depolarisatie van de mitochondriën. Hier, nemen wij voordeel van JC-1 voor het meten van MMP, of de opening van mPTP in menselijke cardiale myocytes na hypoxia/heroxygenatie, ontdekt door stroom cytometry.
Introduction
Coronaire hartziekte is de belangrijkste oorzaak van overlijden wereldwijd. De behandeling van keuze is voor vermindering van ischemische schade en de beperking van de grootte van het infarct in patiënten met ST-segment myocardiaal infarct verheven tijdige en effectieve myocardiale reperfusie via primaire percutane coronaire interventie (PCI)1, 2. Reperfusie veroorzaakt echter bijkomende schade, die kan goed zijn voor maximaal 30% van het laatste infarct grootte3. Het is algemeen erkend dat de mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP) niet alleen centraal in mitochondriale schade en cel dood tijdens ischemie/reperfusie is (Ik / R), maar is ook een convergerende doel van bescherming signalering4 , 5. als de mPTP-opening over depolarisatie van de innerlijke mitochondriale membraan potentiële (MMP)4 brengen zou, we ontdekt mPTP openen met behulp van de 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3 '-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) assay.
De bepaling van de JC-1 is een cytofluorimetric methode die zowel kwalitatief als kwantitatief, en het verder is gevalideerd door het analyseren van de MMP op het niveau van een enkele mitochondriën6. JC-1 bestaat als een geaggregeerde vorm, de opbrengst van een rood tot oranje gekleurde emissie (590 ± 17,5 nm) in de matrix van mitochondriën met normale MMP; met het verlies van MMP, wordt JC-1 geconverteerd naar de monomere vorm die groene fluorescentie met een uitstoot van 530 ± 15 nm levert. Dus een daling in de verhouding rood/groen fluorescentie intensiteit kan duiden op de verlaging van MMP in omstandigheden zoals ischemie/reperfusie (Ik / R).
Naast JC-1, is MMP ook bestudeerd met membraan-permeabele lipofiele kationen zoals Rhodamine 123 en 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine jodide [DiOC6(3)]. Echter, vergeleken met deze twee sondes, JC-1 is meer betrouwbaar voor het analyseren van MMP. Rhodamine 123 heeft relatief arme gevoeligheid (vooral in het blussen van mode7,8) en slechte specificiteit. De verschuiving in rhodamine 123 is soms zo klein dat het is moeilijk voor onderzoekers of apparatuur om te observeren/detecteren. Bovendien, in een enkele cel, er zijn verschillende mitochondrion bandplaatsen voor rhodamine 123 en dus dat het verschillende fluorescentie emissies9kan hebben. DiOC6(3) wordt niet aanbevolen voor het opsporen van MMP hetzij als het gevoelig op de depolarisatie van plasmamembraan10 reageert.
Daarom hier gebruiken we de JC-1-test om te beoordelen de MMP van HCMs na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van reagentia en oplossingen
- Bereiden menselijk cardiale myocytes (HCMs) volledige medium door 25 mL van Myocyte groeimedium supplement mix toe te voegen aan 500 mL Myocyte groeimedium volgens de instructies van de fabrikant. Bewaren bij 4 ° C en warm tot 37 ° C alvorens het te gebruiken.
- Bereid Tongxinluo (TXL)-oplossing door het oplossen van TXL ultrafijn poeder in/glucose serumvrij Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) en de concentratie van TXL tot 400 µg/mL aanpassen door het toevoegen van DMEM (voor meer details, Zie11). Bewaren bij 4 ° C en warm tot 37 ° C alvorens het te gebruiken.
- Bereiden 5 mL van de werkoplossing JC-1 door toevoeging van 25 µL van JC-1 stockoplossing (200 x), ultrazuiver water 4 mL en 1 mL voorraad kleuring buffer (5 x) in een centrifugebuis 15 mL in het donker. Pipetteer van het mengsel op en neer meerdere malen en warm tot 37 ° C alvorens het te gebruiken.
- 30 mL kleuring buffer te werken door 24 mL ultrazuiver water toe te voegen aan 6 mL voorraad kleuring buffer (5 x) in een centrifugebuis 50 mL voor te bereiden. Gebruik deze ijskoude oplossing.
2. deinvoeringvan Hypoxia/heroxygenatie Model
- Plaat 1.0 x 105 cellen per putje met HCM compleet medium in een 6 goed bord. Groeien tot een confluentie van ongeveer 70% in een incubator van de cel met 5% CO2 en 95% lucht bij 37 ° C.
- Wassen HCMs met fosfaat buffer zoutoplossing (PBS). Hen bloot te stellen aan verschillende behandelingen (400 µg/mL TXL of niet) in 2 mL zuiver/glucose serumvrij DMEM gedurende 30 minuten voorafgaand aan hypoxie in een incubator van de cel met 5% CO2 en 95% lucht bij 37 ° C.
- Incubeer HCMs in een luchtdicht en hypoxische pot (2,5 L) voorzien van een katalysator voor het opruimen van vrije zuurstof en induceren hypoxie voor 18u (figuur 1A), en een anaërobe indicator om te meten de zuurstof-spanning in de middelgrote11,-12, 13, in een cel incubator met 5% CO2 en 95% lucht bij 37 ° C.
Opmerking: Het duurt ongeveer 1,5 uur voor de katalysator voor het opruimen van vrije zuurstof in de pot. Daarom worden de HCMs bewaard in de pot voor 19.5 h voordat de pot wordt geopend. De kleur van anaërobe indicator verandert van lichtblauw in normoxic omgeving bleke wit in hypoxische voorwaarde (figuur 1B). - Reoxygenate HCMs door het bewegen van de 6 goed plaat in een incubator ingesteld bij 37 ° C met 5% CO2 en 95% lucht voor 2 h.
3. bereiding van HCMs Stroom Cytometry
- Warm de 0,25% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing en PBS tot 37 ° C.
- Gecombineerd medium uit elk putje, spoel de cellen met 1 mL PBS en Voeg 0,5 mL van 0,25% trypsine langs de muur van de waterput.
- Incubeer bij 37 ° C, totdat alle HCMs bijna vrijstaand (ongeveer 1 minuut zijn).
- Voeg 1 mL van DMEM compleet medium (DMEM gemiddeld met 10% foetale runderserum) om de putten te neutraliseren de trypsine. De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis 15 mL- and -pellet HCMs door centrifugatie bij 500 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Zorgvuldig gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren.
- Voeg 0,5 mL van HCM compleet medium en 0,5 mL van de werkoplossing JC-1 aan elke buis. Resuspendeer de HCMs door pipetteren omhoog en omlaag.
- Betrekking hebben op de hele buizen met aluminiumfolie om te voorkomen dat bleken van de TL-indicator en incubeer HCMs in normale omstandigheden (bij 37 ° C met 5% CO2 en 95% lucht) gedurende 20 min.
- Pellet HCMs door centrifugatie bij 500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Spoel HCMs tweemaal met 2 mL ijskoud JC-1 kleuring buffer.
- Resuspendeer HCMs in een eindvolume van 300 µL van ijskoude kleuring buffer in het monsterbuisje (12 mm x 75 mm) en de cellen gebruiken voor de analyse binnen 30 min.
Opmerking: Gebruik carbonyl cyanide m-chlorofenyl hydrazon (CCCP), een krachtige remmer van respiratoire elektronentransport keten, voor de behandeling van HCMs gedurende 1 uur bij een concentratie van 20 µM, voor de positieve controle.
4. flow Cytometer Setup
- Start de stroom cytometer en zorg ervoor dat de software is verbonden met het.
- Fluidics opstarten, start de stream en instellen van de breakoff.
- Geopende vensters door twee dot-perceel in de stroom cytometry software.
- Selecteer voorwaartse verstrooid licht (FSC) op de X-as en kant verstrooid licht (SSC) op de Y-as in de eerste stip plot te vertegenwoordigen de kenmerken van de cellen in termen van hun omvang en hun granulariteit, respectievelijk.
- Kies de PE (575 ± 26 nm) detectie zender voor de Y-as en de FITC (530 ± 30 nm) voor de X-as een logaritmische schaal met het tweede punt perceel, die wordt gebruikt voor het meten van de intensiteit van de fluorescentie van JC-1 kleurstof in de cellen.
5. Stroom Cytometry meting en analyse van gegevens
- Klik op Laden ongedaan maken om te laten uit de buis steun arm en plaats de lege (HCMs die niet hebben zijn geverfd met JC-1) buis op het monster. Klik op Load om terug te keren van de slingerarm buis naar de positie van haar werken.
- Klik op Record om de deeltjes van de suspensie in het lege monsterbuisje verzamelen en vervolgens de celpopulatie (P1) poort voor verdere analyse in de eerste stip plot (Figuur 3).
- HCMs in andere buizen monster te verzamelen en optimaliseren van de meting door de spanningen van fluorescentie kanalen, om ervoor te zorgen dat de cel stip is gelegen in het centrale gedeelte van de tweede tekening van de dot aan te passen.
- De statistieken van elk monsterbuisje weergeven en berekenen de MMP van elk monster door te delen van de verhouding tussen de intensiteit van de rode fluorescentie door groene fluorescentie intensiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voordat u de JC-1 bepaling ter evaluatie van de veranderingen van MMP uitvoert, is het sterk aanbevolen dat proeven worden verricht om te bevestigen met succes de voorwaarden vastgesteld door de onderzoekers. Zoals blijkt uit de stroom cytometry resultaten (Figuur 2), in vergelijking met de normale groep, hypoxie/heroxygenatie (H/R) aanzienlijk geïnduceerde de apoptosis van HCMs (Annexine V + /PI±), die aangeeft dat wij een cel-gebaseerde model van I had gevestigd / R (45.00 ± 2,13% vs. 11.50 ± 0,18% in de normale groep p < 0,05). Tongxinluo, een traditionele Chinese geneeskunde met cardioprotective effecten, voorkomen de apoptosis van HCMs in toestand van H/R (24.50 ± 1,13% vs. 45.00 ± 2,13% in de groep H/R p < 0,05).
CCCP is een protonophore die oxidatieve fosforylatie in de mitochondriën remmen kan door het afkoppelen van het proton verloop (verlies van MMP) opgericht tijdens de normale activiteit van elektron dragers in de keten van het elektronentransport. Bijgevolg was HCMs behandeld met CCCP ingesteld als positieve controle. Zoals blijkt uit Figuur 4, was de verhouding van de rood/groen in de CCCP-testgroep bijna nul. In overeenstemming met de resultaten van de bepaling van apoptosis, de H/R-testgroep weergegeven een aanzienlijk lagere rood/groen-ratio in vergelijking met de normale groep (0,69 ± 0,07 vs. 5.64 ± 0.21 in de normale groep p < 0,05) en Tongxinluo ongedaan gemaakt die een verhouding wijzigen (2.92 ± 0,22 vs. 0,69 ± 0,07 in de groep H/R p< 0,05).
Figuur 1. Oprichting van hypoxie/heroxygenatie (H/R) model. A. materialen die nodig zijn om de H/R-model; B. bevestiging van het hypoxische milieu in de pot. De kleur van anaërobe indicator verandert van lichtblauw in normoxic omgeving bleke wit in hypoxische voorwaarde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Validatie van de vestiging van hypoxie/heroxygenatie (H/R) model door stroom cytometry. In vergelijking met de normale groep, de apoptotic tarief van menselijke cardiale myocytes was significant hoger in de groep H/R terwijl Tongxinluo omgekeerd deze wijziging (*p < 0.05 vs. normale; # p < 0.05 vs. H/R; n = 3)11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Cel bevolking (P1, rood) in de WS versus FSC dot perceel voor verdere analyse gating. De integriteit van de celpopulatie wordt beoordeeld met behulp van kant scatter (SSC) en voorwaartse scatter (FSC). Cel puin (buiten de poort P1, zwart), wat tot minder licht verstrooiing, zijn uitgesloten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Evaluatie van de Mitochondriale membraanpotentiaal in menselijke cardiale myocytes. In vergelijking met de normale groep, de groep H/R weergegeven een aanzienlijk lagere ratio van de rood/groen, terwijl de Tongxinluo deze trend omgekeerd (Red: cellen met geen fluorescentie; Blauw, cellen met rode fluorescentie; Paarse, cellen met groene fluorescentie. Negatieve controle, leeg en geen vlekken; Positieve controle, cellen behandeld met CCCP; p < 0.05 vs. normaal; #p < 0.05 vs. H/R; n = 3)11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de MMP van cellen na wordt blootgesteld aan H/R. gedetecteerd door JC-1 test, de MMP van cellen is niet afhankelijk van factoren zoals de mitochondriale grootte, vorm en dichtheid die invloed op één-component fluorescentie hebben kan 14-signalen. Bijgevolg zijn de resultaten van JC-1 assay relatief betrouwbaar. Bovendien, het is handig en tijdbesparend voor het uitvoeren van de bepaling van de JC-1. Deze bepaling heeft een lage behoefte aan materialen en reagentia, en in het algemeen duurt minder dan 1,5 h te doen de kleuring, vanaf cel bij MMP meting worden gedetacheerd.
Een paar kritische stappen kunnen niet worden overschat, bij het uitvoeren van de bepaling van de JC-1 als onderzoekers willen verkrijgen van betrouwbare en bevredigende resultaten. Allereerst moeten de cellen geladen met JC-1 in ijskoude kleuring buffer worden opgeslagen totdat zij worden verzameld door de stroom cytometer. Temperatuur heeft een aanzienlijk effect op de stabiliteit van MMP en de waarde van één monster varieert alot na een korte tijd bij kamertemperatuur. Daarnaast voorbereidende experimenten worden aanbevolen om te bepalen van de pretreating tijd en concentratie van de CCCP, om ervoor te zorgen dat de verhouding van de rood/groen van de positieve controle ~ 0. Het is opmerkelijk dat carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), die kan ook elimineren MMP en remming van oxidatieve fosforylatie, is een alternatief voor CCCP en kan ook worden gebruikt voor het instellen van de positieve controle10.
De bepaling van de JC-1 heeft een belangrijke beperking in dat andere fluorochromes kunnen niet worden gecombineerd met JC-1, voor de fluorescentie emissie overspant de groen, geel en deel van de rode golflengten van het spectrum. Bovendien, moet JC-1 bepaling worden gecombineerd met één of meer methoden, zoals het gebruik van calceïne-acetoxymethylester15,16 of zelfs specifieke genmanipulatie17,18, om te bepalen of de opening van mPTP rekeningen voor de daling van MMP. Dit komt doordat de opening van andere mitochondriale poriën zoals de ATP-gevoelige K+ kanalen19,20 ook tot de depolarisatie van de mitochondriën leiden kan.
De bepaling van de JC-1 is zeer geschikt tot meer grof "Ja/nee" evaluaties met het doel van de te beoordelen mitochondriën zijn grotendeels gepolariseerde (bijvoorbeeld apoptosis-gerelateerde experimenten)8. Het is ook toegepast voor het meten van MMP in een verscheidenheid van celtypes dan cardiomyocytes, met inbegrip van neuronen21, hepatocyten22, nier cellen23 en zelfs geïsoleerde mitochondriën24. In samenvatting beschrijven we een snelle, eenvoudige en gevoelige methode voor de detectie van MMP in HCMs na H/R.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de nationale sleutel Research en Development programma van China (nr. 2017YFC1700503), de National Basic Research Program (973 programma) van China (No.2012CB518602), de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 81370223 en nr. 81573957), en de gediplomeerden innovatieve Research Foundation van Peking Unie Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J.
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
