Summary
Nous présentons ici un protocole qui utilise JC-1 colorant pour évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale des cellules après avoir été exposés à une hypoxie/réoxygénation avec ou sans agent de protection.
Abstract
Méthode rapide et efficace de reperfusion de l’artère coronaire obstruée, c’est la meilleure stratégie pour diminuer la taille de l’infarctus du myocarde chez les patients avec un segment ST élevée d’infarctus du myocarde. Toutefois, reperfusion en soi peut entraîner en outre du cardiomyocyte, un phénomène appelé lésion de reperfusion. L’ouverture de la pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP), avec la diminution du potentiel membranaire mitochondrial (MMP), ou la dépolarisation mitochondriale, est universellement reconnue comme la dernière étape de la lésion de reperfusion et est responsable mitochondriale et du cardiomyocyte. JC-1 est un colorant cationique lipophile qui s’accumule dans les mitochondries selon la valeur de MMP. Plus le PSM est, plus JC-1 s’accumule dans les mitochondries. Les quantités croissantes de JC-1 dans les mitochondries peuvent se traduire par un changement de d’émission de fluorescence du vert (~ 530 nm) au rouge (~ 590 nm). Par conséquent, la réduction du ratio d’intensité de la fluorescence rouge/vert peut indiquer la dépolarisation des mitochondries. Ici, nous prenons le parti de JC-1 pour mesurer les MMP, ou l’ouverture du mPTP dans les myocytes cardiaques humaines après l’hypoxie/réoxygénation, détectée par cytométrie en flux.
Introduction
Maladie coronarienne est la principale cause de décès dans le monde. Le traitement de choix pour réduire une lésion ischémique et de limiter la taille de l’infarctus chez les patients avec segment ST élevé l’infarctus du myocarde est une reperfusion myocardique en temps opportun et efficace via une intervention coronarienne percutanée primaire (PCI)1, 2. Toutefois, la reperfusion provoque des dégâts supplémentaires, ce qui peuvent représenter jusqu'à 30 pour cent de la taille finale infarctus3. Il est universellement reconnu que le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) n’est pas seulement central dans les mitochondries des dommages et la mort cellulaire durant l’ischémie/reperfusion (I / R), mais est aussi une cible convergente de cardioprotecteurs signalisation4 , 5. comme l’ouverture du mPTP entraînerait une dépolarisation de la membrane mitochondriale interne potentielle (MMP)4, nous avons détecté des PFMP ouverture utilisant le 5, 5′, 6, 6′-tétrachloro-1, 1′, 3, test de tétraéthyle-3′-imidacarbocyanineiodide (JC-1).
L’analyse de JC-1 est une méthode de cytofluorométrique qui est tant qualitatives que quantitatives, et elle a été validée plus loin en analysant les MMP au niveau d’une mitochondrie unique6. JC-1 existe sous une forme agrégée, ce qui donne un rouge aux émissions couleur orange (590 ± 17,5 nm) dans la matrice des mitochondries avec MMP normale ; avec la perte de MMP, JC-1 est converti en la forme monomère qui donne une fluorescence verte avec une émission de 530 nm ± 15. Par conséquent, une diminution du ratio d’intensité de fluorescence rouge/vert pourrait indiquer la réduction de MMP dans des conditions telles que l’ischémie/reperfusion (I / R).
En plus de JC-1, MMP a également été étudié avec membrane perméable cations lipophiles comme la Rhodamine 123 et 3, l’iodure de 3′-dihexyloxadicarbocyanine [DiOC6(3)]. Toutefois, par rapport à ces deux sondes, JC-1 est plus fiable pour l’analyse des MMP. La rhodamine 123 a une sensibilité relativement médiocre (surtout en trempe mode7,,8) et la spécificité médiocre. Le changement dans la rhodamine 123 est parfois si petit qu’il est difficile pour les chercheurs ou les équipements à observer/détecter. En outre, dans une seule cellule, il existe des sites de liaison différents mitochondrie pour la rhodamine 123 et donc qu’elle peut avoir différentes fluorescence émissions9. DiOC6(3) n’est pas recommandé pour la détection des MMP soit comme il réagit sensiblement à la dépolarisation de la membrane plasmique10.
Donc, ici, nous utilisons le test JC-1 pour évaluer la MMP de ces mesures après avoir été exposés à une hypoxie/réoxygénation avec ou sans agent de protection.
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Protocol
1. préparation des réactifs et des Solutions
- Préparer les myocytes cardiaques humaines (ces mesures) milieu complet en ajoutant 25 mL de mélange de supplément de milieu de culture des myocytes dans 500 mL de milieu de culture des myocytes selon les instructions du fabricant. Conserver à 4 ° C et chaud à 37 ° C avant d’utiliser.
- Préparer la Solution de Tongxinluo (TXL) en dissolvant la poudre ultrafine TXL en milieu sans sérum/glucose de Dulbecco aigle modifié (DMEM) et ajuster la concentration de TXL à 400 µg/mL en ajoutant DMEM (pour plus de détails, voir11). Conserver à 4 ° C et chaud à 37 ° C avant d’utiliser.
- Préparer 5 mL de solution de travail JC-1 en ajoutant 25 µL de la solution mère (200 x) JC-1, 4 mL d’eau ultrapure et 1 mL de stock tampon (5 x) une coloration dans un tube à centrifuger 15 mL dans l’obscurité. Pipeter le mélange monter et descendre plusieurs fois et chauffé à 37 ° C avant d’utiliser.
- Préparer 30 mL de tampon de coloration de travail en ajoutant 24 mL d’eau ultrapure à 6 mL de stock tampon (x 5) dans un tube à centrifuger 50 mL de coloration. Utilisez cette solution glacée.
2. création du modèle de l’hypoxie/réoxygénation
- Plaque de 1,0 x 105 cellules par puits avec milieu complet HCM dans une plaque 6 puits. Se développer pour atteindre une confluence d’environ 70 % dans un incubateur à cellules contenant 5 % CO2 et 95 % air à 37 ° C.
- Ces mesures se laver avec une solution saline de tampon phosphate (PBS). Les exposer aux différents traitements (400 µg/mL TXL ou non) dans 2 mL de sérum/sans glucose DMEM pendant 30 min avant l’hypoxie dans un incubateur à cellules contenant 5 % CO2 et 95 % air à 37 ° C.
- Incuber ces mesures dans un bocal hermétique et hypoxique (2,5 L) équipé d’un catalyseur pour piéger l’oxygène libre et entraîner une hypoxie pendant 18 h (Figure 1 a) et un indicateur anaérobie pour mesurer la tension en oxygène dans la moyenne de11,12, 13, dans un incubateur à cellules contenant 5 % CO2 et 95 % air à 37 ° C.
Remarque : Il faut environ 1,5 h pour le catalyseur piéger l’oxygène libre dans le bocal. Par conséquent, les HCMs sont conservés dans le bocal pour 19,5 h avant l’ouverture de la jarre. La couleur de l’indicateur anaérobie passe du bleu clair en environnement normoxique au blanc pâle en état hypoxique (Figure 1 b). - Reoxygenate ces mesures par le déplacement de la plaque 6 puits dans un incubateur à 37 ° C, contenant 5 % CO2 et 95 % air pendant 2 h.
3. la préparation de ces mesures pour la cytométrie en flux
- Réchauffer la solution d’acide (EDTA) 0,25 % trypsine-tétraacétique et PBS à 37 ° C.
- Aspirer la moyenne de chaque puits, rincer les cellules avec 1 mL de PBS et ajouter 0,5 mL de 0,25 % de trypsine le long de la paroi du puits.
- Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que toutes ces mesures sont presque détachés (environ 1 min).
- Ajouter 1 mL de milieu complet DMEM (milieu DMEM avec 10 % sérum de veau fœtal) dans les puits pour neutraliser la trypsine. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger 15 mL et ces mesures de granule par centrifugation à 500 g pendant 3 min à température ambiante.
- Soigneusement aspirer le surnageant sans déranger le culot.
- Ajouter 0,5 mL de milieu complet de HCM et 0,5 mL de solution de travail JC-1 dans chaque tube. Resuspendre les HCMs par pipetage de haut en bas.
- Couvrir les tubes ensemble avec du papier aluminium pour éviter le blanchiment de l’indicateur fluorescent et incuber ces mesures dans des conditions normales (à 37 ° C, contenant 5 % CO2 et 95 % d’air) pendant 20 min.
- Ces mesures de culot de centrifugation à 500 g pendant 3 min à 4 ° C.
- Rincer ces mesures deux fois avec 2 mL de glacee JC-1 tampon coloration.
- Remettre la suspension de ces mesures dans un volume final de 300 µL de tampon de coloration glacé dans le tube à essais (12 mm x 75 mm) et utilisent les cellules pour l’analyse dans les 30 minutes.
Remarque : Utilisez le carbonyl cyanide m-Chlorophényl hydrazone (CCCP), un puissant inhibiteur de la chaîne de transport d’électrons respiratoire, pour traiter de ces mesures pendant 1 h à une concentration de 20 µM, pour le contrôle positif.
4. installation de cytomètre en flux
- Commencer le cytomètre en flux et s’assurer que le logiciel est connecté.
- Exécutez fluidique démarrage, démarrer le flux de données et mettre en place le breakoff.
- Ouvrez deux fenêtres de parcelle de dot dans le logiciel de cytométrie de flux.
- Avant de sélectionner dispersés lumière (FSC) sur l’axe des X et lumière (SSC) dispersés sur l’axe des Y dans la première parcelle de dot pour représenter les caractéristiques des cellules en fonction de leur taille et leur granularité, respectivement.
- Sélectionnez le canal PE de détection (575 ± 26 nm) pour l’axe des Y et la FITC (530 ± 30 nm) pour l’axe X à l’aide d’une échelle logarithmique dans la deuxième parcelle de dot, qui sert à mesurer l’intensité de la fluorescence du colorant JC-1 dans les cellules.
5. écoulement Cytometry mesure et analyse des données
- Cliquez sur décharger pour laisser les bras de support sur le tube et positionner le vide (ces mesures qui n’ont pas été teints avec JC-1) échantillon tube là-dessus. Cliquez sur Load pour le bras de support de tube de retour à son poste de travail.
- Cliquez sur enregistrement pour recueillir des particules de suspension dans le tube à essais vide et puis porte la population de cellules (P1) pour une analyse ultérieure dans la première parcelle de dot (Figure 3).
- Ces mesures s’accumuler dans les autres tubes échantillon et optimiser la mesure en réglant les tensions des canaux fluorescence, pour s’assurer que le point de la cellule se trouve dans la zone centrale de la deuxième parcelle de dot.
- Afficher les statistiques de chaque tube d’échantillon et calculer les peines minimales obligatoires de chaque échantillon en divisant le ratio d’intensité de fluorescence rouge par celle de l’intensité de la fluorescence verte.
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Representative Results
Avant d’effectuer le test de JC-1 afin d’évaluer les changements de MMP, il est fortement recommandé que des expériences effectués pour confirmer les conditions correctement définie par les chercheurs. Comme le montrent les résultats de la cytométrie en flux (Figure 2), comparées au groupe normal, hypoxie/réoxygénation (H/R) induit significativement l’apoptose de ces mesures (annexine V + /PI±), indiquant que nous avions établi un modèle cellulaire d’I / R (± 45.00 2,13 % vs. 11.50 ± 0,18 % dans le groupe normal, p < 0,05). Tongxinluo, un remède traditionnel chinois avec effets cardioprotecteurs, empêché l’apoptose de ces mesures dans un état de H/R (24.50 ± 1,13 % vs ± 45,00 2,13 % dans le groupe H/R, p < 0,05).
CCCP est un protonophore qui peut inhiber la phosphorylation oxydative dans les mitochondries par découplage le gradient de proton (perte de MMP) mis en place au cours de l’activité normale des transporteurs d’électrons dans la chaîne de transport d’électrons. Par conséquent, ces mesures traitées par CCCP a été fixé comme contrôle positif. Comme illustré à la Figure 4, le ratio rouge/vert dans le groupe traité CCCP était presque nulle. Compatible avec les résultats de l’essai de l’apoptose, le groupe H/R-traité affiche un ratio rouge/vert significativement plus faible par rapport au groupe normal (0,69 ± 0,07 vs 5,64 ± 0,21 dans le groupe normal, p < 0,05) et Tongxinluo inversé un tel ratio changer (2,92 ± 0,22 0,69 ± 0,07 dans le groupe H/R, p< 0,05).
Figure 1. Mise en place du modèle de l’hypoxie/réoxygénation (H/R). A. les matériaux nécessaires pour établir le modèle H/R ; B. confirmation de l’environnement hypoxique dans le bocal. La couleur de l’indicateur anaérobie passe du bleu clair en environnement normoxique au blanc pâle en état hypoxique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Validation de la mise en place du modèle d’hypoxie/réoxygénation (H/R) par cytométrie. Comparativement au groupe normal, le taux d’apoptose des myocytes cardiaques humaines était significativement plus élevé dans le groupe H/R, tandis que Tongxinluo inversé ce changement (*p < 0,05 vs Normal ; # p < 0,05 vs H/R ; n = 3)11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Gating population cellulaire (P1, rouge) dans le SSC versus intrigue dot FSC pour une analyse plus approfondie. L’intégrité de la population cellulaire est évaluée au moyen de diffusion latérale (SSC) et forward scatter (FSC). Les débris de cellule (en dehors de la porte P1, noir), qui ont réduit à la lumière de diffusion, sont exclus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Évaluation du potentiel dans les myocytes cardiaques humaines de membrane mitochondrial. Comparativement au groupe normal, le groupe de H/R affiche un ratio rouge/vert significativement plus faible, tandis que Tongxinluo inversé cette tendance (rouge : cellules avec aucune fluorescence ; Bleus, cellules avec une fluorescence rouge ; "Purple", cellules avec une fluorescence verte. Négatif, contrôle, vide et sans coloration ; Contrôle positif, les cellules traitées avec le CCCP ; p < 0,05 vs normale ; #p < 0,05 vs H/R ; n = 3)11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, nous présentons un protocole qui utilise JC-1 colorant pour évaluer la MMP des cellules après avoir été exposés à H/R. détecté par JC-1 dosage, le PSM de cellules est indépendant des facteurs comme la taille mitochondriale, forme et densité qui peut-être influencer la fluorescence mono-composant signaux de14. Par conséquent, les résultats du test de JC-1 sont relativement fiables. En outre, il est pratique et gain de temps pour effectuer le test de JC-1. Ce test a une faible exigence pour matériels et réactifs, et généralement, cela prend moins de 1,5 h faire la coloration, du détachement de cellule de mesure de MMP.
Quelques étapes critiques n’insistera lors de l’exécution de l’essai de JC-1 si les chercheurs veulent obtenir des résultats fiables et satisfaisantes. Tout d’abord, les cellules chargées avec JC-1 doivent être stockés dans un tampon coloration glacé jusqu'à ce qu’ils sont collectés par le cytomètre en flux. La température a un effet considérable sur la stabilité des MMP et la valeur d’un seul échantillon varie beaucoup après une brève période à température ambiante. En outre, des expériences préliminaires sont recommandées pour déterminer le temps et la concentration du CCCP, PRETRAITEMENT veiller à ce que le ratio rouge/vert du contrôle positif est ~ 0. Il est à noter que carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phénylhydrazone (FCCP), qui peut également éliminer les MMP et inhibent la phosphorylation oxydative, est une alternative au CCCP et peut également servir à mettre en place le contrôle positif de10.
Le dosage de JC-1 a une limitation majeure à cet autres fluorochromes ne sont pas cumulables avec JC-1, de la fluorescence des émissions s’étend sur le vert, le jaune et la partie de la longueur d’onde rouge du spectre. En outre, JC-1 dosage doit être combiné avec une ou plusieurs méthodes, telles que l’utilisation de calcéine-acetoxymethylester15,16 ou manipulation génétique même17,18, afin de déterminer si l’ouverture du mPTP est responsable la diminution des MMP. C’est parce que l’ouverture des autres pores mitochondriales comme canaux sensibles à l’ATP K+ 19,20 peut aussi conduire à la dépolarisation des mitochondries.
L’essai de JC-1 est mieux adapté aux plus grossiers « oui/non » quotes-parts dans le but de déterminer si les mitochondries sont en grande partie polarisée (par exemple, les expériences liées à l’apoptose)8. Il a également été appliquée pour mesurer MMP dans une variété de types de cellules autres que les cardiomyocytes, y compris les neurones21, hépatocytes22, les cellules rénales23 et mitochondries isolées même24. En résumé, nous décrivons une méthode rapide, simple et sensible pour la détection de MMP dans ces mesures après H/R.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par des subventions de The National Key Research and Development Programme of China (no 2017YFC1700503), le Programme National de la recherche fondamentale (973 Program) de la Chine (No.2012CB518602), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81370223 et no 81573957) et novateurs Research Foundation du troisième cycle of Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
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