Summary
Här presenterar vi ett protokoll som använder JC-1 färgämne för att utvärdera mitokondriella membranet potential celler efter att utsättas för hypoxi/reoxygenation med eller utan en skyddande agent.
Abstract
Snabbt och effektivt reperfusion av ockluderad kranskärl är den bästa strategin för att minska hjärtinfarkt storlek hos patienter med en ST-segmentet förhöjda hjärtinfarkt. Reperfusion i sig. dock kan leda till ytterligare hjärtmuskelcellen döden, ett fenomen som kallas reperfusionsskada. Öppnandet av mitokondriell permeabilitet övergången pore (mPTP), med minskning av den mitokondriella membranpotentialen (MMP) eller mitokondrie depolarisation, är allmänt erkänd som det sista steget av reperfusionsskada och ansvarar för mitokondriella och hjärtmuskelcellen död. JC-1 är en lipofila katjonaktiva färgen som ackumuleras i mitokondrier beroende på MMP värde. Ju högre MMP är, desto mer JC-1 ackumuleras i mitokondrierna. De ökande mängder JC-1 i mitokondrier kan reflekteras av en fluorescens utsläpp övergång från green (~ 530 nm) till rött (~ 590 nm). Därför, minskning av röd/grön fluorescens intensitet förhållandet kan indikera depolarisation av mitokondrier. Här, tar vi fördel av JC-1 att mäta MMP eller öppnandet av mPTP i mänskliga hjärt myocyter efter hypoxi/reoxygenation, upptäcks av flödescytometri.
Introduction
Kranskärlssjukdom är den ledande dödsorsaken i världen. Behandling av valet är för att minska ischemisk skada och begränsa infarct storlek hos patienter med ST-segmentet förhöjda hjärtinfarkt lägligt och effektivt myokardischemi reperfusion via primär perkutan koronar intervention (PCI)1, 2. Men orsakar reperfusion ytterligare skador, som kan stå för upp till 30 procent av det slutliga infarct storlek3. Det är allmänt erkänt att mitokondriell permeabilitet övergången pore (mPTP) inte är bara centrala i mitokondriell skada och cell död under ischemi/reperfusion (jag / R), men är också ett konvergerande mål av hjärtskyddande signalering4 , 5. som mPTP öppningen skulle medföra depolarisation av inre mitokondriella membranet potential (MMP)4, vi upptäckt mPTP öppning använder 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1′, 3, 3 '-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) analys.
JC-1 analysen är en cytofluorimetric metod som är både kvalitativa och kvantitativa, och den ytterligare har verifierats genom att analysera MMP i nivå med en enda mitokondrier6. JC-1 finns som aggregerad form, vilket ger en röd-orange färgade utsläpp (590 ± 17,5 nm) i matrisen av mitokondrier med normala MMP; med förlusten av MMP konverteras JC-1 till monomera form som ger grön fluorescens med utsläpp av 530 ± 15 nm. Därför en minskning i förhållandet röd/grön fluorescens intensitet kan tyda på en minskning av MMP i villkor såsom ischemi/reperfusion (jag / R).
Förutom JC-1, har MMP också undersökts med membran-permeable lipofila katjoner såsom rodamin 123 och 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine jodid [DiOC6(3)]. Men är jämfört med dessa två sonder, JC-1 mer tillförlitlig för att analysera MMP. Rodamin 123 har relativt dålig känslighet (speciellt i snabbkylning läge7,8) och dålig specificitet. Förskjutningen i rodamin 123 är ibland så liten att det är svårt för forskare eller utrustning att observera/upptäcka. Förutom, i en enda cell, det finns olika mitokondrien bindningsställen för rodamin 123 och så att det kan ha olika fluorescens utsläpp9. DiOC6(3) rekommenderas inte för att upptäcka MMP antingen som det reagerar känsligt på depolarisation av plasmamembranet10.
Därför, här använder vi JC-1 analysen för att bedöma de MMP av HCMs efter att utsättas för hypoxi/reoxygenation med eller utan en skyddande agent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av reagens och lösningar
- Förbereda mänskliga hjärt myocyter (HCMs) komplett medium genom att lägga till 25 mL myocyt odlingsmedium tillägg mix 500 mL myocyt odlingsmedium enligt tillverkarens instruktioner. Förvaras vid 4 ° C och varma till 37 ° C före användning.
- Förbereda Tongxinluo (TXL) lösning genom att lösa TXL ultrafina puder i serum/glukos-free Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) och justera koncentrationen av TXL till 400 µg/mL genom att lägga till DMEM (för mer detaljer, se11). Förvaras vid 4 ° C och varma till 37 ° C före användning.
- Förbereda 5 mL av JC-1 fungerande lösning genom att lägga till 25 µL av JC-1 stamlösning (200 x), 4 mL ultrarent vatten och 1 mL lager färgning buffert (5 x) i en 15 mL centrifugrör i mörkret. Pipettera blandningen upp och ner flera gånger och Värm till 37 ° C före användning.
- Förbereda 30 mL arbetar färgning buffert genom att lägga till 24 mL ultrarent vatten 6 mL lager färgning buffert (5 x) i en 50 mL centrifugrör. Använd denna lösning iskall.
2. inrättandet av hypoxi/Reoxygenation modell
- Plåt 1,0 x 105 celler per brunn med HCM komplett medium i en 6 väl platta. Växa till nå en konfluens ca 70% i en cell inkubator som innehåller 5% CO2 och 95% luft vid 37 ° C.
- Tvätta HCMs med fosfat buffert saltlösning (PBS). Utsätter dem för olika behandlingar (400 µg/mL TXL eller inte) i 2 mL/glukos serumfritt DMEM för 30 min innan hypoxi i en cell inkubator som innehåller 5% CO2 och 95% luft vid 37 ° C.
- Inkubera HCMs i en lufttät och hypoxisk burk (2,5 L) utrustade med en katalysator för att rensa fritt syre och inducera hypoxi för 18 h (figur 1A) och en anaerob indikator för att mäta syre spänningen i medelstora11,12, 13, i en cell inkubator som innehåller 5% CO2 och 95% luft vid 37 ° C.
Obs: Det tar ca 1,5 h för katalysatorn till rensa fritt syre i burken. Därför, HCMs förvaras i burken för 19,5 h innan burken öppnas. Färgen på anaerob indikatorn ändras från ljusblå i normoxic miljö till blek vit i hypoxisk skick (figur 1B). - Syresätta HCMs genom att flytta 6 väl plattan till en inkubator inställd vid 37 ° C som innehåller 5% CO2 och 95% luft i 2 h.
3. beredning av HCMs för flödescytometri
- Värma 0,25% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syra lösningen och PBS till 37 ° C.
- Aspirera medium från varje brunn, skölj cellerna med 1 mL PBS och tillsätt 0,5 mL av 0,25% trypsin längs väggen i brunnen.
- Inkubera vid 37 ° C tills alla HCMs är nästan fristående (ca 1 min).
- Tillsätt 1 mL DMEM komplett medium (DMEM medium med 10% fetalt bovint serum) till brunnarna att neutralisera trypsin. Överföra cellsuspensionen till en 15 mL centrifugrör och pellet HCMs genom centrifugering vid 500 x g i 3 min i rumstemperatur.
- Noggrant Aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
- Tillsätt 0,5 mL av HCM komplett medium och 0,5 mL av JC-1 fungerande lösning i varje rör. Återsuspendera HCMs av pipettering upp och ner.
- Täck hela rören med aluminiumfolie för att förhindra blekning av fluorescerande indikatorn och inkubera HCMs i normala förhållanden (vid 37 ° C som innehåller 5% CO2 och 95% luft) i 20 min.
- Pellet HCMs genom centrifugering vid 500 x g under 3 minuter vid 4 ° C.
- Skölj HCMs två gånger med 2 mL iskallt JC-1 färgning buffert.
- Återsuspendera HCMs i en slutlig volym av 300 µL av iskall färgning buffert i provet röret (12 x 75 mm) och använda cellerna för analys inom 30 min.
Obs: Använd karbonyl cyanid m-klorfenyl Hydrazon (CCCP), en potent hämmare av respiratorisk elektron transportkedjan, för att behandla HCMs för 1 h vid en koncentration på 20 µM, för den positiva kontrollen.
4. flödet Cytometer Setup
- Starta en flödescytometer och kontrollera att programvaran är ansluten till den.
- Utföra flödesteknik Start, starta strömmen och ställa in breakoff.
- Öppna två dot tomt fönster i programvaran flow flödescytometri.
- Välj framåt utspridda (FSC) på X-axeln och sida utspridda ljus (SSC) på Y-axeln i den första dot tomten motsvarar egenskaperna hos cellerna i form av deras storlek och deras granularitet, respektive.
- Välj PE (575 ± 26 nm) upptäckt kanal för Y-axeln och FITC (530 ± 30 nm) för X-axeln använder en logaritmisk skala i den andra dot tomten, som används för att mäta fluorescensintensiteten hos JC-1 färgämne i cellerna.
5. flöde flödescytometri mätning och analys av Data
- Klicka på inaktivera låta ut röret stöd arm och placera det tomt (HCMs som inte har varit färgat med JC-1) prova röret på det. Klicka på Load återgå tube stödarmen till sin arbetsposition.
- Klicka på posten för att samla in partiklar från suspension i tomma prov röret och sedan utfärda utegångsförbud för cell befolkningen (P1) för vidare analys i den första dot tomten (figur 3).
- Samla HCMs i andra provrör och optimera mätningen genom att justera spänningar av fluorescens kanaler, se till att den cell pricken ligger i den centrala delen av den andra dot-tomten.
- Visa statistiken för varje prov tub och beräkna MMP av varje prov genom att divideras med gröna fluorescensintensiteten förhållandet mellan röda fluorescensintensiteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan du utför JC-1 analysen för att utvärdera ändringarna av MMP, rekommenderas det starkt att försök utföras för att bekräfta villkoren framgångsrikt som forskarna. Som framgår av flöde flödescytometri resultaten (figur 2), jämfört med den normala gruppen, hypoxi/reoxygenation (H/R) betydligt inducerad apoptos i HCMs (Annexin V + /PI±), som anger att vi hade etablerat en cell-baserad modell av I / R (45.00 ± 2.13% vs. 11.50 ± 0,18% i normala gruppen p < 0,05). Tongxinluo, en kinesisk traditionell medicin med cardioprotective effekter, hindrade apoptos av HCMs i villkora av H/R (24,50 ± 1,13% vs. 45.00 ± 2.13% i gruppen H/R p < 0,05).
CCCP är en protonophore som kan hämma oxidativ fosforylering i mitokondrier av uncoupling proton övertoningen (förlust av MMP) fastställts under elektron bärare i elektron transportkedjan normala aktivitet. Följaktligen fastställdes HCMs behandlade med CCCP som positiv kontroll. Som visas i figur 4, var det röd-grön förhållandet i den CCCP-behandlade gruppen nästan noll. Överensstämmer med resultaten från apoptos-analysen, H/R-behandlade gruppen visas en betydligt lägre röd-gröna ratio jämfört med den normala gruppen (0.69 ± 0,07 vs. 5,64 ± 0,21 i normala gruppen p < 0,05) och Tongxinluo omvända sådan förhållandet ändra (2,92 ± 0,22 vs. 0.69 ± 0,07 i gruppen H/R p< 0,05).
Figur 1. Inrättandet av hypoxi/reoxygenation (H/R) modell. A. material behövs för att upprätta den H/R modellen. B. bekräftelse av hypoxisk miljön i burken. Färgen på anaerob indikatorn ändras från ljusblå i normoxic miljö till blek vit i hypoxisk skick. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Validering av etableringen av hypoxi/reoxygenation (H/R) modell av flödescytometri. Jämfört med den normala gruppen, apoptotiska mänskliga hjärt myocyter var signifikant högre i gruppen H/R medan Tongxinluo omvända denna förändring (*p < 0,05 vs Normal; # p < 0,05 vs. H/R; n = 3)11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Gating cell befolkningen (P1, röda) i vetenskapliga Styrkommitténs kontra FSC dot tomt för ytterligare analys. Integriteten i cell befolkningen bedöms med hjälp av side scatter (SSC) och framåt scatter (FSC). Cellfragment (utanför porten P1, svart), som har minskat ljus spridning, utesluts. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Utvärdering av mitokondriella membranpotential i mänskliga hjärt myocyter. Jämfört med den normala gruppen, gruppen H/R visas förhållandet betydligt lägre röd-gröna, medan Tongxinluo omvända denna trend (Red: celler med ingen fluorescens; Blå, celler med röd fluorescens; Lila, celler med grön fluorescens. Negativ kontroll, blank och ingen färgning; Positiv kontroll, celler behandlas med CCCP; p < 0,05 vs. normala; #p < 0,05 vs. H/R; n = 3)11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll som använder JC-1 färgämne för att bedöma MMP celler efter att utsättas för H/R. upptäcks av JC-1 assay, MMP av celler är oberoende av faktorer såsom mitokondriell storlek, form och densitet som kan påverka single-komponent fluorescens signaler14. Följaktligen är resultaten av JC-1 analysen relativt tillförlitliga. Dessutom är det praktiskt och tidsbesparande att utföra JC-1 analysen. Denna analys har låga krav på material och reagenser, och generellt tar det mindre än 1.5 h att göra färgningen, från cell utsända MMP mätning.
Några kritiska steg kan inte överskattas när du utför JC-1 analysen om forskare vill få tillförlitlig och tillfredsställande resultat. Först och främst ska celler laddad med JC-1 förvaras i iskall färgning buffert tills de samlas in av en flödescytometer. Temperaturen har en avsevärd effekt på stabiliteten i MMP och värdet av ett prov varierar mycket efter en kort tid i rumstemperatur. Dessutom preliminära experiment rekommenderas att fastställa pretreating tid och koncentration av CCCP, garanterar det röd-grön förhållandet av den positiva kontrollen ~ 0. Det är anmärkningsvärt att karbonyl cyanid 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), som kan också eliminera MMP och hämmar oxidativ fosforylering, är ett alternativ till CCCP och kan också användas för att ställa in den positiva kontroll10.
JC-1 analysen har en stor begränsning i att andra fluorokromer inte kan kombineras med JC-1, för dess fluorescens utsläpp spänner i grönt, gult och en del av det röda våglängder av spektrumet. Dessutom, måste JC-1 analys kombineras med en eller flera metoder, till exempel med hjälp av calcein-acetoxymethylester15,16 eller ens genmanipulation17,18, att avgöra om öppnandet av mPTP står för minskningen av MMP. Detta beror på att öppnandet av andra mitokondriella porer som ATP-känsliga K+ kanaler19,20 kan också leda till en depolarisation av mitokondrier.
JC-1 analysen är bäst lämpade för mer grova ”Ja/Nej” bedömningar i syfte att bedöma om mitokondrierna är i hög grad polariserad (t.ex. apoptos experiment)8. Det har också använts för att mäta MMP i en mängd olika celltyper än hjärtmuskelceller, inklusive nervceller21, hepatocyter22, nedsatt celler23 och även isolerade mitokondrier24. Sammanfattningsvis beskriver vi en snabb, enkel och känslig metod för detektion av MMP i HCMs efter H/R.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från den nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (nr. 2017YFC1700503), nationella grundläggande forskningsprogrammet (973 Program) Kina (No.2012CB518602), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (nr. 81370223 och nr 81573957), och de doktorander innovativa Research Foundation i Peking unionen Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J.
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
